Servicios microbiológicos especializados en la industria del vino
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<strong>Servicios</strong> <strong>microbiológicos</strong><br />
<strong>especializados</strong> <strong>en</strong> <strong>la</strong> <strong>industria</strong> <strong>del</strong><br />
<strong>vino</strong><br />
Laboratorio de Microbiología Enológica<br />
EEA M<strong>en</strong>doza - INTA
Equipo Microbiología Enológica<br />
Dra. Mariana Combina (Responsable)<br />
Dra. Laura Mercado<br />
Dr. Iván Ciklic<br />
Microbiol María El<strong>en</strong>a Sturm<br />
Microbiol. María Cecilia Rojo<br />
Brom. Pao<strong>la</strong> Falconi<br />
Tec. Enol. Vanesa García<br />
Lic. Brom. Adriana Soria<br />
OPORTUNIDADES
Clima<br />
Uva variedad<br />
Topografía<br />
Manejo viñedo<br />
VINO<br />
Suelo<br />
Tecnología de<br />
bodega<br />
Levaduras<br />
E<strong>la</strong>boración
ANTES<br />
Control<br />
Calidad<br />
Higi<strong>en</strong>e<br />
Tecnología<br />
AHORA
Transformación microbiológica<br />
Levaduras<br />
Bacterias lácticas<br />
microorganismo b<strong>en</strong>éfico microorganismo alterador
Estabilidad<br />
Química Microbiológica<br />
Análisis microbiológico<br />
Elevado etanol<br />
Bajo pH<br />
Pres<strong>en</strong>cia de SO 2<br />
Escasa fu<strong>en</strong>te de carbono
Grupos microbianos más importantes botel<strong>la</strong><br />
Bacterias mesófi<strong>la</strong>s aerobias<br />
Hongos y levaduras<br />
Bacterias lácticas<br />
Bacterias acéticas
Levaduras: distintas especies importancia<br />
de algunas no-Saccharomyces<br />
Bacterias: elección de medios<br />
Métodos específicos para <strong>vino</strong>s<br />
Interpretación <strong>del</strong> resultado
Velo<br />
Apicu<strong>la</strong>das<br />
Levaduras<br />
Oxidativas<br />
Referm<strong>en</strong>taciones<br />
Reduc<strong>en</strong> el etanol, acético, oxidaciones<br />
Acetato de etilo, pérdidas de aromas<br />
Pichia membranifaci<strong>en</strong>s, Candida vini<br />
Candida krusei<br />
Acido acético, acetato de etilo, acetaldehido<br />
Kloeckera apicu<strong>la</strong>ta (maceraciones frío)<br />
Saccharomyces cerevisiae (Gas, turbidez)<br />
Zygosaccharomyces bailli (Gas, turbidez)<br />
Schizosaccharomyces spp (sedim<strong>en</strong>to botel<strong>la</strong>)<br />
Saccharomycodes spp (flóculos, turbidez, gas)
Piridinas<br />
aa lisina y<br />
ornitina)<br />
Olor Ratón<br />
reptrogusto<br />
Ferm<strong>en</strong>tación láctica<br />
Fructosa<br />
Ferm<strong>en</strong>tación manítica<br />
(agridulce)<br />
Bacterias lácticas<br />
glicerol<br />
acroleína<br />
Amargo +<br />
f<strong>en</strong>oles<br />
Picado láctico<br />
BAL<br />
homo hetero<br />
Ac.láctico láctico, acético<br />
glicerol, etanol<br />
diacetilo<br />
Polisacáridos<br />
extracelu<strong>la</strong>res<br />
Aceite<br />
Lactobacillus spp<br />
O<strong>en</strong>ococcus o<strong>en</strong>i<br />
Pediococcus spp<br />
Acidez volátil<br />
Gas<br />
Turbidez
Gluconobacter<br />
Acetobacter<br />
Bacterias acéticas<br />
Metabolismo oxidativo <strong>del</strong> etanol (acético, éster de<br />
