Tècnicas de histoquimica ,IHQ y utilidad diagnostica en patologÃa ...
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Técnicas <strong>de</strong> Histoquímica e Inmunohistoquímica<strong>en</strong> Patología Neuromuscular: <strong>utilidad</strong>diagnósticaSoraya Barrera Cabañeros ( TEAP)Servicio <strong>de</strong> Anatomía Patológica y Neuropatología. Hospital MeixoeiroComplexo Hospitalario Universitario <strong>de</strong> Vigo – CHUVIInstituto <strong>de</strong> Investigación Biomédica <strong>de</strong> Vigo
¿QUÉ SON LAS ENFERMEDADESNEUROMUSCULARES?• Son <strong>en</strong>fermeda<strong>de</strong>s crónicas <strong>de</strong> evolución variable• La mayoría son <strong>de</strong> orig<strong>en</strong> g<strong>en</strong>ético y algunas adquiridas• Se caracterizan por <strong>de</strong>bilidad muscular, miotonía,calambres…• Afectan al SNC, SNP, unión n-m y fibra muscular• Pue<strong>de</strong>n afectar a otros órganos• Su aparición pue<strong>de</strong> ser <strong>en</strong> cualquier etapa <strong>de</strong> la vida
SARCÓMERO: Unidad contráctil <strong>de</strong>l músculo
Enfermeda<strong>de</strong>s Neuromusculares
Biopsia muscular+Historia clínicaDatos paraclínicosDisección - Ori<strong>en</strong>taciónLaboratorio MiopatologíaM/EInmunogoldCongelaciónBanco <strong>de</strong> TejidosCortes criostatoExtracción <strong>de</strong> DNABanco <strong>de</strong> DNAHistoquímicaInmunohistoquímicaMicroscopía ConfocalWbBioquímicaPCR multiplexRFLPSecu<strong>en</strong>ciaciónOtrasDIAGNÓSTICOConsejo g<strong>en</strong>ético
250-300 biopsias <strong>de</strong> músculo y nervio/año(85% <strong>de</strong> la Comunidad Gallega)
MorfologíaHistoquímicaInmunohistoquímicaEstudio <strong>de</strong> proteínasMicroscopía electrónicaEstudio g<strong>en</strong>éticoEstudio bioquímico
ALTERACIONES MORFOLÓGICAS BÁSICAS ITAMAÑO Y FORMA• Fibras atróficas, anguladas o no• Fibras hipertróficas• Fibras hipercontraídas• Fibras redon<strong>de</strong>adas• Figuras <strong>de</strong> “splitting”NÚCLEOS• Múltiples• Internalizados• Agregados (“clumps”nucleares)
ALTERACIONES MORFOLÓGICAS BÁSICAS IICITOPLASMA• Deg<strong>en</strong>eración – necrosis• Miofagia• Vacuolización: lípidos, glucóg<strong>en</strong>o, vacuolas autofágicas• Invasión parcialESPACIO EXTRACELULAR• Infiltrados inflamatorios• Fibrosis• Sustitución adiposa
TRICRÓMICO DE GOMORI(Modificado por Engel y Cunningham, 1963) Patrón intermiofibrilar Mitocondrias (RRF) Bastones nemalínicos Cuerpos citoplásmicos Retículo sarcoplásmico Vacuolas autofágicas
Fibras(“ragged red fibers”)Bastones nemalínicosVacuolas ribeteadas
TÉCNICAS HISTOQUÍMICAS1- Valorar el exceso <strong>de</strong> un sustrato <strong>de</strong>terminado:glucóg<strong>en</strong>o, lípidos2- Mostrar cambios estructurales no visibles contécnicas histológicas3- Evaluar los tipos <strong>de</strong> fibras musculares:1, 2A, 2B, 2C4- Aus<strong>en</strong>cia <strong>de</strong> un <strong>en</strong>zima <strong>de</strong>terminado
