Informe actividad Prontosan® frente a bacterias multiresistentes nosocomiales
prontosan-eficacia-ante-bacterias-multiresistentes
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<strong>Informe</strong> <strong>actividad</strong> <strong>Prontosan®</strong> <strong>frente</strong> a <strong>bacterias</strong><br />
<strong>multiresistentes</strong> <strong>nosocomiales</strong>.<br />
Servicio de Microbiología. Hospital Virgen de Macarena. Sevilla<br />
Departamento de Microbiologia. Facultad de Medicina. Sevilla<br />
Dr. Álvaro Pascual<br />
Director de la Unidad de Enfermedades Infecciosas y<br />
Microbiología del Hospital Universitario Virgen Macarena<br />
de Sevilla.<br />
Presidente de la SEIMC
ÍNDICE<br />
1. OBJETIVOS<br />
2. MATERIAL Y MÉTODOS<br />
2.1 Cepas Bacterianas<br />
2.2 Test Sensibilidad<br />
2.3 Actividad bactericida de <strong>Prontosan®</strong><br />
2.4 Cepas con sensibilidad reducida in vitro a <strong>Prontosan®</strong><br />
3. RESULTADOS<br />
3.1 Microdilución en caldo<br />
3.2 Difusión en disco (placa)<br />
3.3 Curvas de tiempo-muerte bacteriana<br />
3.4. Curvas de crecimiento bacteriano<br />
3.5 Test de Dilución-Neutralización<br />
3.6. Cepas con sensibilidad in vitro<br />
4. CONCLUSIONES<br />
5. BIBLIOGRAFÍA
1. OBJETIVOS<br />
1º Determinar la <strong>actividad</strong> in vitro de <strong>Prontosan®</strong> <strong>frente</strong> a los clones más representativos de<br />
<strong>bacterias</strong> <strong>nosocomiales</strong> <strong>multiresistentes</strong>.<br />
2º Estudiar la aparición de aislados con sensibilidad disminuida tras la exposición continua a<br />
<strong>Prontosan®</strong> en cepas bacterianas multirresistentes y, en estos casos, valorar el coste biológico<br />
(fitness bacteriano).<br />
2. MATERIAL Y MÉTODOS<br />
2.1 Cepas Bacterianas<br />
Se incluyen cepas estándares de la colección ATCC y cepas <strong>nosocomiales</strong> resistentes de<br />
Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli,<br />
Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa, Enterobacter cloacae y Enterococcus<br />
faecalis:<br />
Nº Cepa Clon Característica<br />
1 Enterococcus faecium ATCC 35667<br />
2 Staphylococcus aureus ATCC 25923<br />
3 Klebsiella pneumoniae ATCC 13883<br />
4 Escherichia coli ATCC 25922<br />
5 Acinetobacter baumannii ATCC 19606<br />
6 Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853<br />
7 Enterobacter cloacae ATCC 13047<br />
8 Enterococcus faecalis ATCC 29212<br />
9 Pseudomonas aeruginosa ST-175 XDR<br />
10 Pseudomonas aeruginosa ST-111 VIM-2<br />
11 Pseudomonas aeruginosa ST-235 GES-5<br />
12 Acinetobacter baumannii Clon Internacional I MDR<br />
13 Acinetobacter baumannii Clon Internacional II MDR<br />
14 Staphylococcus aureus Complejo Clonal 5 Resistente a meticilina<br />
15 Staphylococcus aureus Complejo Clonal 8 Resistente a meticilina<br />
16 Escherichia coli ST-131 CTX-M<br />
17 Klebsiella pneumoniae SHV-12<br />
18 Klebsiella pneumoniae ST-512 KPC-3
19 Klebsiella pneumoniae OXA-48 y CTX-M-15<br />
20 Klebsiella pneumoniae TEM-4<br />
21 Enterococcus faecalis Complejo Clonal 2<br />
22 Enterococcus faecalis Complejo Clonal 9<br />
23 Enterobacter cloacae SHV-12 y CTX-M-9<br />
24 Enterobacter cloacae CTX-M-15<br />
25 Enterobacter cloacae CTX-M-9<br />
26 Enterococcus faecium VanB2<br />
27 Enterococcus faecium VanA<br />
28 Enterococcus faecium VanA<br />
29 Enterococcus faecium VanB<br />
2.2 Tests de sensibilidad<br />
