Guion de practicas Biología _603ae66925971ba6d924edb05d64a53d

Grado en Química
Facultad de Ciencias y Tecnologías Químicas
CURSO: PRIMERO
ASIGNATURA: BIOLOGÍA
AUTORES: NILDA GALLARDO, DAVID LEÓN,
(DEPARTAMENTO DE QUÍMICA INORGÁNICA, ORGÁNICA
Y BIOQUÍMICA)
Actividades Prácticas del Grado en Química
BIOLOGÍA

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NORMAS GENERALES
1.- Antes de empezar a hacer la práctica ES MUY IMPORTANTE
leerla bien.
2.- Consultar al profesor cualquier duda o incidente.
3.- Los aparatos son delicados: es importante saber utilizarlos; si
alguien no sabe, DEBE preguntar.
4.- No fumar, comer ni beber en el laboratorio.
5.- No pipetear reactivos o productos fuertemente ácidos, básicos o
tóxicos con la boca.
6.- No calentar productos inflamables.
7.- Cerrar todos los grifos, mecheros y llaves generales de gas.
8.- Mantener limpios los aparatos de uso general.
9.- Limpiar el material usado diariamente.
10.- Enjuagar con abundante agua el contacto con cualquier producto
ácido, básico o tóxico. Avisar inmediatamente al profesor.
NORMAS COVID:
1.- Ponerse guantes al entrar al laboratorio.
2.- Lavarse los guantes con gel hidroalcohólico.
3.- A intervalos regulares nos limpiaremos los guantes con el frasco de
alcohol ubicado en nuestro puesto sin necesidad de desplazarnos de nuestro
sitio.
4.- Al finalizar la práctica el material desechable será eliminado siguiendo
las instrucciones del profesor. El material no desechable será desinfectado
cuidadosamente con papel secamanos mojado en alcohol 80%.
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5.- Al finalizar la práctica los guantes se desecharán en la papelera de
residuos con pedal situada en el puesto de desinfección en la entrada al
edificio. A continuación, se lavaran las manos con gel.
GRACIAS POR COLABORAR
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PRÁCTICAS A REALIZAR
PRÁCTICA 1.- Iniciación al laboratorio de Biología Celular y
Molecular. Duración estimada: 2 horas.
PRÁCTICA 2.- La célula: manejo del microscopio óptico convencional.
Observación de preparaciones microscópicas. Duración estimada: 2
horas.
PRÁCTICA 3.- Detección de macromoléculas. Reacciones de
identificación de carbohidratos, lípidos y proteínas. Duración
estimada: 4 horas.
PRÁCTICA 4.- Fraccionamiento celular: aislamiento de cloroplastos.
Observación de la actividad fotosintética. Duración estimada: 4 horas.
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PRÁCTICA 1. INICIACIÓN AL LABORATORIO DE BIOLOGÍA
CELULAR Y MOLECULAR.
Profesor responsable: Dra. Nilda Gallardo Alpízar.
1. OBJETIVOS:
Se pretende que el alumno se familiarice con instrumentos y técnicas habituales en los
laboratorios de Biología Molecular. La práctica se iniciará mostrando material habitual
en los laboratorios como probetas, vasos de precipitados, pipetas Pasteur, etc. A
continuación, se enseñará a los estudiantes como deben usar correctamente las
micropipetas. Estos instrumentos de precisión son las herramientas más empleadas en
los laboratorios de Biología Molecular. Un buen uso de ellas es fundamental para
obtener resultados precisos. En la última parte de la práctica se enseñará como realizar
los cálculos para preparar disoluciones habituales en los laboratorios de Bioquímica y
Biología Molecular. Estas disoluciones se caracterizan por realizarse en el rango
milimolar-micromolar y, muy a menudo, requerir volúmenes muy reducidos (mililitrosmicrolitros).
2. Material de laboratorio.
Observa el material que te muestra el profesor, dibújalo y anota la función que
desempeñan en el laboratorio.
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3. Manejo correcto de las micropipetas.
Las micropipetas son herramienta de precisión muy caras que nos permiten aspirar
volúmenes muy pequeños, en el rango de los microlitros. En la figura 1, se puede
apreciar las diferentes partes de las que se compone una micropipeta. Las más
importantes son las siguientes:
a) Botón pulsador (push button).
b) Botón expulsor (tip ejector button).
c) Selector de volumen (thumbwheel).
d) Pantalla (volumeter display).
