2.2. Optinen mikroskopia
2.2. Optinen mikroskopia
2.2. Optinen mikroskopia
Create successful ePaper yourself
Turn your PDF publications into a flip-book with our unique Google optimized e-Paper software.
<strong>2.2.</strong> <strong>Optinen</strong> <strong>mikroskopia</strong><br />
Lähdekirjallisuus:<br />
Flewitt and Wild: Physical Methods for Materials Characterization,<br />
Second edition, IOP publishing Ltd, 2003.
Historiaa<br />
Mikroskoopin keksimistä ei ole dokumentoitu kovin hyvin,<br />
joten on vaikea jäljittää optisen mikroskoopin varsinaista<br />
keksijää tai tarkkaa syntyajankohtaa. Ensimmäinen<br />
valokuva tunnistettavasta mikroskoopista on kuitenkin<br />
otettu 1625. 1600-luvulla komponenttimikroskoopit<br />
rakentuivat linssiyhdistelmästä, johon kuuluivat objektiivi ja<br />
okulaari. Tällaisia mikroskooppeja käyttivät monet, mutta<br />
kuvanlaatu oli kovin heikko.<br />
Toinen, samoihin aikoihin käytetty kuvantamisvaihtoehto oli<br />
"simplex-mikroskooppi", jossa oli yksi linssi kuten<br />
suurennuslaseissa. Tällaista instrumenttia käytti Anthonie<br />
van Leeuwenhoek noin vuonna 1700. Samaa suurennosta<br />
käyttäen simplexillä saatiin paljon tarkempi kuva kuin<br />
komponenttimikroskoopilla.<br />
Komponenttimikroskooppi<br />
(John Cuff in 1750)
Valon luonne
Mikroskooppi ja<br />
geometrinen optiikka<br />
Tärkeimmät mikroskoopin komponentit ovat<br />
objektiivit, okulaarit, kondensori, kollektorilinssi,<br />
välilinssit, polarisaattori ja analysaattori, sekä<br />
erityyppiset prismat.<br />
Valon kulkua tarkastellaan käyttämällä mallina<br />
yksittäisiä valonsäteitä.<br />
Valonsäteiden oletetaan kulkevan Huygensin<br />
periaatteen mukaan aaltorintaman normaalin<br />
suuntaisesti.<br />
Heijastumis- ja taittumislait (Snellin lait)<br />
Compound
Moderni mikroskooppi<br />
Illumination<br />
Condenser<br />
Objective<br />
Eyepiece
Erotuskyky<br />
Mikroskoopin kokonaissuurennos saadaan laskemalla objektiivin ja okulaarin suurennoksien tulo.<br />
Numeerinen apertuuri ilmoittaa avauskulman, jolla objektiivi pystyy kokoamaan valoa. Erotuskyky<br />
lisääntyy numeerisen apertuurin kasvaessa, koska tällöin kuvan muodostukseen osallistuvien<br />
säteiden määrä kasvaa.<br />
Erotuskyky (resolution) määrittää, miten lähekkäin olevat yksityiskohdat voidaan erottaa<br />
toisistaan.<br />
Kontrasti on yksitysikohtien tai yksityiskohdan ja taustan välinen kirkkausero.<br />
Diffraktio – erotusraja:<br />
C C<br />
<br />
sin NA<br />
C – vakio, tavallisesti 0.61 (koherenssi)<br />
– valon aallonpituus<br />
– linssin ja objektiivin välissä olevan aineen<br />
taitekerroin<br />
NA – numeerinen apertuuri
Airyn kiekot,<br />
säde:R=<br />
Rayleigh:n kiteeri<br />
kuvan erotuskyky: d=R<br />
Erotuskyvyn raja:<br />
400 nm<br />
NA 1.6<br />
150 nm<br />
Erotuskyky
Airy-kiekot:<br />
Erotuskyky<br />
Airy-diffraktiokuvion koko ja intensiteettijakauma riippuvat objektiivin ja kokoojalinssin<br />
numeerisesta apertuurista ja valon aallonpituudesta.
Erotuskyky<br />
Rayleighin kriteeri:<br />
Kaksi erillista pistettä voidaan juuri ja juuri erottaa toisistaan, kun niiden<br />
Airy-kiekkojen pienin etäisyys on sama kuin keskimmäisen kiekon säde.<br />
(sin = 1.22/D, jossa D on objektiivin läpimitta, erotuskyky ja <br />
aallonpituus)
Efektiivinen suurennus<br />
Efektiivinen suurennus =<br />
paljaan silmän erotuskyky<br />
mikroskoopin erotuskyky<br />
Paljaan silmän erotuskyky, eye 0.2 mm<br />
Efektiivinen suurennus M eff 0.2/0.00015 1300<br />
Kun käytetään paremman suurennuksen antavaa optiikkaa kuin efektiivinen<br />
suurennus, kuvasta saadaan suurempi, mutta uusia yksityiskohtia ei pystytä<br />
erottamaan.<br />
Kun käytetään CCD kameroita, täytyy laskuissa käyttää kameran erotuskykyä<br />
silmän erotuskyvyn sijasta.
