Ingeniería genética y los dilemas de la regulación - FBMC

Sistemas de transferencia genética en plantas Historia de modificaciones genéticas
Ingeniería genética y los dilemas de la
regulación
• Sólo las especies agropecuarias (y la humana) están reguladas (no lo
están las bacterias, levaduras y virus con fines industriales o
farmacéuticos y malezas -no muy dañinas- como Arabidopsis son
toleradas en su centro de origen: Europa) o Drosophila
8000 BC
mid-1700’s
Cultivo de tejidos (micropropagación)
Primer cruzamiento intergenérico fértil
1860’s
Primer planta transgénica
1920’s
1970’s
Primer cruzamiento interespecífico fértil
Mejoramiento intraespecífico por selección artificial
1940’s
1983
Mutagénesis
Darwin y Mendel nace la genética y el
mejoramiento basado en ciencia
Agalla de corona
1

Agrobacterium tumefaciens
Los genes de transformación están
filogenéticamente relacionados con
los de la conjugación
Ciclo infectivo de Agrobacterium tumefaciens
2

La región T está definida por repeticiones directas de 25 pb
importantes para el reconocimiento de las endonucleasas
VirD1/VirD2
La integración del ADN-T al genoma de la célula vegetal involucra el
apareamiento entre éste y el ADN cromosómico La capacidad
de Agrobacterium
tumefaciens
de introducir ADN
en el genoma
de la planta permitió
desarrollar vectores
plasmídicos basados
en el plásmido Ti
(1) y (3): cortes en las cadenas abiertas del ADN por endonucleasas de la planta. (2): digestión del extremo no apareado
del ADN-T por exo- o endonucleasas de la planta. (4) y (5): cortes en la cadena desapareada del ADN de la planta por
endonucleasas endógenas
Mecanismos moleculares implicados en la
transformación por Agrobacterium tumefaciens
Tomado de: Tzfira and Citovsky, Trends in Cell Biology, 2002.
3

Transformación de
cotiledones de soja
mediante cocultivo
con Agrobacterium
tumefaciens
A B C
D E F
G H I
Tomado de: Olhoft et al., Planta, 2003.
Distintas vías para regenerar una planta a partir de un explanto (transformado)
4

Transformación
de Arabidopsis thaliana por
infiltración floral con
Agrobacterium tumefaciens
Las plantas florecidas se sumergen
en un cultivo de
Agrobacterium tumefaciens. Luego
se recogen las semillas
y se germinan en un medio con
agente selector.
Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis
thaliana using the floral dip method
Xiuren Zhang, Rossana Henriques, Shih-Shun Lin, Qi-Wen
Niu and Nam-Hai Chua
Nature Protocols 1, 641 - 646 (2006)
Genes selectores para transformación de plantas
Gen de selección
nptII
Ble
dhfr
cat
aphIV
SPT
aacC3, aacC4
bar
EPSP
Producto genético
Neomicina fosfotransferasa
Resistencia a bleomicina
Dihidrofolato reductasa
Cloranfenicol acetil
transferasa
Higromicina fosfotransferasa
Estreptomicina
fosfotransferasa
Gentamicin-3-Nacetiltransferasa
Fosfinotricin acetil
transferasa
5-enolpiruvilshikimato-3fosfato
sintasa
Fuente
Tn5
Tn5 y Streptoalloteichus
hindustanus
Plásmido R67
Fago p1Cm
E. coli
Tn5
Serratia marcescens;
Klebsiella pneumoniae
Streptomices
hygroscopicus
Petunia hybrida
Selección
Kanamicina, G418,
paromomicina, neomicina
Bleomicina, fleomicina
Metotrexato
Cloranfenicol
Higromicina B
Estreptomicina
Gentamicina
Fosfinotricina, bialofos
Glifosato
Genes selectores para transformación de plantas
Gen selector
bxn
psbA
tfdA
DHPS
AK
sul
Csrl-l
tdc
manA
Producto genético
Bromoxinil nitrilasa
Proteína Q n
2,4-D monooxigenasa
Dihidroxipicolinato sintasa
Aspartato kinasa
Dihidropteroato sintasa
Acetolactato sintasa
Triptofano decarboxilasa
Manosa 6P-isomerasa
“Floral dip”:
agroinfiltración floral
Fuente
Klebsiella ozaenae
Amaranthus hybridus
Alcaligenes eutrophus
E. coli
E. coli
Plásmido R46
Arabidopsis thaliana
Catharanthus roseus
E. coli
Selección
Bromoxinil
Atrazina
Acido 2,4
diclorofenoxiacético
S-aminoetil L-cisteína
Alta concentración de
lisina y treonina
Sulfonamida
Herbicida sulfonilurea
4-metil triptofano
Manosa 6P
5