Con el fin de determinar la sensibilidad de las cepas bacterianas a <strong>Prontosan®</strong>, se utilizaron dos<br />
métodos: microdilución en caldo y difusión con discos. Ambos se llevaron a cabo siguiendo<br />
las recomendaciones del CLSI 1 para antimicrobianos. Para cada cepa se determinaron: i)<br />
concentración mínima inhibitoria (CMI) y la concentración mínima bactericida (CMB)<br />
(microdilución en caldo) y ii) diámetro del halo de inhibición (difusión con disco).<br />
2.3 Actividad bactericida de <strong>Prontosan®</strong><br />
Para el resto de los experimentos, se seleccionaron las 8 cepas ATCC y las 8 cepas clínicas que<br />
presentaron mayor CMI dentro de cada especie.<br />
Para el estudio de la <strong>actividad</strong> bactericida de <strong>Prontosan®</strong>, se utilizaron curvas de tiempo-muerte<br />
bacteriana, siguiendo la metodología descrita en la normativa de los Estándares Europeos<br />
EN1040 2 y PrEN12054 3 (EN 1040,1997. PrEN 12054, 1995) y Kawamura-Sato et al. 4<br />
Previamente a realizar las curvas de tiempo-muerte, se comprobó que la solución de<br />
neutralización (8% v/v Tween 80, 6% w/V saponina, 0.8% w/v lecitina, 2% w/v docedil sulfato<br />
sódico, PBS) no inhibía el crecimiento bacteriano a las concentraciones utilizadas en el ensayo,<br />
y que una dilución 1:10 de la solución de neutralización era capaz de neutralizar la <strong>actividad</strong><br />
bactericida de <strong>Prontosan®</strong>. Para las curvas de tiempo-muerte, con un inoculo inicial de 5x10 5<br />
UFC/mL, se utilizaron concentraciones de <strong>Prontosan®</strong> equivalentes a 0.25, 1, 4 y 8xCMI.
Se tomaron alícuotas a diferentes tiempos (0, 5´, 10´, 15´, 30´, 1h, 2h, 4h, 8h y 24h), que fueron<br />
neutralizadas e inoculadas en placas Mueller-Hinton agar para el recuento bacteriano. Se<br />
consideró que <strong>Prontosan®</strong> tenia <strong>actividad</strong> bactericida cuando a la concentración ensayada, se<br />
conseguía una reducción 3 log UFC/mL.<br />
Con el fin de complementar estos estudios, se realizaron curvas de crecimiento bacteriano<br />
monitorizando la turbidez (DO a 595 nm) del medio con un lector automático de microplacas<br />
(Infinite F200PRO, TECAN). Los experimentos se realizaron en ausencia y presencia de diferentes<br />
concentraciones de <strong>Prontosan®</strong> (0,25, 1, 2, 4 y 8 x CMI) utilizando un inoculo bacteriano de<br />
5x10 5 UFC/mL.<br />
Adicionalmente, la <strong>actividad</strong> bactericida de <strong>Prontosan®</strong> se determinó mediante el test de<br />
dilución-neutralización siguiendo el Estándar Europeo PrEN 12054 3 . Brevemente, un inóculo<br />
bacteriano inicial de 10 6 UFC/mL fue incubado durante 1 minuto con el producto sin diluir, y<br />
seguido de un proceso de neutralización, se contaron las UFC mediante diluciones seriadas en<br />
placas de Mueller-Hinton agar.<br />
2.4 Selección de Cepas con sensibilidad reducida in vitro a <strong>Prontosan®</strong><br />
La selección de cepas con sensibilidad reducida a <strong>Prontosan®</strong> se llevó a cabo por dos métodos<br />
distintos: 1) difusión en agar utilizando discos impregnados con diferentes concentraciones de<br />
<strong>Prontosan®</strong>;; y 2) Pases seriados en placas con concentraciones crecientes de <strong>Prontosan®</strong>, desde<br />
0.5xCMI de cada cepa y crecientes en Log 2 .<br />
Todos estos experimentos se realizaron por triplicado en 3 días distintos.