Syvyysterävyys<br />
(Depth of field)<br />
Syvyysterävyys voidaan laskea kaavasta<br />
d1<br />
1.22<br />
h <br />
tan NAtan<br />
Hyvää syvyysterävyyttä ja hyvää erotuskykyä ei voida saavuttaa<br />
samanaikaisesti.
Syvyysterävyys<br />
(Depth of field)
Erotuskyky vs kontrasti
Palloaberraatio<br />
Kromaattinen aberraatio<br />
Astigmatismi<br />
Linssivirheet<br />
sin <br />
sin
Linssivirheet<br />
Lisätietoa optisesta aberraatiosta:<br />
http://micro.magnet.fsu.edu/primer/lightandcolor/lenseshome.html
Kohtisuora valaistus<br />
brightness of image<br />
Vinokenttävalaistus,<br />
vinoilluminointi
Läpinäkymätön Mo-pinta,<br />
heijastunut valo<br />
Läpinäkyvä näyte, sironnut valo<br />
dark-field<br />
illumination<br />
oblique<br />
illumination<br />
bright-field<br />
illumination<br />
Pimeäkenttävalaistus<br />
Läpinäkyvä näyte:
Kemiallinen syövytys poistaa matriaalia<br />
pinnalta eri tavoin riippuen pinnan<br />
orientaatiosta ja faasien koostumuksesta.<br />
Syövytyksen avulla saadaan näytteestä<br />
näkyviin uusia yksityiskohtia.<br />
Syövytys
Valoa läpäisemätön näyte<br />
Polarisoitu valo<br />
Optisella mikroskoopilla otettu kuva<br />
Cd pinnasta.<br />
Kuva on otettu käyttäen polarisoitua valoa.
Värit saadaan näkyviin vain tasopolarisoidun valon avulla.<br />
Värit muuttuvat valon aallonpituuden ja intensiteetin muuttuessa.<br />
Johtuu tiettyjen aallonpituuksien absorboitumisesta<br />
Pleokroismi: eri aallonpituudet absorboituvat eri tavoin eri<br />
kidesuunnissa. Tämä voidaan havaita kääntämällä näytettä.<br />
Läpinäkyvä näyte, läpivalaisu:<br />
hbl<br />
plag<br />
Polarisoitu valo<br />
näytteen kierto 90 astetta <br />
plag<br />
hbl
Unpolarized light<br />
1. polarizer<br />
Plane polarized<br />
light<br />
Ei näytettä: valo ei läpäise kahta polarisaattoria,<br />
joiden polarisaatiotasot ovat toisiinsa nähden 90<br />
asteen kulmassa<br />
ei kuvaa.<br />
Anisotrooppinen näyte: muuttaa valon<br />
polarisaatiotasoa, jolloin valo läpäisee toisen<br />
polarisaattorin. Efekti riippuu valon aallonpituudesta.<br />
muodostuu värikuva<br />
Polarisoitu valo<br />
läpinäkyvä näyte<br />
analyzer<br />
(2. polarizer)<br />
Polarization plane<br />
rotated by sample<br />
Image
Vaihekontrasti<strong>mikroskopia</strong><br />
Vaihekontrastimenetelmällä voidaan<br />
värjäämättömien biologisten näytteiden<br />
(vaiheobjektit) kontrastia parantaa ilman, että<br />
resoluutio heikkenee merkittävästi.<br />
Vaiheobjekteista taipuvat säteet kokevat ¼<br />
aallonpituuden vaihesiirron, mutta suoraan läpi<br />
menevät säteet säilyvät muuttumattomina.<br />
Vaihekontrastimenetelmässä suoraan<br />
meneville säteille aiheutetaan lisäksi -¼<br />
aallonpituuden vaihesiirros, jolloin kuvatasossa<br />
nähdään objektin yksityiskohdat tummina<br />
valaistua taustaa vasten.<br />
As light travels through a sample, interaction with this medium causes its amplitude and phase to change in a way<br />
which depends on properties of the medium. Changes in amplitude = absorption of light, which gives rise to colours<br />
when it is wavelength dependent. The changes in phase are not directly observed by human eye, yet often these<br />
changes in phase carry a large amount of information.<br />
The phase variations introduced by the sample are preserved by the optical microscope, this information is lost in<br />
the process which measures the light. In order to make phase variations observable, it is necessary to combine the<br />
light passing through the sample with a reference so that the resulting interference reveals the phase structure of the<br />
sample.<br />
In optical microscopy many objects such as cell parts in protozoans, bacteria and sperm tails are essentially fully<br />
transparent unless stained (and therefore killed). The difference in densities and composition within these objects<br />
however often give rise to changes in the phase of light passing through them, hence they are sometimes called<br />
"phase objects". Using the phase-contrast technique makes these structures visible and allows their study with the<br />
specimen still alive.
Change language