Genes reporteros usados en transformación de plantas
Genes reporteros
b-glucuronidasa
b-glucuronidasa
Proteína de fluorescencia
verde
Cloranfenicol
acetiltransferas a
Luciferasa
Luciferasa
Abreviatura
gus/uidA
GFP
Cat
Luc
luxA, luxB
Origen
E. coli
Aequorea victoria
E. Coli
Photinus pyralis
Vibrio harveyi
Bombardeo de micropartículas
Detección
Fluorométrico (cuantitativo)
o histoquímico ( in situ ),
no radiactivo
Fluorescencia,
no destructiva
Ensayo radiactivo
sensitivo, semi semicuantitativo cuantitativo
Luminiscencia
Luminiscencia
1984. Sandford et al., describen la técnica de bombardeo de
micropartículas para la transferencia directa de ADN
(Universidad de Cornell, EEUU).
Adaptado de: Morrish et
al.,Transgenic Plants. Fundamentals
and Applications, 1993.
Expresión tejidoespecífica
del gen uidA
en Arabidopsis thaliana
y Nicotiana tabacum
Diseño del primer
acelerador de
micropartículas
impulsadas por
explosión de pólvora
Expresión del gen uidA en flores y frutos de Arabidopsis thaliana
1 2 3 4
Flores Pecíolos Cortes histológicos de fruto
Expresión del gen uidA en raíces de Nicotiana tabacum
5 6 7
Bombardeo de micropartículas
1987 Klein et al. demuestran la utilidad
del método al observar expresión
transitoria en células epidérmicas de
Allium cepa usando un dispositivo de
impulsión a pólvora y micropartículas
de tungsteno recubiertas de ADN.
Microscopía de Normansky de células
epidérmicas de Allium cepa luego de un
bombardeo. Se observan 8 proyectiles
(flecha) en el interior de una célula viva.
Barra: 20 �m
Acelerador de micropartículas
ideado por Sandford et al.
(New York University, 1984)
Cortes histológicos de raíz
Tomado de: Karthikeyan et al., Plant Physiology, 2002.
6

• La aceleración de
las micropartículas
puede
generarse por:
- Explosión química de
pólvora seca
- Descarga de helio a
alta presión
- Descarga de aire,
CO 2 o N 2 comprimido
- Descarga eléctrica de
alto voltaje y baja
capacitancia
o bajo voltaje y alta
capacitancia
- Flujo de partículas o
flujo de helio a baja
presión por aspersión
- Flujo de helio con
cañón de precisión
La pistola
génica Helios �
permite la
transformación
de tejidos
in vivo
Cañón génico
comercial
(izquierda) y
detalles del
dispositivo de
impulsión de los
microproyectiles
(abajo)
Transformación genética de plantas in vivo usando
una pistola génica Helios �
Expresión transitoria del gen reportero uidA en
explantos bombardeados con micropartículas
Expresión transitoria en embriones inmaduros de centeno bombardeados con un cañón PDS 1000 He �
A B
Tomado de: http://webdoc.sub.gwdg.de/ebook/y/2002/pub/agrar/02H059/prom.pdf
C
usando diferentes concentraciones de micropartículas. A: 200 �g, B: 100 �g y C: 30 �g
Expresión transitoria en hojas de Arabidopsis bombardeadas con una pistola
Helios � Tomado de: Helenius et al., Plant Molecular Biology Reporter, 2000..
con y sin malla de difusión de micropartículas
7