3. RESULTADOS<br />
3.1 Microdilución en caldo<br />
Como se muestra en la tabla 1, los valores de CMI y CMB obtenidos con la colección de cepas<br />
ATCC fueron variables (0.5-4 mg/L). Las cepas más sensibles a <strong>Prontosan®</strong> fueron S. aureus, K<br />
pneuumoniae y E. cloacae. Los valores de CMB fueron iguales a los de CMI para todas las cepas<br />
testadas, con excepción de E. cloacae, la cual fue una dilución superior (Tabla 1).<br />
Tabla 1. Valores de CMI/CMB de <strong>Prontosan®</strong> <strong>frente</strong> a cepas estándar.<br />
CEPA CMI (mg/L) CMB (mg/L)<br />
1 Enterococcus faecium ATCC 35667 2 2<br />
2 Staphylococcus aureus ATCC 25923 0,5 0,5<br />
3 Klebsiella pneumoniae ATCC 13883 0,5 0,5<br />
4 Escherichia coli ATCC 25922 1 1<br />
5 Acinetobacter baumannii ATCC 19606 4 4<br />
6 Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 4 4<br />
7 Enterobacter cloacae ATCC 13047 0,5 1<br />
8 Enterococcus faecalis ATCC 29212 1 1
En la tabla 2 están representados los valores de CMI y CMB obtenidos con las cepas clínicas<br />
(0.5 -8 mg/L). Para cada especie, se seleccionó la cepa con mayor CMI para experimentos<br />
posteriores (marcadas en negrita y asterisco).<br />
Tabla 2. Valores de CMI/CMB de <strong>Prontosan®</strong> <strong>frente</strong> a cepas clínicas.<br />
CEPA CMI (mg/L) CMB (mg/L)<br />
9* Pseudomonas aeruginosa ST-175 XDR 8 8<br />
10 Pseudomonas aeruginosa ST-111 VIM-2 8 8<br />
11 Pseudomonas aeruginosa ST-235 GES-5 8 8<br />
12* Acinetobacter baumannii CI I MDR 4 4<br />
13 Acinetobacter baumannii CI II MDR 4 4<br />
14* Staphylococcus aureus CC5 Meticillin-resistant 1 1<br />
15 Staphylococcus aureus CC8 Meticillin-resistant 1 1<br />
16* Escherichia coli ST-131 BLEE Type CTX-M 2 2<br />
17 Klebsiella pneumonia BLEE Type SHV-12 1 1<br />
18* Klebsiella pneumoniae ST-512 KPC-3 2 4<br />
19 Klebsiella pneumoniae OXA-48 y CTX-M-15 2 2<br />
20 Klebsiella pneumoniae BLEE type TEM-4 2 2<br />
21* Enterococcus faecalis CC2 C2620 2 2<br />
22 Enterococcus faecalis CC9 C2288 2 2<br />
23 Enterobacter cloacae SHV-12 y CTX-M-9 1 1<br />
24* Enterobacter cloacae CTX-M-15 2 2<br />
25 Enterobacter cloacae CTX-M-9 2 2<br />
26* Enterococcus faecium VanB2 2 2<br />
27 Enterococcus faecium VanA 1 1<br />
28 Enterococcus faecium VanA 0,5 1<br />
29 Enterococcus faecium VanB 0,5 1
3.2 Difusión en disco<br />
Tras 24 horas de incubación en presencia de discos blancos impregnados con 15 µL de<br />
<strong>Prontosan®</strong>, no se observaron zonas de inhibición alrededor del disco, probablemente debido a<br />
la escasa difusión de <strong>Prontosan®</strong> en el agar.<br />
3.3 Curvas de tiempo-muerte bacteriana<br />
Como se indica en los ensayos de muerte bacteriana (figuras 1A a 1P), <strong>Prontosan®</strong> muestra una<br />
<strong>actividad</strong> bactericida dosis-dependiente <strong>frente</strong> a las cepas estudiadas. En todas las cepas se<br />
observa recrecimiento bacteriano tras 24 horas de incubación a ciertas concentraciones, sin<br />
embargo la erradicación total del inóculo bacteriano (sin crecimiento bacteriano posterior) se<br />
observó a concentraciones variables de <strong>Prontosan®</strong> (cepas ATCC: 1xCMI para E. faecium, 4xCMI<br />
para E. coli, A. baumannii, P. aeruginosa y E. faecalis y 8xCMI para S. aureus, K. pneumoniae y E.<br />
cloacae;; cepas clínicas: 4xCMI para todas las cepas excepto para S. aureus que fue de 8xCMI).<br />
Estas concentraciones (16mg/L o inferior) son muy inferiores a las concentraciones comerciales<br />
utilizadas (1000 mg/L).