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Figura 1. Esquema de una micropipeta
En esta práctica se emplearán dos tipos de micropipetas denominadas P1000 con el
botón azul y P100 (o P200) con el botón amarillo. Cada una tiene un rango de trabajo
diferente que es imprescindible respetar para no dañarla. Para conocer el rango de
trabajo el alumno deberá observar los números separados por un guión que aparecen en
la solapa próximo al botón pulsador. Si se tienen dudas preguntar al profesor.
¿Cuál es el rango de trabajo de las micropipetas que están en tu puesto?
A continuación, el alumno procederá del siguiente modo:
a) Coger la micropipeta por la parte superior, de tal manera que el botón pulsador y
expulsor puedan ser presionados por el dedo pulgar.
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b) Seleccionar el volumen a tomar girando el selector de volumen. ES IMPORTANTE
QUE EL VOLUMEN ESTE DENTRO DEL RANGO DE OPERACIONES DE LA
MICROPIPETA. El volumen seleccionado deberá aparecer en la pantalla.
c) Colocar la punta presionado ligeramente.
d) Presionar SUAVEMENTE el botón pulsador hasta el primer tope.
e) Sumergir el extremo de la punta hasta 2-3 mm en el líquido.
f) Dejar de presionar SUAVEMENTE.
g) Apoyar la punta en las paredes interiores del tubo donde queramos trasvasar el
líquido formando un ángulo de 45º.
h) Presionar el botón pulsador despacio hasta alcanzar el primer tope.
i) Quitar la punta de la pipeta presionando el botón expulsor. NO USAR LAS MANOS.
Una vez familiarizado con el uso de las micropipetas el alumno deberá trasvasar los
siguientes volúmenes de agua desde un vaso de precipitado a un tubo de ensayo
empleando la micropipeta más adecuada para ello:
a) 82 l
b) 122 l
c) 479 l
d) 799 l
e) 52 l
Dibuja para cada volumen la imagen que observas en la pantalla (volumeter display)
4. Preparación de disoluciones.
Las disoluciones habituales en los laboratorios de Bioquímica suelen realizarse en el
rango milimolar-micromolar. En primer lugar, y una vez conocido la función del
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material de laboratorio, el estudiante deberá realizar los cálculos e indicar con el
máximo grado de detalle como prepararía la siguiente disolución:
a) NaCl 12 mM, volumen 58 mL. Peso molecular NaCl: 58,44 g/mol
En la descripción de la preparación deberán aparecer los siguientes términos: balanza,
vaso de precipitado, espátula de laboratorio, imán, probeta y enrasar.
Por último, utilizando la disolución que preparaste anteriormente y el material del
laboratorio que ya conoces señala como prepararías la siguiente disolución: NaCl 100
M, volumen 500 L
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PRACTICA 2. .- LA CÉLULA: MANEJO DEL MICROSCOPIO
ÓPTICO CONVENCIONAL. OBSERVACIÓN DE
PREPARACIONES MICROSCÓPICAS.
Profesor responsable: Dr. David Agustín León Navarro.
1.- OBJETIVOS.
Esta práctica pretende los siguientes objetivos:
a) Que el alumno conozca las diferentes partes de las que se compone un microscopio.
b) Que el alumno se familiarice con términos relativos a la microscopia óptica como
son: magnificación, resolución y apertura numérica.
c) Que el alumno sepa manejar correctamente un microscopio.
2.- CAMPO DE APLICACIÓN.
Las técnicas de microscopia abarcan un amplio espectro dentro de las áreas tecnológicas
y biomédicas. Algunas de las áreas de aplicación son: Anatomía, Histología y
Embriología, Virología, Cirugía, Genética, Química, Bioquímica, Tecnología de los
Alimentos, Botánica, Geología, Arqueología, Bellas Artes, Fisiología Humana y
Animal, Microbiología, Farmacología, Hematología, Física, Radiología, Patología,
Edafología Biología Vegetal, Medicina Forense, Metalurgia, Sanidad Animal, etc.