OIl REDGotas lipidicas, lipofucsinaPASTipos <strong>de</strong> fibrasGlucóg<strong>en</strong>o (lisosomal, libre)
HISTOQUÍMICA. PRINCIPIOS BÁSICOS IVENZIMAS OXIDATIVAS• NADH (Nicotinamida a<strong>de</strong>ninadinucleótido)– Patrón intermiofibrilar:• Retículo sarcoplásmico• Mitocondrias• SDH (Succino-Deshidrog<strong>en</strong>asa)– Mitocondrias• COX-SDH (Citocromo oxidasa )– Mitocondrias
NADHC<strong>en</strong>tral coreFibras apolilladasTargetsFibras anulares
Miopatía mitocondrialSDHCOX-SDHHEGomori
Miopatía por agregados tubularesHETRINADHSDH
ATP-asas9.4 4.6Fibrastipo 1Fibrastipo 2aFibrastipo 2bFibrastipo 2cATPasa9.4ATPasa4.63ATPasa4.35MarrónclaroMarrónoscuroMarrónoscuroMarrónoscuroBlancasMarrónoscuroMarrónclaroMarrónoscuroMarrónclaroBlancas Blancas Marrónclaro4.3
Atrofia por <strong>de</strong>nervación4.3
Atrofia neuróg<strong>en</strong>a
HEPASMiofosforilasaMiofosforilasa
Mioa<strong>de</strong>nilato DesaminasaCONTROL (MAD+)MAD NEGATIVOMiopatía por déficit <strong>de</strong> MAD
INMUNOHISTOQUÍMICA• Permite visualizar y localizar proteínas específicas déficit primario déficit secundario• Debe valorarse conjuntam<strong>en</strong>te con las técnicashistológicas e histoquímicas
Guillaume- B<strong>en</strong>jaminAmand Duch<strong>en</strong>ne(1806-1875)1868: Paralysie pseudo-hypertrophique,or myosclerotique, <strong>de</strong> l’Enfance(Archives Générales <strong>de</strong> Mé<strong>de</strong>cine)
ANTICUERPOS• Espectrina• Distrofina (Dys 1, 2 y 3)• DRP1• DRP2• Alfa-SG• Beta-SG• Gamma-SG• Delta-SG• Alfa-DG• Beta-DG• Disferlina• Calpaína 3• Merosina• Alfa2-laminina• Emerina• LAMP2• Caveolina• Miotilina• Miosina (slow, fast)• Troponina PGP 9.5• Colág<strong>en</strong>o VI• Notch 3• Serie linfoi<strong>de</strong>, <strong>de</strong>smina,marcadores vasculares,actina, etc
Duch<strong>en</strong>neDistrofinaEspectrinaUtrofina (DRP2, Control)Utrofina
BeckerDystrophinDRP
CMDMerosinSpectrin
Emery DreyfussEmerinEmerin, Control
Emery DreyfussEmerina, ControlEDMDEmerina, ControlEDMD
-DISTROGLICANOControlAntibody: clon VIA4 (glycosylated epytope)
INMUNOHISTOQUÍMICADIFICULTADES DE INTERPRETACIÓN Y SOLUCIONES• Interacción <strong>de</strong> varias proteínas (distrofina-sarcoglicanos;disferlina-otras)• Pue<strong>de</strong>n obt<strong>en</strong>erse falsos resultados si se usa un únicoanticuerpo• La aus<strong>en</strong>cia <strong>de</strong> una proteína pue<strong>de</strong> dar lugar a lasobreexpresión <strong>de</strong> otras (distrofina y dystrophin-relatedprotein)• Las proteínas nucleares se expresan <strong>en</strong> cualquier tipo<strong>de</strong> célula (emerina, lamina A/C)
PRINCIPIOS PARA EL MANEJO DE LAS MUESTRAS• LA MUESTRA DEBE SERVIR PARA TODOS LOS ESTUDIOS• CUALQUIER MUESTRA DEBE PODER RETOMARSE EN ELFUTURO (Bancos <strong>de</strong> tejidos y ADN)