Log CFU/mL<br />
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Enterococcus faecium ATCC 35667<br />
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Time (h)<br />
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Log CFU/mL<br />
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Staphylococcus aureus ATCC 25923<br />
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Time (h)
Log CFU/mL<br />
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Klebsiella pneumoniae ATCC 13883<br />
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Time (h)<br />
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Log CFU/mL<br />
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Escherichia coli ATCC 25922<br />
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Time (h)
Log CFU/mL<br />
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Acinetobacter baumannii ATCC 19606<br />
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Time (h)<br />
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Log CFU/mL<br />
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Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853<br />
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Time (h)
Log CFU/mL<br />
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Enterobacter cloacae ATCC 13047<br />
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Time (h)<br />
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Log CFU/mL<br />
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Enterococcus faecalis ATCC 29212<br />
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Time (h)
Log CFU/mL<br />
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Enterococcus faecium VanB2<br />
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Time (h)<br />
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Log CFU/mL<br />
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Staphylococcus aureus MR CC5<br />
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Time (h)
Log CFU/mL<br />
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Klebsiella pneumoniae KPC-‐3<br />
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Time (h)<br />
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Log CFU/mL<br />
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Escherichia coli CTX-‐M<br />
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Time (h)
Log CFU/mL<br />
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Acinetobacter baumannii MDR CI1<br />
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Time (h)<br />
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Log CFU/mL<br />
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Pseudomonas aeruginosa ST-‐175 XDR<br />
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Time (h)
Log CFU/mL<br />
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Enterobacter cloacae CTX-‐M-‐15<br />
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Time (h)<br />
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Log CFU/mL<br />
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Enterococcus faecalis CC2<br />
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Time (h)
Una vez finalizadas las curvas de tiempo-muerte bacteriana, en las cepas en las que se observó<br />
<strong>actividad</strong> bactericida de <strong>Prontosan®</strong> a diferentes concentraciones y un posterior crecimiento<br />
bacteriano a las 24h, se determinó la CMI de las colonias recuperadas tras la exposición a<br />
<strong>Prontosan®</strong>. Las CMIs de todas las cepas estudiadas tras 24 horas de incubación con <strong>Prontosan®</strong><br />
fueron similares a las CMIs pre-exposición. Por consiguiente, no fueron detectadas colonias<br />
resistentes a <strong>Prontosan®</strong><br />
3.4 Curvas de crecimiento bacteriano<br />
En las figuras 2A a 2P, se representan las curvas de crecimiento bacteriano de las cepas<br />
expuestas a diferentes concentraciones de <strong>Prontosan®</strong> (0,25, 1, 4 y 8xCMI). La inhibición del<br />
crecimiento bacteriano se produce a 4xCMI en todas las cepas estudiadas, excepto para las<br />
cepas ATCC de S. aureus y E. cloacae, que se produjo a 8xCMI. La máxima concentración testada<br />
fue 16 mg/L, significativamente inferior a las concentraciones comercialmente utilizadas.
