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inf ección, observamos una masiv a represión génica
en ambas especies. Además, en un análisis de
ortología con un blast recíproco, pudimos observ ar
que esta represión génica parece estar conserv ada
en ambas especies, pudiéndose detectar más de
cien genes con posibles ortólogos, reprimidos
ambos en las CGs de las dos especies por sólo un
gen comúnmente inducido. Entre los genes
comúnmente reprimidos se encuentran
signif icativ amente enriquecidos aquellos que
codif ican genes de def ensa, enzimas del
metabolismo secundario o peroxidasas. Entre estas
peroxidasas, el gen TPX1 reprimido en las CGs de
líneas susceptibles de tomate y en sus agallas,
mientras que está altamente inducido en agallas de
plantas resistentes. Además, la sobreexpresión de
esta peroxidasa en la línea susceptible conllev a una
reducción en los parámetros de inf ección y en el
tamaño de las CGs desarrolladas. Parece por tanto
que esta masiva represión génica en los sitios de
alimentación de los nematodos, pueda tener un
papel relev ante para el correcto desarrollo de la
inf ección.
Muchos mecanismos de represión de genes están
mediados por small RNAs (sRNAs), por ello, se
estudió la regulación y el posible papel de los RNAs
de pequeño tamaño (sRNAs) en la masiv a represión
génica encontrada en CGs. Se generaron seis
librerías de sRNAs que se secuenciaron, tres de
ellas muestras independientes de agallas a 3 días
post infección y las otras tres de segmentos de
raíces control. Las principales dif erencias se
encontraron en las secuencias de 21 y 24
nucleótidos, correspondientes a miRNAs y rasiRNAs
respectivamente. En el primer caso, tras un análisis
de expresión dif erencial, se obtuv ieron 51 mRNAs
reprimidos y 11 inducidos. Entre los inducidos se
encontraba el miRNA390a, que en colaboración con
otro sRNA intermediario, el tasiRNA3a, participa en
la cascada de señalización mediada por auxinas
para la f ormación de las raíces laterales. Mediante el
uso de líneas delatoras y líneas sensoras, líneas con
pérdida de f unción, PCR cuantitativ a y ensayos de
inf ección, pudimos demostrar que ambos sRNAS, el
miRNA390a y el tasiRNA3a, se encontraban
inducidos y eran f uncionales en las agallas y CGs
inducidas por M. jav anica, ya que líneas de pérdida
de f unción tenían reducidos los índices de inf ección
y el tamaño de las CGs era menor que en las líneas
control.
Tras esta masiva generación de datos mediante
estudios holísticos, decidimos crear una base de
datos de los transcriptomas de los sitios de
alimentación de nematodos f itoendoparásitos
inducidos en Arabidopsis a la que llamamos
“NEMATIC”. Además, añadimos otras bases de
datos y otros transcriptomas de relev ancia para el
estudio de esta interacción con el fin de f acilitar la
selección de genes para posteriores estudios
f uncionales. NEMATIC se usó para la comparación
de los genes inducidos en CGs y agallas con
aquellos enriquecidos en los dif erentes tipos
celulares de la raíz. Se observó un enriquecimiento
de los genes característicos de tipos celulares
indif erenciados de la raíz como el centro quiescente
o las células f undadoras del periciclo asociado al
xilema que originan los primordios de raíz lateral.
Pudimos demostrar que uno de los genes
marcadores de estas células f undadoras, el LBD16,
se induce específicamente en las agallas inducidas
por el nematodo (Figura 2) y por sus secreciones.
Además, líneas mutantes para este gen mostraron
una reducción en el índice de inf ección y en el
tamaño de las CGs. Sin embargo, LBD16 no se
induce en los sincitios inducidos por nematodos
f ormadores de quistes de la especie Heterodera
schachtii. Por último, hemos desarrollado un nuev o
método de fenotipado en las CGs mediante
reconstrucción tridimensional. Tras seccionar una
agalla completamente y tomar f otografías de todas
las secciones seriadas, se utilizó el programa
TrakEM2 para la alineación, por rotación y
traslación, de las secciones y el posterior marcaje
indiv idual de cada CG. Esto nos permitió obtener
reconstrucciones 3D de las CGs, observ ando por
primera v ez su morf ología (Figura 3). Esto nos ha
permitido obtener datos cuantitativ os de los
v olúmenes ocupados por CGs indiv iduales y por
todo el grupo de células en el interior de una agalla.
A este respecto, observ amos que el parámetro más
relev ante con una alta correlación con los tiempos
de inf ección, es precisamente el v olumen de todo el
pool de células en la agalla. Además, proponemos
su utilidad para ev itar errores en el fenotipado de las
mismas en cuanto a su número y posición debido a
su morfología irregular.
Figura 2. A) Agalla de 4 días post infección en la línea
transgénica de trampa de promotores J0192 en la que la
expresión de la GF P está dirigida por el promotor del gen
LBD16. B) Agalla a 7 días post infección formada en la
línea pLBD16:GUS.
Como conclusiones de esta tesis, hemos mostrado
la existencia de una represión génica masiv a en las
CGs, conserv ada entre especies y necesaria para la
progresión de la inf ección de los nematodos
f ormadores de agallas Esta represión está mediada
en parte por miRNAs y tasiRNAs y posiblemente por
rasiRNAs. Además, mostramos la importancia de las
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