3.- FUNDAMENTO
Existen varios tipos de microscopios. En la práctica utilizaremos el microscopio óptico
de campo claro (Figura 1). Este tipo de microscopio emplea dos sistemas de lentes que
se denominan ocular y objetivo. Como se puede apreciar en la imagen este microscopio
consta de los siguientes elementos:
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Figura 1. Partes del microscopio óptico
a) una fuente de luz blanca, proporcionada por una lámpara LED que permite
iluminar el objeto de estudio.
b) un condensador que cuenta con una serie de lentes y un diafragma que permite
concentrar de forma homogénea la luz sobre la muestra.
c) el objetivo, pieza fundamental del microscopio encargado de captar la luz que
atraviesa la muestra y de generar una imagen aumentada del objeto observado.
d) El ocular, segundo sistema de lentes del microscopio responsable de aumentar la
imagen creada por el objetivo.
e) Platina, superficie sobre la cual se sitúa la muestra y se sujeta con las pinzas.
f) Macrométrico y micrométrico, son tornillos de enfoque que mueven la platina
hacia arriba y abajo. El macrométrico lo hace de forma rápida mientras que el
micrométrico lo hace de forma lenta.
Un concepto importante en la microscopia es la magnificación que es la relación de la
imagen de un objeto con su tamaño real. La magnificación se puede calcular
multiplicando la magnificación del ocular por la magnificación del objetivo. De este
modo un microscopio óptico que cuente con un ocular de 15 aumentos (15X) y un
objetivo de 100 aumentos (100X) permitirá obtener una magnificación total de 1500X.
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Así, una célula que tenga 10 µm de diámetro podrá ser observada como si tuviera un
tamaño de 10 µm X 1500 = 15000 µm (15 mm).
Un segundo concepto importante en la microscopia es el poder de resolución que es
mínima distancia entre dos puntos que permite que sean observados como dos objetos
independientes. La resolución del microscopio depende de la longitud de onda de la luz
empleada y de la apertura numérica del objetivo, relacionadas a través de la siguiente
ecuación:
d= / 2AN
La apertura numérica (AN) se define matemáticamente como AN = n·sen donde es
la mitad de la amplitud del cono de rayos colectado por la lente del objetivo y n es el
índice de refracción del medio (usualmente aire o aceite) que separa el espécimen del
objetivo y del condensador.
4.- MATERIALES Y MÉTODOS
Microscopios de campo claro.
Preparaciones para observar con la ayuda del microscopio.
5. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL.
5.1 Uso correcto del microscopio.
• Encender el microscopio. NO MIRAR A TRAVES DE LOS OCULARES.
• Reducir la intensidad de la luz al mínimo utilizando el regulador de intensidad
situado en la parte derecha del soporte.
• Girar el revolver portaobjetivos hasta que esté seleccionado el objetivo de menor
aumento.
• Bajar la platina completamente.
• Colocar una preparación (con el cubreobjetos hacía arriba) en la platina sujetándola
con las pinzas.
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• Ajustar la distancia interpupilar de los tubos portaoculares del cabezal hasta obtener
la visión de un único campo luminoso circular.
• Comprobar que el condensador está centrado cerrando el diafragma de apertura y
verificando que el circulo luminoso se encuentra en el centro del campo de visión.
Si el condensador no estuviese centrado devolverlo a esta posición ayudándose de
los 2 tornillos.
• Regular la altura del condensador para conseguir iluminar uniformemente el campo
de visión. Para configuraciones del microscopio de 40 o menos aumentos el
condensador deberá situarse en la parte inferior ascendiendo conforme se vayan
utilizando objetivos mayores con la finalidad de ganar en iluminación y contraste.
• Comenzar la observación con el objetivo de menor aumento (4X).
• Para enfocar, subir la platina con la ayuda del tornillo macrométrico hasta que se
observe la preparación borrosa.
• Terminar de enfocar la muestra utilizando el enfoque micrométrico.
• Cambiar de objetivo al 10X SIN NO MOVER EL TORNILLO MACROMETRICO.
• Terminar de enfocar moviendo el tornillo micrométrico.
• Cambiar al objetivo 40X siguiendo las instrucciones de arriba. EXTREMAR LAS
PRECAUCIONES PARA EVITAR QUE SE INCRUSTE EN LAS
PREPARACIONES.
• NO UTILIZAR EL OBJETIVO DE 100X (las instrucciones para su uso serán
proporcionadas más adelante por el profesor).
• Al finalizar la práctica dejar seleccionado el objetivo de menor aumento en el
revólver portaobjetivos y bajar la platina.
• Apagar el microscopio.
• Cubrir el microscopio con su funda.