Enterococcus faecium ATCC 35667<br />
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OD 595nm<br />
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Tiime (h)<br />
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Staphylococcus aureus ATCC 25923<br />
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OD 595nm<br />
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Time (h)
Klebsiella pneumoniae ATCC 13883<br />
OD 595nm<br />
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Time (h)<br />
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OD 595nm<br />
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Escherichia coli ATCC 25922<br />
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Time (h)
Acinetobacter baumannii ATCC 19606<br />
OD 595nm<br />
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Time (h)<br />
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Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853<br />
OD 595nm<br />
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Time(h)
Enterobacter cloacae ATCC 13047<br />
OD 595nm<br />
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Time (h)<br />
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Enterococcus faecalis ATCC 29212<br />
OD 595nm<br />
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Time (h)
Enterococcus faecium VanB2<br />
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OD 595nm<br />
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Time (h)<br />
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Staphylococcus aureus MR CC5<br />
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OD 595nm<br />
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Time (h)
Klebsiella pneumoniae KPC-‐3<br />
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OD 595nm<br />
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Time (h)<br />
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Escherichia coli CTX-‐M<br />
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OD 595nm<br />
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Time (h)
Acinetobacter baumannii MDR CI1<br />
OD 595nm<br />
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Time (h)<br />
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Pseudomonas aeruginosa ST-‐175 XDR<br />
OD 595nm<br />
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Time (h)
OD 595nm<br />
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Enterobacter cloacae CTX-‐M-‐15<br />
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Time (h)<br />
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Enterococcus faecalis CC2<br />
OD 595nm<br />
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Time (h)
3.5 Test de dilución-neutralización<br />
Previamente a la realización del experimento, se validó el test de dilución-neutralización<br />
siguiendo los Estándares Europeos (PrEN 12054) 3 señalando que no se encontró <strong>actividad</strong><br />
bactericida destacable debido a la neutralización. Adicionalmente, se demostró que la<br />
neutralización inhibía la <strong>actividad</strong> bactericida de <strong>Prontosan®</strong>.<br />
Los resultados de los test muestran como <strong>Prontosan®</strong> presenta <strong>actividad</strong> bactericida bajo las<br />
condiciones descritas en el Estándar Europeo prEN12054, mostrando <strong>actividad</strong> bactericida en<br />
un 1 minuto de contacto con cada microorganismo ensayado (tabla 3):<br />
- Temperatura del test: 20ºC±1ºC<br />
- Concentración de producto testado: Sin diluir<br />
- Tiempo de contacto: 1 minuto<br />
- Procedimiento de recuento: siembra en placas<br />
- Temperatura de incubación: 37ºC±1ºC
Tabla 3. Test de diluciónneutralización de <strong>Prontosan®</strong> <strong>frente</strong> cepas estándares y<br />
clínicas.<br />
Log UFC/mL<br />
CEPA Grupo 1ª Rep 2º Rep 3ª Rep Media DE<br />
Enterococcus faecium<br />
ATCC 35667<br />
Staphylococcus aureus<br />
ATCC25923<br />
Klebsiella pneumonia<br />
ATCC 13883<br />
Escherichia coli<br />
ATCC 25922<br />
Acinetobacter baumannii<br />
ATCC 19606<br />
Pseudomonas aeruginosa<br />
ATCC 27853<br />
Enterobacter cloacae<br />
ATCC 13047<br />
Enterococcus faecalis<br />
ATCC 29212<br />
Enterococcus faecium<br />
Van B2<br />
Staphylococcus aureus<br />
MR CC5<br />
Klebsiella pneumoniae<br />
ST-512 KPC-3<br />
Escherichia coli<br />
CTX-M<br />
Acinetobacter baumannii<br />
MDR CI1<br />
Pseudomonas aeruginosa<br />
ST-175 XDR<br />
Enterobacter cloacae<br />
CTX-M-15<br />
Enterococcus faecalis<br />
CC2<br />
Control 5,98 6,09 6,15 6,07 0,09<br />
<strong>Prontosan®</strong>
3.6. Selección de cepas con sensibilidad reducida in vitro a <strong>Prontosan®</strong><br />
En el experimento con difusión en agar utilizando discos de papel impregnados con diferentes<br />
concentraciones de <strong>Prontosan®</strong>, no fue posible identificar mutantes resistentes ya que no se<br />
obtuvo zona de inhibición, posiblemente debido a la pobre difusión de <strong>Prontosan®</strong> en el agar.<br />
En el experimento con pases seriados en placas con concentraciones crecientes de <strong>Prontosan®</strong>,<br />
observamos que las cepas crecieron en las placas con concentraciones superiores a su CMI<br />
(tabla 4), aunque las CMI de las cepas que se recuperaban a esas concentraciones eran iguales a<br />
las obtenidas previamente a la exposición al biocida. Los resultados sugieren una tolerancia<br />
temporal a bajas concentraciones de <strong>Prontosan®</strong>, no observada a las concentraciones<br />
comerciales del producto.
