SYPHILIS SCREENING Recombinant EIA WELL REF ... - Radim S.p.A.

SYPHILIS
SCREENING
Recombinant
REF KH6
EIA WELL
192
M307.es – Rev. 4 – 01/2008

REACTIVOS DEL KIT
Reactivos Cantitad
MTP 2 x 96 Listo para usar.
WASH│10X 1 x 100 mL Concentrado.
NEG 1 x 1.5 mL Listo para usar.
POS 1 x 1.5 mL Listo para usar.
CONJ 2 x 15 mL Listo para usar.
SUBS 3 x 12 mL Listo para usar.
STOP 2 x 16 mL Listo para usar.
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ENSAYO INMUNOENZIMÁTICO PARA LA DETERMINACIÓN
CUALITATIVA DE LOS ANTICUERPOS TOTALES ANTI-TREPONEMA
PALLIDUM EN SUERO O PLASMA HUMANO
SÓLO PARA EL DIAGNÓSTICO IN VITRO
1. APLICACIONES CLÍNICAS
La sífilis o lúes es una enfermedad infecciosa crónica cuyo agente etiológico
es la espiroqueta Treponema pallidum. Esta infección sistémica se
caracteriza por largos periodos asintomáticos, frecuentemente de más de 20
años.
T. pallidum es difícil de aislar en cultivos. Por lo anterior los métodos
serológicos para detectar anticuerpos específicos IgG e IgM tienen un papel
esencial en el diagnóstico de sífilis.
Durante la fase primaria de la infección los anticuerpos tipo IgM son los
primeros en aparecer, mientras que los del tipo IgG alcanzan títulos
significativos sólo hasta el final de esta fase primaria (1). En la fase
secundaria de la enfermedad los títulos de ambos anticuerpos, IgG e IgM,
tienden a encontrarse elevados. Posteriormente los anticuerpos específicos
IgG pueden persistir durante toda la vida independientemente del curso que
tome la enfermedad, mientras que los niveles en el suero de IgM anti-T.
pallidum variarán de acuerdo con el desarrollo de la enfermedad (2,3,4,5).
Un tratamiento adecuado puede producir una disminución de los títulos de
IgM específica, y en algunos casos incluso alcanzar su negativización.
2. PRINCIPIO DEL MÉTODO
Este kit se basa en un método inmunoenzimático (ELISA) de tipo sandwich,
para la detección cualitativa de anticuerpos totales (IgG + IgM) contra T.
pallidum.
Durante la incubación los anticuerpos anti-T. pallidum (si están presentes en
la muestra) se ligan simultáneamente al antígeno adherido a la superficie de
los micropocillos y al antígeno conjugado con peroxidasa (HRPO), formando
un complejo antígeno-anticuerpo-antígeno-HRPO (sándwich).
Tras el lavado, para eliminar el conjugado enzimático no ligado, se mide la
actividad enzimática de la peroxidasa a través de un Substrato específico
(tetrametilbencidina, TMB). La reacción de desarrollo de color se para
añadiendo una solución bloqueadora y la intensidad del color, medida en un
espectrofotómetro a 450 nm, es proporcional a la concentración de los
anticuerpos totales anti-T. pallidum en la muestra.
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3. REACTIVOS SUMINISTRADOS CON EL KIT: PREPARACIÓN Y
ESTABILIDAD
− Los reactivos son suficientes para 192 tests.
− Almacenar el kit a 2-8°C.
− La fecha de caducidad de cada reactivo está indicada en su etiqueta.
MTP Microplaca sensibilizada: 2 x 96 pocillos separables
individualmente, recubiertos con antígeno recombinante de T.
pallidum. Usar todo el contenido de la bolsa dentro de las 8
semanas siguientes a su apertura. Los pocillos no utilizados
deben conservarse a 2-8°C en la bolsa de polietileno (estuche
de la microplaca) bien sellada.
Leer cuidadosamente la sección ADVERTENCIAS Y
PRECAUCIONES.
NEG Control Negativo: 1 vial (1.5 mL) de suero de ternera.
Conservantes: Bronidox (0.02%) y Fenol (0.05%). Listo para
usar. Una vez abierto, se mantiene estable durante 1 semana
si se conserva a temperatura ambiente.
POS Control Positivo: 1 vial (1.5 mL) de suero humano diluido en
solución protéica estabilizada conteniendo anticuerpos anti-T.
pallidum. Listo para usar. Una vez abierto, se mantiene
estable durante 1 semana si se conserva a temperatura
ambiente.