5.2 Observación de preparaciones microscópicas.
5.2.1 Extensión de sangre
Para poder visualizar las preparaciones al microscopio óptico es necesario teñirlas
previamente con diferentes compuestos químicos o colorantes. Una tinción muy
utilizada combina los colorantes hematoxilina/eosina. La hematoxilina es un colorante
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básico que tiñe las estructuras celulares ácidas (por ejemplo, núcleos) de azul mientras
que la eosina es un colorante ácido que tiñe las estructuras básicas (por ejemplo,
citoplasma) de color rosado.
En la preparación se puede observar la presencia mayoritaria de eritrocitos, tipo celular
presente en la sangre y encargado del transporte de oxígeno y CO2 a los tejidos y
pulmones. Estas células han sido teñidas con hematoxilina/eosina.
5.2.2 Cromosomas gigantes de glándula salival.
Los cromosomas gigantes o politénicos son un tipo especial de cromosomas que se
caracterizan por ser visibles durante la interfase celular. Estos cromosomas son el
resultado de sucesivas etapas de replicación del DNA sin que se produzca el reparto del
material genético. Este tipo de cromosomas es característico de las células de la
glándula salival de dípteros (moscas).
5.2.3 Mitosis en punta de raíz de cebolla.
El meristemo apical de la raíz es un tejido con alta división celular. En la preparación el
alumno podrá distinguir distintas etapas en la división celular mitótica.
6.- PRESENTACIÓN DE RESULTADO
A) Señala los elementos de los que se compone el microscopio que se muestra en la
imagen.
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B) Completa la siguiente tabla:
Magnificación
Apertura numérica
Magnificación total
Límite de resolución
objetivos (Mobj)
(Mtot= MobjX Mocu)
(d=/ 2AN)
Magnificación ocular (Mocu)
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D) Dibuja los campos celulares que observas en las preparaciones cuando seleccionas el
objetivo de 40X.
Extensión de sangre
Cromosomas
Epitelio simple plano
Mitosis
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PRÁCTICA 3. DETECCIÓN DE MACROMOLÉCULAS.
REACCIONES DE IDENTIFICACIÓN DE CARBOHIDRATOS,
LÍPIDOS Y PROTEÍNAS.
Profesor responsable: Dra. Nilda Gallardo Alpizar.
1. OBJETIVOS:
Se pretende que el alumno se inicie en el trabajo de laboratorio con moléculas de interés
biológico y compruebe algunas propiedades diferenciales entre los distintos tipos de
macromoléculas existentes en los seres vivos.
2. CAMPO DE APLICACIÓN:
En un laboratorio, ya sea de tipo industrial o de investigación, en el que se manejan
macromoléculas de interés biológico es necesario realizar pruebas para identificarlas y
cuantificarlas. En el trabajo habitual de laboratorio se determina la concentración de
proteínas y de ácidos nucleicos, y con cierta frecuencia es necesario determinar la
presencia de almidón u otras macromoléculas en los alimentos. Esta práctica inicia al
alumno en el manejo e identificación de estas macromoléculas.
3. FUNDAMENTO
3.1 Hidratos de carbono
Los hidratos de carbono o carbohidratos son compuestos carbonados que contienen
hidrógeno y oxígeno en proporción 2:1. Tienen gran importancia en la biosfera como
moléculas orgánicas formadas durante la fotosíntesis. Las plantas verdes y las algas son
capaces de utilizar la energía solar para sintetizar carbohidratos a partir de agua y del
dióxido de carbono atmosférico. Estos carbohidratos servirán como fuente energética al
hombre y otros animales, convirtiéndose en glucosa y ésta a su vez en dióxido de
carbono y agua.
Las moléculas sillares de los carbohidratos son los monosacáridos y a partir de ellos se
forman los disacáridos y polisacáridos.
3.1.2. Determinación de monosacáridos.
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Los monosacáridos poseen poder reductor debido al grupo carbonilo que llevan en su
molécula, Este poder reductor se aprovecha para su determinación por la reacción de
FehIing, que utiliza el cobre como agente oxidante. En medio alcalino el cobre forma
hidróxido cúprico, que pasaría a óxido cúprico al calentar, pero si en el medio hay un
agente reductor, como la glucosa, el hidróxido se reduce a óxido cuproso, de color rojo.
3.1.3. Determinación de disacáridos.
Los disacáridos generalmente dan positiva la reacción de Fehling, pues al formarse el
enlace glicosídico, de ordinario se pierde el poder reductor de uno de los
monosacáridos, pero se conserva el otro. En algunos casos, como en la sacarosa
(presente en el azúcar comercial), el enlace glicosídico afecta al poder reductor de
ambos monosacáridos (glucosa y fructosa), no dando positiva la reacción de Fehling. Si
hidrolizamos la sacarosa, se romperá el enlace glicosídico y ambos monosacáridos
tendrán poder reductor
3.1.4.- Determinación de polisacáridos.