Sistemas de
transferencia
directa
de ADN
Se obtiene
homoplastía por
sucesivas rondas
de regeneración
en medio de
selección
• Ventajas
• Desventajas
- Son considerados sistemas universales porque, al no
depender de organismos vectores, pueden aplicarse
a cualquier especie vegetal
- No requieren eliminar las células del organismo vector
de los tejidos o plantas transgénicas
- Requieren construcciones más simples y pequeñas
- Son apropiados para estudios de expresión transitoria
- Pueden resultar en un alto número de copias y/o copias
truncas del transgén y del vector en varios sitios del
genoma de las células transformadas
- Se caracterizan por la alta frecuencia de aparición de
re-arreglos en los transgenes
Tomado de: Bock, JMB, 2001.
El genoma
plastídico
se puede
transformar por
recombinación
homóloga
ADN pt
Gen A Gen B Gen C Gen D
Gen B aadA Gen C
Vector de transformación
ADN pt transformado
Gen A Gen B aadA Gen C Gen D
La homoplastía se obtiene por sucesivas rondas
de regeneración en medio de selección
Primera ronda de regeneración
Control de regeneración Control de selección Transformación
Segunda ronda de regeneración
Planta
transplastómica
8

Genes selectores usados en la transformación de plástidos
Gen
aadA (aminoglicósido 3´adeniltransferasa)
aphA-6 (aminoglicósidofosfotransferasa)
Npt-II (neomicina-fosfotransferasa)
Badh (betaína aldehido
deshidrogenasa)
Epsps (5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato
sintetasa)
Bar (fosfinotricina acetil transferasa)
Resistencia
Espectinomicina
Kanamicina
Kanamicina
Betaína aldehido
Glifosato
Glufosinato
Observaciones
Características comparadas de los sistemas
de transformación nuclear y plastídica
Número de copias
Niveles de expresión
Genes y expresión
Efectos de posición
Silenciamiento génico
Transferencia horizontal
Plegamiento y formación de
puentes disulfuro
Plastídico
~10.000/célula
Altos
Entre el 2-7% (hasta 47%)
Operones
Inserción en sitio conocido
elimina este problema
No se ha reportado
Herencia materna
Correcto
Es el más usado ya que con él se consiguen las
mejores eficiencias de selección. Existe la posibilidad
de aparición de resistencia por mutaciones puntuales
en el ARNm de 16S.
Eficiencia de transformación aproximada de 3 plantas
transplastómicas por disparo.
Permite obtener un buen número de plantas
transgénicas, aunque con menor eficiencia que aadA.
Eficiencia aproximada de transformación de 0,5
plantas transplastómicas por disparo.
La eficiencia de transformación obtenida es muy baja,
de aproximadamente 0,05 plantas transplastómicas
por disparo.
Tiene la ventaja de ser un gen de origen vegetal que
no tendría problemas de bioseguridad.
Su expresión en plástidos confiere resistencia al
herbiciba fosfinotricina cuando se introduce ligado a
aadA como selector. Hasta el momento no pudo
emplearse para selección directa de plantas
transplastómicas
Genomas
Nuclear
Pocas copias
Por lo general bajos
Entre 0,001-0,1%
Monocistrónicos
Inserción al azar (expresión
variable)
TGS y PTGS afectan
la expresión
Sí
Correcto (pasando
por retículo endoplasmático)
Aislamiento
y purificación de
protoplastos de
Nicotiana
tabacum
Adaptado de: Gomes Barros y Campos Carneiro. Manual de Transformación Genética de Plantas, 1998.
9

Electroporación de protoplastos
Pulsador de
electroporación
Flav® Sav® de Calgene
1994: RNA antisentido
Adaptado de Gomes Barros y Campos Carneiro. Manual de Transformación Genética de Plantas, 1998.
Cubetas de
electroporación
10