acetato y acetaldehído – acetoína por oxidación de<br />
láctico)<br />
Oxíg<strong>en</strong>o prev<strong>en</strong>ción embotel<strong>la</strong>do<br />
ferm<strong>en</strong>taciones det<strong>en</strong>idas<br />
Higi<strong>en</strong>e Barricas mermas<br />
Corchos defectuosos
Control de Brettanomyces
Medicinal<br />
C<strong>la</strong>vel<br />
C<strong>la</strong>vo de olor<br />
Estables<br />
Uva<br />
Cepajes<br />
Madurez<br />
Sol<br />
Lugar-año<br />
Maceración<br />
Vinos<br />
Conservación
FA-FML<br />
Conservación<br />
Brettanomyces<br />
No compite con Saccharomyces<br />
Inicios de ferm<strong>en</strong>tación l<strong>en</strong>tos (acético)<br />
Finales l<strong>en</strong>tos aireación<br />
Espera de FML retardada (bajo S0 2, alta T°C)<br />
Barricas contaminadas<br />
Oxíg<strong>en</strong>o –Micro-oxig<strong>en</strong>ación<br />
Barrica de 225 L absorbe 5-6 L de <strong>vino</strong>
Brett Normal � 1-10 cel/mL Monitorear<br />
Vino<br />
Defecto<br />
VBNC<br />
Aum<strong>en</strong>to � 10 2 -10 3 cel/ml A<strong>la</strong>rma<br />
Cepa de levadura<br />
sustrato<br />
Oxíg<strong>en</strong>o-autólisis<br />
FOH l<strong>en</strong>ta<br />
Vino seguro
Calidad de Levaduras Secas Activas<br />
Los límites <strong>microbiológicos</strong> tolerados para LSA son:<br />
Hongos fi<strong>la</strong>m<strong>en</strong>tosos
Glicerol<br />
Acido acético<br />
Toxina killer<br />
Caracterización <strong>en</strong>ológica de levaduras<br />
Etanol<br />
Saccharomyces cerevisiae<br />
Ésteres<br />
Aromas<br />
Enzimas
Paramétros tecnológicos<br />
•Velocidad, pureza y poder ferm<strong>en</strong>tativo (parámetros medibles)<br />
•Capacidad para ferm<strong>en</strong>tar <strong>en</strong> altas conc<strong>en</strong>traciones de azúcares<br />
•Resist<strong>en</strong>cia al SO 2 y etanol<br />
•Tolerancia a bajas temperaturas<br />
•Baja producción de espuma<br />
•Carácter killer<br />
Parámetros de calidad<br />
• Baja producción de acidez volátil<br />
• Baja producción de SH 2<br />
• Bajos requerimi<strong>en</strong>tos de nitróg<strong>en</strong>o<br />
• Actividad � glicosidadas y esterasa
Pérdida de peso (g)<br />
65<br />
60<br />
55<br />
50<br />
45<br />
40<br />
35<br />
30<br />
25<br />
20<br />
15<br />
10<br />
5<br />
0<br />
Caracterización <strong>en</strong>ológica<br />
0 5 10 15 20 25 30 35<br />
Tiempo (días)<br />
Ma S - 1C Ma B-2C<br />
ULA-16 INTA Mza<br />
VL3
PARAMETROS MEDIBLES<br />
Velocidad de ferm<strong>en</strong>tación: calcu<strong>la</strong>da como <strong>la</strong> cantidad de CO 2 producida<br />
después de 3 días de ferm<strong>en</strong>tación (CO 2/d). Se consideraran tres días<br />
durante <strong>la</strong> fase expon<strong>en</strong>cial.<br />
Efici<strong>en</strong>cia de ferm<strong>en</strong>tación o r<strong>en</strong>dimi<strong>en</strong>to: calcu<strong>la</strong>da como los gramos de<br />
azúcar necesarios para producir 1 grado alcohólico<br />
Pureza ferm<strong>en</strong>tativa: indica <strong>la</strong> cantidad de acidez volátil producida <strong>en</strong><br />