CONJ Conjugado Enzimático: 2 viales (15 mL) conteniendo
proteínas recombinantes de T. pallidum conjugadas con
peroxidasa de rábano (HRPO) en tampón fosfato.
Conservantes: Bronidox (0.02%) y Fenol (0.05%). Listo para
usar. Una vez abierto, se mantiene estable durante 1 semana
si se conserva a temperatura ambiente.
WASH│10x Solución de lavado (concentrada): 1 vial (100 mL) de PBS
conteniendo: BRIJ (0.5%). Antes de usar, diluir la cantidad
necesaria 1:10 con agua destilada. Tras su dilución, el
tampón de lavado es estable 5 días a temperatura ambiente o
dos semanas a 2-8°C. En caso en que haya cristales no
disueltos, resuspenderlos poniendo el vial a 37°C durante
algunos minutos. (INTERCAMBIABLE ENTRE LOTES)*
SUBS Tampón Substrato: 3 viales (12 mL) de tetrametilbencidina
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(TMB) y H2O2 en tampón citrato. Listo para usar. Una vez
abierto, se mantiene estable hasta la fecha indicada en la
etiqueta si se conserva a 2-8°C, o 1 semana a 18-25°C.
Almacenar en la oscuridad. (INTERCAMBIABLE ENTRE
LOTES)*
STOP Reactivo bloqueador: 2 viales (16 mL) de H2SO4 0.3M. Listo
para usar. (INTERCAMBIABLE ENTRE LOTES)*
CPA Cubreplaca adhesivo.
Estuche de plástico con cierre minigrip.
* La Solución de Lavado, el Tampón Substrato y el Reactivo
bloqueador pueden utilizarse también con los kits EBV Radim, siendo
reactivos comunes.
4. MATERIAL NECESARIO NO SUMINISTRADO
4.1 Ensayo Manual
− Micropipetas automáticas ajustables con puntas desechables.
− Incubador a 37°C.
− Cilindros graduados de 500 mL para la dilución de los reactivos.
− Bomba de aspiración o dispositivo de lavado de microplacas automático.
− Espectrofotómetro de precisión para la lectura de las microplacas a 450
nm.
− Agua destilada.
4.2 Ensayo Automático
− Este ensayo puede utilizarse con instrumentación automática para kits
ELISA en microplaca.
− Se garantiza su aplicabilidad en instrumentos RADIM y/o SEAC.
− En el caso se utilice instrumentación automática de otros fabricantes, es
responsabilidad del usuario, asegurarse de que el kit haya sido
oportunamente validado.
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5. ADVERTENCIAS Y PRECAUCIONES
Para conseguir resultados correctos y reproducibles, deberán
observarse las siguientes normas:
− No mezclar los reactivos específicos de lotes distintos, a menos que así
sea indicado.
− No utilizar los reactivos después de su fecha de caducidad.
− No exponer los reactivos y las muestras al calor intenso ni a fuentes de
contaminación.
− Utilizar material de vidrio perfectamente limpio y libre de contaminación
por iones metálicos o sustancias oxidantes.
− Utilizar agua destilada o desionizada, almacenada en recipientes
perfectamente limpios.
− Evitar cuidadosamente la contaminación entre muestras; para ello es
aconsejable utilizar pipetas con puntas desechables para cada muestra y
reactivo.
− No modificar en ninguna forma el “Procedimiento Operativo” de ejecución
del ensayo. Eventuales alteraciones de:
• secuencia y cantidad al añadir los reactivos
• tiempos y temperatura de incubación
pueden dar lugar a resultados clínicos erróneos.
− En caso de procedimiento manual, es importante utilizar pipetas
calibradas y tener una adecuada manualidad técnica. En particular es
importante la precisión en la preparación y dispensación de los reactivos.
Es necesario un adecuado mantenimiento (limpieza y calibración) de
tales instrumentos.
− Asegurarse de que todo el equipo usado (material de vidrio, incubador,
lavador de placas, espectrofotómetro y refrigerador para la conservación
del kit y de las muestras) funcione perfectamente, esté adecuadamente
calibrado y se someta a un programa de mantenimiento regular. El uso
no cuidadoso de estos instrumentos puede provocar errores en la
metodología que afectarían la reproducibilidad y confiabilidad de los
resultados obtenidos.