Los polisacáridos no tienen poder reductor, por lo que no dan positiva la reacción de
Fehling. Pero para la determinación de la presencia de almidón se puede utilizar iodo,
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que se fija a la superficie de la amilosa, solamente en frío, dando color azuL Vamos a
utilizar almidón puro como control positivo, de manera que estemos seguros de que el
procedimiento da un resultado observable, y una muestra en la que intentaremos
comprobar la presencia de este polisacárido (por ejemplo, la patata)
3.2 Lípidos
Los lípidos son compuestos naturales insolubles en agua y solubles en disolventes
orgánicos (acetona, etanol, benceno, etc,). Son de composición muy variada y su
función puede ser estructural, de reserva, hormonal etc. Los lípidos más abundantes son
los triglicéridos, que por hidrólisis alcalina (saponificación) producen alcoholes y sales
de potasio solubles en agua (jabones)
3.2.1. Solubilidad.
Las sustancias cuyas moléculas presentan polaridad eléctrica se denominan polares y
tienden a disolverse en disolventes polares, mientras que las sustancias no polares lo
hacen en líquidos de igual naturaleza. Sabiendo que los lípidos no son polares veremos
su solubilidad.
3.2.2. Tinción.
Vamos a utilizar un colorante específico para moléculas no polares (Sudán III) y otro
específico para moléculas polares (tinta).
3.3 Proteínas.
Las proteínas son macromoléculas constituidas por aminoácidos unidos entre sí por
enlaces peptídicos. Las sustancias que contienen uno o más enlaces peptídicos, dan en
medio alcalino con CuSO4 un color violeta característico debido a la formación de un
complejo de coordinación del Cu con 4 átomos de N. La intensidad del color de la
disolución es proporcional a la concentración de proteína, con una sensibilidad de
1-10mg/ml.
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Fórmula de biuret
4. MATERIALES Y MÉTODOS
4.1 Hidratos de carbono
Material.
- Uvas pasas.
- Azúcar.
- Disolución de almidón 2.5%
Reactivos.
- Solución de Fehling:
Solución A - sulfato de cobre 0.3 M (preparada en la práctica 1).
Solución B - tartrato sódico potásico 1.5 M. hidróxido potásico 3 M (preparadas en
práctica 1).
El tartrato sódico-potásico se utiliza para estabilizar.
- Ácido clorhídrico 5 N.
- Hidróxido sódico 5 N.
- Lugol.
4.2 Lípidos
Material.
- Aceite.
- Detergente.
- Cloroformo.
Reactivos
- Solución alcohólica saturada de Sudán III. Calentar 32.5 ml de alcohol absoluto y 17.5
ml de agua destilada a 30-35°C y disolver en ella 0.5 g de Sudán III, agitando. Dejar
enfriar a 20°C y filtrar.
- Tinta china.
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4.3 Proteínas
Reactivos:
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- Proteína patrón: Albúmina. Disolución 10 mg/ml
- Reactivo de BIURET: preparar 250 ml de una disolución de CuSO4 12mM y Tartrato
Sódico Potásico 42 mM. Añadir agitando continuamente 150 ml de una disolución de
NaOH al 10% (p/v) y diluir hasta 500 ml. Si hay depósito de óxido cuproso, añadir 1g
de KI.
- Dodecil sulfato sódico (SDS) 10% p/v
5. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
5.1 Hidratos de carbono
Monosacáridos.
1) Colocar en un tubo de ensayo un trozo de pasa y añadir 5mI de agua destilada. Agitar
para disolver la glucosa de la pasa.
2) Decantar a otro tubo de ensayo la solución de la glucosa.
3) Añadir 1 ml de reactivo de Fehling A, agitar y añadir otro ml de reactivo de Fehling
B. Agitar.
4) Calentar el tubo en el baño y observar o que ocurre.
Disacáridos.
Hidrólisis química de la sacarosa.
1).- Poner 10 mI de sacarosa al 1% (p/v) en un tubo de ensayo.
2).- Añadir 5 ml de HCI 3N y calentar al baño de María 10 min.
3).- Enfriar el tubo. Medir pH y neutralizar con NaOH 5N.