re<strong>la</strong>ción al etanol producido (g AV/L%de etanol v/v)<br />
Vigor ferm<strong>en</strong>tativo: <strong>la</strong> máxima cantidad de etanol producido <strong>en</strong> condiciones<br />
de exceso de azucares (300mg/L)
-<br />
Producción de SH 2<br />
+/- ++<br />
+ ++<br />
+++
Carácter killer
Taxonomía clásica<br />
Perfil metabólico<br />
Caracterización de <strong>la</strong> levadura<br />
Donde crece?<br />
A exp<strong>en</strong>sas de que?<br />
NTS<br />
Id<strong>en</strong>tificación de levaduras<br />
5.8S<br />
18S 26S<br />
ITS1 ITS2<br />
Taxonomía molecu<strong>la</strong>r<br />
RFLP 5.8S-ITS<br />
Secu<strong>en</strong>ciación de g<strong>en</strong><br />
ribosomal 26S<br />
ETS ETS NTS
1500 pb<br />
800 pb<br />
600 pb<br />
500 pb<br />
400 pb<br />
300 pb<br />
200 pb<br />
100 pb<br />
M S38 S40 S41 S42 S43 S44 S45<br />
RFPL 5.8S-ITS<br />
2072 pb<br />
800 pb<br />
600 pb<br />
500 pb<br />
400 pb<br />
300 pb<br />
200 pb<br />
100 pb<br />
M I II III I II III M I II III I II III I II III I II III<br />
Código Especies Ap (pb)a Longitud de los Fragm<strong>en</strong>tos luego<br />
5.8- ITS de <strong>la</strong> Restricción con:<br />
S38 S40 S41 S42 S43 S44<br />
Hae III Hpa II ScrF I<br />
S38 Saccharomyces cerevisiae 850 325+230+170+ 125 725+125 400+320+120<br />
S40 Saccharomyces cerevisiae 850 325+230+170+ 125 725+125 400+320+120<br />
S41 Saccharomyces cerevisiae 850 325+230+170+ 125 725+125 400+320+120<br />
S42 Saccharomyces cerevisiae 850 325+230+170+ 125 725+125 400+320+120<br />
S43 Saccharomyces cerevisiae 850 325+230+170+ 125 725+125 400+320+120<br />
S44 Saccharomyces cerevisiae 850 325+230+170+ 125 725+125 400+320+120<br />
S45 Saccharomyces cerevisiae 850 325+230+170+ 125 725+125 400+320+120
Secu<strong>en</strong>ciación<br />
Amplificación <strong>del</strong> 26S<br />
Comparación de secu<strong>en</strong>cia con base de datos (BLAST)
S. cerevisiae: Difer<strong>en</strong>ciación a nivel de cepa<br />
Control LSA<br />
Procesos de selección (cepas duplicadas)<br />
Orig<strong>en</strong> de cepa<br />
Control de imp<strong>la</strong>ntación<br />
Otros…
Amplificación de Secu<strong>en</strong>cias inter<strong>del</strong>ta<br />
Sec <strong>del</strong>ta: 100 copias – nº y localización variabilidad<br />
ADN total<br />
PCR<br />
Primers <strong>del</strong>ta<br />
Ferm<strong>en</strong>tación 1 Ferm<strong>en</strong>tación 2<br />
i<br />
Electroforesis<br />
gel agarosa
Análisis de restricción <strong>del</strong> ADNmitocondrial<br />
ADN mit molec 65-80 kb muy polimórfica<br />
Técnica simple, rápida<br />
ADN total<br />
Digestión<br />
<strong>en</strong>zimas de<br />
restricción<br />
Electroforesis<br />
gel agarosa
Control de imp<strong>la</strong>ntación de microvinificaciones
Citometría de flujo<br />
VBNC<br />
Ferm<strong>en</strong>taciones<br />
det<strong>en</strong>idas<br />
Futuro<br />
PCR tiempo real<br />
VBNC<br />
Reducción tiempos
Conocer<br />
Contro<strong>la</strong>r<br />
Prev<strong>en</strong>ir
Muchas gracias!!!<br />
mcombina@m<strong>en</strong>doza.inta.gov.ar
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