La soja transgénica... La Siembra Directa
Tolerancia a herbicida
(glifosato):
en de la enzima EPSPS de la bacteria
del suelo Agrobacterium tumefaciens
Beneficios: disminución de costos por
uso de glifosato, simplificación del
manejo, beneficio ambiental (siembra
directa)
11

Control del
barrenador del tallo
Maíz Bt
Maíz convencional
Resistencia a insectos:
gen de la proteína Bt de
la bacteria del suelo B.
thuringiensis
Beneficios: Disminución de costos, menor uso de
insecticidas, mayor rendimiento en presencia de la
plaga, niveles menores de micotoxinas.
12

Soja
Maíz
Algodón
Cultivos transgénicos en Argentina
Tolerancia a
herbicida
X
X
X
Resistencia a insectos
X
X
T. herbicida / R.
insectos
X
13

Papas transgénicas con resistencia al virus del enrollamiento de la hoja
Trabajo Dra. Cecilia Vázquez Rovere IB-INTA Castelar
Biología Molecular
No alcanza con saber poner un transgén en una planta o un animal, el mayor
valor está en el diseño y construcción de transgenes que sirvan para lo que
no se consigue por mejoramiento convencional
S4
S6
S7
Foto: La Nación
Transgenic maize with resistance to Mal de Río Cuarto Virus
14

Tierra NO infectada / Tierra Infectada
Claveles y rosas azules
Planta control sin
transformar
Planta
transgenica
Factor de transcripción regula
expresión de genes de
biosíntesis antocianas.
Duplicación de los sitios de
unión.
15

Pero ¿Qué hay de nuevo?, viejo…
Primera Generación: Caracteres productivos (disminuyen el riesgo de cosecha del
productor) � mejoramiento de la "commodity"
Resistencia a herbicidas
Resistencia a insectos
Resistencia a patógenos (virus, hongos, bacterias, etc.)
Utilización de la heterosis en autógamas
Resistencia a estreses abióticos (frío, salinidad, etc.)
Aumento de eficiencia fotosintética, de fijación de nitrógeno, etc.
Segunda Generación: Caracteres de Calidad y Nutracéuticos (de interés para el
consumidor, incluido el industrial) � alimento diferenciado
Retardo en la maduración de frutos
Modificación en composición de aceites, almidones, aminoácidos, etc.
Aumento del contenido de sólidos
Plásticos biodegradables
Producción de proteínas o metabolitos recombinantes (anticuerpos, enzimas, vacunas,
eliminación de alérgenos, etc.)
Tercera Generación: Bioremediación y cuidado del medio ambiente
Caracteres para agricultura conservacionista y sustentable
Plantas (y microorganismos) para decontaminación de suelos, absorción y metabolización de
productos tóxicos, rediseño de ecosistemas, etc.
Grains Of Hope (31 de julio 2000)
16

Mejor aprovechamiento de la biodiversidad (convencional) Mediante OGMs
Argumentos de por qué la alternativa biotecnológica
tiene sentido, complementando a la (lógica) propuesta
de diversificación alimentaria:
• La mayoría de los países en desarrollo carecen de
infraestructura y medios para suplementación y
fortificación alimentaria para los sectores sociales más
relegados
• Los programas de fortificación deben ser continuados y
largos (suele haber crisis presupuestarias que las
interrumpan)
• El mejoramiento de cultivos genéticamente modificados
para proveer una alimentación balanceada es más
sustentable ambientalmente que algunas fuentes
convencionales y de menor costo efectivo
17

Reducción de Fitatos
Funciones y beneficios para la salud de los PUFA Fuentes de PUFA: peces, algas, hongos, bacterias y
musgos, pero NO en los cultivos
18

Alternativa biotecnológica: LC-PUFA en cultivos
Antioxidantes: carotenos
y antocianas
Amflora (BASF)
Amilopectina: papel y
adhesivos
inhibición expresión de
amilosa sintasa
Expresión funcional de desaturasas de Euglena
gracilis en lino
Papa con cianoficina (poliaspartato) de cianobacterias
Universidad de Rostock
Papas GM para producir plásticos
19