4).- Repetir la reacción de Fehling (apartado A, puntos 3 y 4) sobre 3 ml de la
disolución anterior.
Polisacáridos:
1).- Poner en un tubo 1ml de la disolución de almidón al 2.5% (p/v) y diluirla 1/10 con
H20 (Vfinal 10 mI).
2). Separar en cuatro tubos poniendo 1 ml de a disolución en cada uno. Proceder como
se indica:
Tubo 1: Añadir varias gotas de Iugol y ver la presencia de almidón.
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Tubo 2: Ver la reacción de Fehling.
Tubos 3 y 4: Hidrolizar el almidón con 2 ml de HCl 3N. Calentar al baño de María 10
min. Enfriar y neutralizar con hidróxido sódico 5N. En el tubo 3 añadir lugol y en el 4
ver la reacción de Fehling.
5.2 Lípidos
Solubilidad:
1). Tomar 3 tubos y poner en uno 2ml de agua destilada, en otro 2 ml de agua jabonosa
y en el último 2 ml de cloroformo.
2), Añadir a cada tubo 2 ml de aceite y agitar fuertemente.
3). Ver lo ocurrido inmediatamente después de la agitación y transcurridos unos
minutos.
Tinción.
1). Poner en dos tubos de ensayo 2 ml de aceite y 2 mI de agua.
2). Añadir a uno de los tubos 4-5 gotas de solución alcohólica de Sudán III y al otro 4-5
gotas de tinta.
3). Agitar fuertemente. Centrifugar 10 min. a 5000 rpm.
Observar los resultados.
5.3 Proteínas
Reconocimiento de proteínas:
Preparar 3 disoluciones, cada una con 1 ml de volumen final. Una con sacarosa 1% p/v,
otra con 4 mg/ml de albúmina y otra con 0.1 ml de aceite y SDS 1% p/v. Las diluciones
se realizan con Tris 25 mM pH 7.0
A 1 ml de cada una de estas disoluciones, patrón y muestras problema, añadir 5 ml de
reactivo Biuret, mezclar bien.
Dejar reposar 10 min y comprobar el resultado.
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6. PRESENTACIÓN DE RESULTADOS.
Cada grupo de trabajo informará al profesor de los resultados obtenidos en cada uno de
los procedimientos utilizados para la identificación de biomoléculas, con el objetivo de
discutirlos, analizar las incidencias y sacar conclusiones de la práctica.
Las cuestiones que se formulan a continuación ayudarán al estudiante en el estudio
individual de los contenidos de esta práctica así como en el análisis y la interpretación
individual de los resultados obtenidos.
CUESTIONES.
1.- Formula un azúcar reductor y otro no reductor.
2- ¿Por qué la sacarosa no es un disacárido reductor?
3.- La reaccíón de Fehling, ¿es específica de azúcares?
4.- ¿Por qué el Método de Biuret es un método específico para cuantificar la
concentración de proteínas?
5- ¿Cómo explicas los resultados obtenidos al estudiar la solubilidad de los lípidos?
6.- Comentar los resultados obtenidos en los distintos casos.
7. REFERENCIAS.
Mathews, C.K. (2002) Bioquímica 3ª ed. Pearson Educación, Madrid. ISBN: 0-8053-
3066-6
Switzer, R. and Garrity, L. (1999) Experimental biochemistry. 3 rd ed. W.H. Freeman
and Company, New York. ISBN: 0-7167-3300-5
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PRÁCTICA 4.- FRACCIONAMIENTO CELULAR: AISLAMIENTO DE
CLOROPLASTOS A PARTIR DE HOJAS DE ESPINACA.
OBSERVACIÓN DE LA ACTIVIDAD FOTOSINTÉTICA.
Profesor responsable: Dr. David A. León Navarro.
1.- OBJETIVOS.
Esta práctica pretende los siguientes objetivos:
a) Que el alumno conozca las partes fundamentales de una centrífuga y como debe
usarse correctamente.
b) Que el alumno comprenda como el fraccionamiento celular permite separar
componentes celulares (en esta práctica cloroplastos) utilizando la centrífuga.
c) Que el alumno pueda observar cómo los cloroplastos aislados en el punto anterior son
funcionales y llevan a cabo la fotosíntesis.
2.- CAMPO DE APLICACIÓN.
El fraccionamiento celular es una técnica que permite separar aislar y separar los
principales orgánulos y otros componentes subcelulares en cantidades significativas.