Tabla 4. Crecimiento en placa con concentraciones crecientes de <strong>Prontosan®</strong><br />
CEPA<br />
CMI (mg/L)<br />
<strong>Prontosan®</strong><br />
Concentración máxima con<br />
crecimiento en placa (mg/L)<br />
CMI de <strong>Prontosan®</strong><br />
tras exposición<br />
Enterococcus faecium<br />
ATCC 35667<br />
Staphylococcus aureus<br />
ATCC25923<br />
Klebsiella pneumonia<br />
ATCC 13883<br />
Escherichia coli<br />
ATCC 25922<br />
Acinetobacter baumannii<br />
ATCC 19606<br />
Pseudomonas aeruginosa<br />
ATCC 27853<br />
Enterobacter cloacae<br />
ATCC 13047<br />
Enterococcus faecalis<br />
ATCC 29212<br />
Enterococcus faecium<br />
Van B2<br />
Staphylococcus aureus<br />
MR CC5<br />
Klebsiella pneumoniae<br />
ST-512 KPC-3<br />
Escherichia coli<br />
CTX-M<br />
Acinetobacter baumannii<br />
MDR CI1<br />
Pseudomonas aeruginosa<br />
ST-175 XDR<br />
Enterobacter cloacae<br />
CTX-M-15<br />
Enterococcus faecalis<br />
CC2<br />
2 8 1<br />
0,5 8 0,5<br />
0,5 8 0,5<br />
1 8 1<br />
4 64 2<br />
4 256 4<br />
0,5 64 0,5<br />
1 16 1<br />
2 8 2<br />
1 8 2<br />
2 32 2<br />
2 8 1<br />
4 64 2<br />
8 256 4<br />
2 32 1<br />
2 32 2
4. CONCLUSIONES<br />
1. <strong>Prontosan®</strong> muestra una elevada <strong>actividad</strong> bactericida <strong>frente</strong> a los patógenos<br />
<strong>multiresistentes</strong> <strong>nosocomiales</strong> más comunes a concentraciones significativamente<br />
inferiores que las utilizadas comercialmente.<br />
2. <strong>Prontosan®</strong> presenta una rápida <strong>actividad</strong> bactericida (1 minuto), tiempo muy inferior al<br />
recomendado por el fabricante (15 minutos).<br />
3. La selección de mutantes con sensibilidad reducida a <strong>Prontosan®</strong> no debe representar<br />
un problema in vivo tal como sugieren los resultados in vitro.
1) Clinical and Laboratory Standards Institute. 2007. Performance standards for<br />
antimicrobial susceptibility testing; 17th Informational supplement. CLSI document<br />
M100-S17. Clinical and Laboratory Standards Institute, Wayne, PA.<br />
2) EN 1040: 1997 E. Chemical disinfectants and antiseptics. Basic bactericidal activity.<br />
Test method and requirements (phase 1). European Committee for Standardization<br />
(CEN).<br />
3) PrEN 12054: 1995 E. Chemical disinfectants and antiseptics. Products for hygienic<br />
and surgical handrub and handwash. Bactericidal activity. Test method and<br />
requirements (phase 2, step 1). European Committee for Standardization (CEN).<br />
4) Kumiko Kawamura-Sato, Jun-ichi Wachino, Takaaki Kondo, Hideo Ito and<br />
Yoshichika Arakawa. Reduction of disinfectant bactericidal activities in clinically<br />
isolated Acinetobacter species in the presence of organic material. Journal of<br />
Antimicrobial Chemotherapy (2008) 61; 568!576.