− Utilizar un método adecuado para la correcta identificación de las
muestras. La identificación incorrecta puede provocar una pérdida de
especificidad del sistema y resultados analíticos erróneos.
Para evitar contaminaciones personales y ambientales, deberán
observarse las siguientes normas de seguridad:
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− Utilizar guantes desechables durante la manipulación del material
potencialmente infeccioso y durante el ensayo.
− No pipetear los reactivos con la boca.
− No fumar, comer, beber o aplicar cosméticos durante la ejecución del
ensayo.
− Manejar con cuidado las soluciones de Substrato y Reactivo Bloqueador.
Evitar el contacto con la piel, los ojos y las membranas mucosas. En caso
de accidente lavar con abundante agua.
− Todos los materiales de origen humano utilizados en la preparación del
kit han sido sometidos a análisis resultando repetidamente negativos a la
presencia de HBsAg, anti-HIV y anti-HCV. Sin embargo, los ensayos
mencionados no garantizan la total ausencia de los agentes vírales
responsables del síndrome de inmunodeficiencia adquirida y de la
hepatitis B y C. Por eso todos los reactivos conteniendo material
biológico y todas las muestras de suero humano deben considerarse
potencialmente infecciosos.
− Evitar salpicaduras y formación de aerosoles; en caso de que se
produzcan, limpiar cuidadosamente con hipoclorito sódico a una
concentración final de 3%. Todo el material utilizado para la limpieza
debe tratarse como residuo potencialmente infeccioso y desecharse
según las oportunas modalidades.
− De acuerdo con el Decreto Italiano D.L. no. 22, del 05.02.97 y de
conformidad con las directivas de la CEE (91/156/CEE, 91/689/CEE,
94/62/CEE), todos los desechos originados por procesos manuales y/o
automáticos se clasifican como material de deshecho peligroso, código
de Clasificación CER 180103: como tales, deben eliminarse delegando
su recolección y desecho a empresas especiales, autorizadas para ello.
6. TOMA Y PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS
El ensayo puede realizarse en muestras de suero o plasma humano. Las
muestras extremadamente lipémicas o hemolizadas deben descartarse. Las
muestras correctamente almacenadas a 2-8°C pueden conservarse por un
máximo de 7 días; para períodos más largos se recomienda conservar las
muestras a -20°C. Las muestras de plasma pueden presentar filamentos de
fibrina que interfieren en el ensayo. Asegurarse de que las muestras estén
perfectamente límpidas antes de ensayarlas. Evitar repetidos ciclos de
congelamiento-descongelamiento de las muestras.
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7. PROCEDIMIENTO OPERATIVO
- Esperar que los reactivos y las muestras alcancen la temperatura
ambiente.
- Agitar las muestras por inversión antes de utilizarlas.
7.1. Preparar los pocillos por duplicado para los Controles negativo y
positivo y un pocillo individual para el Blanco.
7.2. Dispensar 30 µL de Control Negativo, Control Positivo y de cada
muestra en los respectivos pocillos.
7.3. Dispensar 100 µL de Conjugado Enzimático en todos los pocillos
(excepto el Blanco) y agitar bien.
7.4. Cubrir la microplaca con la hoja adhesiva incluida en el kit e incubar
durante 30±5 minutos a 37°C.
7.5. Lavar los pocillos 4 veces con 350 µL (por pocillo) de la Solución de
Lavado diluida. Aspirar completamente el líquido de todos los pocillos.
7.6. Dispensar 100 µl de Substrato en todos los pocillos.
7.7. Incubar durante 10±2 minutos a temperatura ambiente.
7.8. Dispensar 100 µL del Reactivo Bloqueador en todos los pocillos.
7.9. Leer la densidad óptica de las soluciones a 450 nm preferentemente
en un espectrofotómetro bicromático, con longitud de onda de
referencia de 620 nm (poniendo a cero el instrumento con el Blanco).
Leer en los primeros 30 minutos después de terminar el ensayo.
En caso de que se utilice en el procedimiento un sistema automático RADIM
y/o SEAC para microplacas, ver el manual correspondiente.
8. ESQUEMA DEL ENSAYO: ver pág. 14
9. CÁLCULO DE LOS RESULTADOS
Al usar instrumentos automáticos RADIM y/o SEAC para microplacas, la
lectura espectrofotométrica se realiza automáticamente con 3 longitudes de
onda: 450, 405 y 620 nm, permitiendo la ampliación del rango de lectura.