Esta técnica es, por lo tanto, muy habitual en aquellos laboratorios de investigación de
Biología Celular y Molecular, Bioquímica, Fisiología… que estén interesados en
conocer la composición y funciones de estos orgánulos.
3.-FUNDAMENTOS.
El fraccionamiento celular permite aislar y separar los principales orgánulos celulares y
otros componentes subcelulares. La primera etapa en el fraccionamiento implica romper
las células utilizando para ello diferentes técnicas dando lugar a la aparición de un
medio viscoso denominado homogenado. Si esta primera etapa se realiza de un modo
cuidadoso en el homogenado se encontraran orgánulos mayoritariamente intactos como
el núcleo, cloroplastos, mitocondrias, complejo de Golgi y lisosomas.
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Para separar los orgánulos del homogenado es necesario utilizar un instrumento
conocido como centrífuga que consiste en un rotor de metal que se encuentra alojado en
el interior de una cámara blindada. La rápida rotación del rotor permite la aparición de
una fuerza centrífuga que permite separar los orgánulos celulares conforme a su tamaño
y densidad: en general los orgánulos más grandes experimentan las mayores fuerzas
centrífugas y se mueven más rápidamente hacía el fondo del tubo de centrífuga.
En la práctica las células vegetales presentes en las hojas de espinaca se romperán con
la ayuda de unas tijeras. El homogenado resultante contendrá además de los orgánulos
celulares (núcleos, cloroplastos, mitocondrias...) desechos grandes como las paredes
celulares o, incluso células que se hayan mantenido intactas que conviene separar antes
de utilizar la centrifuga. Con esta finalidad, filtraremos el homogenado. A continuación,
someteremos el homogenado a una centrifugación a baja velocidad (1500g) que
permitirá que los núcleos sedimenten rápidamente. El resto de los orgánulos celulares
incluyendo los cloroplastos permanecerán en el sobrenadante. Concluida la primera
ronda de centrifugación someteremos el sobrenadante a una segunda ronda de
centrifugación a 3000g. Como resultado de esta segunda ronda, los cloroplastos
sedimentaran en el fondo del tubo. Si estuviésemos interesados en estudiar otro
orgánulo como por ejemplo las mitocondrias tendríamos que seguir centrifugando a
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mayor velocidad el sobrenadante obtenido. En nuestro caso como queremos estudiar los
cloroplastos el fraccionamiento celular concluye después de la segunda ronda de
centrifugación.
Una vez aislados los cloroplastos en la práctica estudiaremos la fase luminosa de la
fotosíntesis. Para ello, utilizaremos una molécula química, 2,6 diclorofenolindifenol
(DCPIP) que tiene la capacidad para intercalarse en la cadena de transporte electrónico
de la membrana tilacoidal y reducirse con los electrones procedente de la plastoquinona.
El DCPIP tiene una propiedad fundamental para el desarrollo de la práctica: tiene un
color azul intenso en su forma oxidada que se reduce cuando pasa a su forma reducida.
Este cambio de coloración puede fácilmente detectarse si se mide la absorbancia de la
muestra a 590 nm con la ayuda de un espectrofotómetro donde la reducción del DCPIP
produce una pérdida del valor de absorbancia.
En la práctica iluminaremos los cloroplastos en presencia de DCPIP. Si los cloroplastos
mantienen su funcionalidad y realizan la fase luminosa de la fotosíntesis cuando son
iluminados provocarán una reducción del DCPIP que irá ligado a una pérdida en la
absorbancia a 590 nm.
4.- MATERIALES Y MÉTODO
4.1 Materiales.
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Hojas de espinacas fresca.
Tampón fosfato 0.01 M (K2HPO4 1,35 g + KH2PO4 0,3 g en 1 litro de agua). Mantener
en frio.
Disolución de sacarosa 0,5M. Mantener en frio.
Micropipetas y puntas.
Espectrofotómetro y cubetas de medición
Papel de aluminio
Tubos de centrífuga de plástico de 10 ml
Tubos de ensayo de vidrio
Parafilm
Centrífuga de mesa.
2,6-diclorofenol indofenol (DCPIP) 0.1 % (0.01 g en 10 ml de agua).
Varilla de vidrio.
Vaso de precipitado de 50 o 100 mL
Lampara flexo.
4.2 Método.
Obtención del extracto de cloroplastos.
• Pesar 5 gramos de hojas libres de nervios.
• Triturar en un mortero con 10 ml de la disolución de sacarosa 0,5M (la
disolución tiene que estar fría).