Vacunas orales contra el
virus Newcasttle
Trabajo: Dra. Analía Berinstein y Elisa Carrillo (premio Renessen)
¿Será OGM?
Los virus de
aves son tema
de preocupación
para la opinión
pública
Cártamo
SemBioSys
20

Fármacos en plantas
Sobreexpresión de
arsenato redutasa (ArsC)
y glutamilcisteíin sintasa
(ECS)
21

Plantas cisgénicas e intragénicas
(¿OGMs no transgénicas?)
Manzanas
intragénicas que
florecen al año de
sembradas
Factor de transcripción regula
expresión de genes de
biosíntesis antocianas.
Duplicación de los sitios de
unión.
Plantas intragénicas:
Todas las secuencias introducidas pertenecen a la
misma especie pero “recombinadas” (promotor de un
gen y secuencia codificante de otro, cambiando el
nivel y especificidad de expresión)
Cisgénicas:
Los genes no se cambian (incluyen los intrones, por
ej.) y agilizan la introgresión.
Los casos más interesantes
de intragénicas son para
producir knock-out
funcional (silenciamiento)
de genes indeseables
http://www.isb.vt.edu/articles/dec0405.htm
http://www.nature.com/embor/journal/v7/n8/full/740
0769.html
22

Opciones
respecto a la
biotecnología
La experiencia de la CONABIA en materia de
Bioseguridad Agropecuaria
• En 1991 fue creada para asesorar al Secretario de
Agricultura en la formulación e implementación de
la regulación para la introducción y liberación al
ambiente de OGMs
http://www.sagpya.mecon.gov.ar/programas conabia
Mejoramiento nutricional
Resistencia a estreses (enfermedades)
Reducción en el uso de agroquímicos
Balance
http://www.minagri.gob.ar/SAGPyA/areas/biotecnologia/index.php
Riesgos:
ambientales
salud
Económicos
23