Valor medio del Control Negativo: Calcular la densidad óptica media del
Control Negativo.
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Valor medio del Control Positivo: Calcular la densidad óptica media del
Control Positivo.
Valor umbral – Interpretación de los Resultados:
(Valor medio del Control Negativo + Valor medio del Control Positivo) / 3.
Comparando las absorbancias de las muestras con el cut-off (valor umbral)
se determina la presencia o ausencia de anticuerpos totales anti-T. pallidum.
Las muestras con absorbancia superior al valor umbral deben considerarse
reactivas para anticuerpos anti- T. pallidum. Las muestras con absorbancia
igual o inferior al valor umbral deben considerarse no reactivas para
anticuerpos anti-T. pallidum.
9.1 Control de los valores esperados
Antes de proceder al cálculo de los resultados, verificar que las
absorbancias de los Controles negativo y positivo respeten los siguientes
criterios:
Valor medio del Control negativo ≤ 0.200
Valor medio del Control positivo ≥ 0.600
Si los valores obtenidos no respetan estos criterios, será necesario repetir el
ensayo.
9.2 Ejemplo de cálculo
Los valores siguientes deben considerarse únicamente como un ejemplo y
no deben emplearse en lugar de los datos obtenidos en el ensayo.
− Valor medio del Control negativo: (0.120 + 0.100)/2 = 0.110
− Valor medio del Control positivo: (1.280 + 1.260)/2 = 1.270
− Valor umbral: (0.110 + 1.270)/3 = 0.460
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10. CARACTERÍSTICAS METODOLÓGICAS
10.1 ESPECIFICIDAD ANALÍTICA
La especificidad analítica se estudió analizando muestras conteniendo
factores potencialmente interferentes como anticuerpos anti-nucleares EBV,
anticuerpos heterófilos, anticuerpos anti-Borrelia, Factor Reumatoideo (de
40 a 1080 Ul/mL), triglicéridos (

Reproducibilidad (interensayo)
Ensayos efectuados en 5 series distintas:
Muestra Control Control
Negativo Positivo
Media 0.098 1.888
CV% 5.37 10.41
11. LIMITACIONES DEL ENSAYO
El test no discrimina los anticuerpos IgG de los anticuerpos IgM.
12. LEYENDA DE SÍMBOLOS: ver pág. 12
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REF
LOT Lote
IVD
192
RDATE
RCNS
H2O
SÍMBOLOS
EN 980 – EDMA
Referencia o número de pedido
Fecha de caducidad
Para uso diagnóstico in-vitro
Marcado CE según directiva de IVD 98/79/CE
Conservar a 2-8°C
Fabricante
Riesgo biológico
Consultar las instrucciones de uso
Suficiente para 192 determinaciones
Fecha de referencia
Reconstituir con
Agua destilada o desionizada
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BIBLIOGRAFÍA
1. S.J. Norris: Polypeptides of Treponema pallidum: progress toward
understanding their structural, functional and immunologic roles.
Microbiological Reviews, 1993.
2. P.A. Hanff et al.: Humoral immune response in human syphilis to
polypeptides of Treponema pallidum. J. Immunology 129: 1287 (1982).
3. L. Lewis et al.: Evaluation of immunoglobulin M Western blot analysis in
the diagnosis of congenital syphilis. J. Clin. Microbiol. 28: 296 (1990).
4. H. Young et al.: Enzywell recombinant enzyme immunoassay for the
serological diagnosis of syphilis. Int. J. STD and AIDS. 11: 288-291
(2000).
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M307.es – Rev. 4 -01/2008 Pag. 13/14

ESQUEMA DEL ENSAYO
Pocillos Blanco NEG POS Muestras
Reactivos
NEG ----- 30 µL
POS ----- ----- 30 µL -----
Muestras ----- ----- ----- 30 µL
CONJ ----- 100 µL 100 µL 100 µL
− Incubar: 37°C, 30±5 minutos.
− Lavar y aspirar: 4 x 350 µL.
SUBS 100 µL 100 µL 100 µL 100 µL
− Incubar: T.A., 10±2 minutos.
STOP 100 µL 100 µL 100 µL 100 µL
− Leer: 450 nm.
RADIM S.p.A. - Via del Mare, 125 - 00040 Pomezia (Roma) Italia
Tel.: +39 06 91.249.1 - Fax: +39 06 91.249.443
National Order Entry: +39 06 91.249.702
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Customer Care: +39 06 91.249.700
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