• Filtrar el triturado utilizando un filtro de papel. Recoger el filtrado en un vaso de
precipitado.
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• Pipetear el contenido del vaso de precipitado a un tubo de plástico de 10 ml.
• Añadir en otro tubo de centrífuga de plástico un volumen similar de agua. Este
tubo nos servirá como pareja del anterior en la centrifugación posterior.
• Comprobar que los dos tubos están equilibrados (diferencia de peso admitida 0,1
g).
• Colocar los tubos enfrentados en la centrifuga de mesa.
• Centrifugar durante 10 minutos a 1500g.
• Trasvasar el sobrenadante a otro tubo con la ayuda de una pipeta Pasteur y
descartar el sedimento.
• Centrifugar el sobrenadante durante 10 minutos a 3000g asegurándose que las
parejas de tubos enfrentadas pesen lo mismo (diferencia de peso admitida 0,1 g).
Si fuese necesario la pareja puede ser un tubo con agua.
• Descartar el sobrenadante con cuidado de no tirar el sedimento. Añadir 2 ml de
disolución de sacarosa fría y resuspender suavemente el sedimento con una
varilla de vidrio.
• Añadir 8 mL de tampón fosfato frio y mezclar.
• Verter el contenido en un vaso de precipitado de 50 o 100 mL
• Añadir 12 mL de tampón fosfato frio al vaso de precipitado y mezclar dando
vueltas en círculo. Este vaso contiene el extracto de cloroplastos.
4.2.2 Reacción de Hill.
• Preparar los siguiente tres tubos de ensayo en tubos de vidrio:
Tubo 1 (luz) 2 (oscuridad) 3 (hervido)
Extracto de
cloroplastos
3 mL 3 mL 3 mL
• Poner el tubo 3 en el baño a 100º C durante 5 minutos.
• Enfriar el tubo 3 situándolo bajo el chorro de agua del grifo.
• Añadir 6 mL de DCPIP 0,1 % al tubo número 1 y mezclar por inversión tapando
la boca del tubo con Parafilm. Retirar rápidamente 3 mL del tubo y trasvasarlo a
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otro tubo rotulado como tubo 1 tiempo 0 y taparlo completamente con papel de
aluminio.
• Dejar los 6 mL restantes del tubo 1 en la gradilla iluminándolo con la lampara
flexo (a 10 cm) durante 5 minutos. Transcurrido este tiempo tapar
completamente el tubo con papel de aluminio y alejarlo de la lámpara. Este va a
ser el tubo 1 tiempo 5.
• Añadir 6 mL de DCPIP 0,1 % al tubo número 2 y mezclar por inversión tapando
la boca del tubo con Parafilm. TAPAR INMEDIATAMENTE EL TUBO CON
PAPEL DE ALUMNIO. Retirar rápidamente 3 mL del tubo y trasvasarlo a otro
tubo rotulado como tubo 2 tiempo 0 y taparlo completamente con papel de
aluminio.
• Dejar los 6 mL restantes en el tubo completamente tapado con papel de alumnio
en un cajón cerrado durante 5 minutos. Este va a ser el tubo 2 tiempo 5.
• Añadir 6 mL de DCPIP 0,1 % al tubo número 3 y mezclar por inversión tapando
la boca del tubo con Parafilm. Retirar rápidamente 3 mL del tubo y trasvasarlo a
otro tubo rotulado como tubo 3 tiempo 0 y taparlo completamente con papel de
aluminio.
• Dejar los 6 mL restantes en el tubo iluminándolo con la lampara flexo (a 10 cm)
durante 5 minutos. Transcurrido este tiempo tapar el tubo con papel de aluminio
y alejarlo de la lámpara. Este va a ser el tubo 3 tiempo 5.
• Proceder a la lectura de la absorbancia a 590 nm de los 6 tubos (tubo 1 tiempo 0,
tubo 1 tiempo 5, tubo 2 tiempo 0, tubo 2 tiempo 5, tubo 3 tiempo 0 y tubo 3
tiempo 5).
• Anotar los valores de absorbancia
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5. PRESENTACIÓN DE RESULTADOS Y CUESTIONES.
Anota los valores de absorbancia en el siguiente cuadro
Tiempo 0 Tiempo 5
Tubo 1
Tubo 2
Tubo 3
¿Cómo ha variado la absorbancia con el paso del tiempo en los tres tubos? ¿Qué
conclusiones obtienes?
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