Exp.N
Institución
solicitante
1 6096/01 INTA
Comisión Nacional Asesora de Biotecnología Agropecuaria
Liberaciones al medio - Permisos otorgados durante el 2001
Modificación Genética Tipo de liberación
vacuna recombinante para herpesvirus
bovino (evento BHV-1gE-ßgal+1)
primer prueba en animales en cond. controladas
Institución solicitante Cultivo Modificación Genética Tipo de liberación
1 Monsanto Argentina S.A.I.C. Alfalfa
2 Dow AgroSciences Argentina S.A. Trigo
3 INTA Alfalfa
tolerante a glifosato (pMON 20998/PV-SCGT06 serie
J)
proteina para alto rendimiento (eventos con
Rev6/HS33, linea Hi)
expresando segmento de proteina VP1 del virus de la
fiebre aftosa fusionado con ß-glucuronidasa
a campo
a campo
a campo
4 Monsanto Argentina S.A.I.C. Maíz tolerancia a glifosato (evento NK603) laboratorio/invernáculo
5 INTA Alfalfa
8 Monsanto Argentina S.A.I.C. Maíz
1
5
1
6
1
7
expresando segmento de la proteina VP4 del
rotavirus C486 fusionada con ß-glucuronidasa
alto contenido de lisina y resistente a Lepidópteros
(Mon 810 x evento LY010-01 y otros)
laboratorio/invernáculo
a campo
Vector Argentina S.A. Tabaco bajo contenido de nicotina (evento No-Nic 41) a campo
Pioneer Argentina S.A. Maíz
INTA Alfalfa
resistente a Lepidópteros y tolerante a glufosinato de
amonio (eventos TC1507 y TC6228)
exp. constitutiva de secuencias codif. sentido y
antisentido de chalcona sintetasa (9 construc. con
CHS A y CHS2Alf)
a campo
laboratorio/invernáculo
1
9
2
4
2
7
2
8
2
9
3
0
3
1
3
2
3
7
5
5
5
6
5
7
5
8
5
9
6
0
Institución solicitante Cultivo Modificación Genética Tipo de liberación
Monsanto Argentina S.A.I.C. Soja
Dow AgroSciences Argentina
S.A.
Girasol
modificación en contenido de aminoácidos (evento
14269)
resistente a Lepidópteros (evento TF59, E3605.04.1.2 y
otros)
a campo
a campo y lab./inv.
Tecnoplant S.A Papa resistente a virosis (evento Sy 233) a campo
Tecnoplant S.A Papa resistente al virus PVY (56 eventos) a campo
INSIBIO - Univ.Nac.Tucuman Frutilla
con genes vegetales que codifican proteinas antifungicas
(eventos ArPfChi-Glu/1 y otros)
laboratorio/invernáculo
Tecnoplant S.A Papa tolerante a herbicida (13 eventos de transformación) a campo
Monsanto Argentina S.A.I.C. Maíz alto contenido de Lisina (evento LY 010-01 y otros) a campo
Monsanto Argentina S.A.I.C. Maíz
INTA Alfalfa
alto contenido de Lisina y resistencia a Lepidópteros (Mon
810 x evento LY010-01 y otros)
secuencias codificantes de glucanasa, quintinasa, AP24 y
defensina
a campo
laboratorio/invernáculo
Monsanto Argentina S.A.I.C. Soja modificación en el contenido de aceite (evento 13414) a campo
Syngenta Seeds S.A. Algodón resistente a Lepidópteros (eventos COT101 y COT102) a campo
INTA Alfalfa
INTA Alfalfa
INTA Trigo
IBR - Univ. Nac. de Rosario Tabaco
con expresión constitutiva de la secuencia codificante
para la proteina del virus de diarrea bovina (glicoproteina
E2 del BDV)
con expresión constitutiva de los genes P1, 2A y 3C, 3B,
fragmento de 2B y 3D
con expresión constitutiva de sec. codif. de glucanasa,
quitinasa, AP24 y defensina (construccion 35S-GLUCA y
otras)
resist a estres ambiental (2 eventos vehiculizados por
Pcambia 2200)
laboratorio/invernáculo
laboratorio/invernáculo
a campo
a campo
Solicitud para la concesión de permisos para Experimentación y/o Liberación al Medio de Organismos
Vegetales Genéticamente Modificados
A. RESUMEN
1. Entidad solicitante: Instituto de Biotecnología CICVyA, Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA)
2.-Organismo sujeto a control:
Nombre científico: Solanum tuberosum spp tuberosum
Nombre común: Papa
3. Característica/s introducida/s: Resistencia a virosis de la papa (PLRV).
4. Evento/s de transformación.
Nombre/s y/o número/s: 18 eventos de transformación. Los genes están vehiculizados por el vector pBI121.
Obtentores: Lic. Cecilia Vázquez Rovere y Dr. H. Esteban Hopp
5. Gen/es introducido/s. Secuencias nucleotídicas.
Secuencias principales: Secuencias codificantes, no codificantes y complementarias al marco abierto de
lectura 2b del PLRV postulado como codificante del segmento de la replicasa (RNA polimerasa dependiente
de RNA) conteniendo el dominio estructural de la actividad helicasa.
Gen/es o secuencia/s acompañante/s (marcadores, promotores, terminadores, intrones, otros): gen de la NPT
II (marcador de selección), promotor 35S, terminadores 3’ del gen nos y secuencias bordes del T-DNA de
Agrobacterium.
6. Tipo de permiso solicitado: Primera prueba a campo.
Cantidad de material transgénico (en unidades y/o kilogramos): 105 plantas
Superficie ocupada exclusivamente con el cultivo transgénico (no incluir borduras con material no transgénico):
El ensayo tendrá un total de 40 m2. de materiales transgénicos.
7- Autorización / autorizaciones previa/s.
NO HAY
24

Instancias de evaluación
• Ambiental: Evaluación de la liberación de los OGM en el
agroecosistema – Comisión Nacional Asesora en Biotecnología
Agropecuaria (CONABIA).
• Salud humana y animal: Evaluación de la inocuidad de los
alimentos derivados de los OGM – Comité ad hoc del Servicio
Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria (SENASA).
• Comercial: Análisis de
impacto potencial en los
mercados de exportación
Dirección Nacional de
Mercados.
25