O papel modulador do gene AIRE - capes

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Remerciements spéciauxMoi même et mon directeur de thése, le Professeur GeraldoPassos, nous voudrions remercier vivement toute l’ Équipe de recherche‘ Technologies Avancées pour le Génome et la Clinique (TAGC) URM206de l’ Institut National de la Santé et la Recherche Médicale (INSERM) deMarseille, France, en particulier le Docteur Catherine Nguyen parl’accueil au sein de cette Équipe et pour l’orientation scientifique en cequi concerne l’importance du thymus.Je voudrais aussi remercier Beatrice Loriod, Nicolas Boulanger,Murielle Saade, Geneviève Victorero et Docteur Denis Puthier par touteaide et amitié accordées.Finalement nous sommes très reconnaissants aux Instituitionsbrésiliennes et françaises suivantes ; Université de São Paulo, FAPESP,CNPq, INSERM et Université de Marseille, Campus de Luminy.Je vous en remercie !!!Claudia Macedo
ÍndiceRESUMO ..........................................................................................................................iABSTRACT .....................................................................................................................ii1. INTRODUÇÃO .......................................................................................................... 21.1. A maturação e o papel das células tímicas epiteliais medulares (mTECs) 21.1.1. Ontogenia do timo .......................................................................................... 21.1.2. Estrutura do timo ........................................................................................... 41.1.3. Migração das células precursoras linfóides para o timo ................................. 81.1.4. Maturação dos timócitos em células T............................................................ 91.1.5. As células medulares epiteliais tímicas (mTECs)......................................... 141.2. Expressão gênica promíscua no timo e a indução de tolerância central... 181.3. O papel do gene Autoimmune regulator (Aire)........................................... 231.4. Testando a hipótese da ação indireta do gene Aire: Construção de redesgênicas a partir de dados de microarrays ............................................................ 262. HIPÓTESES............................................................................................................... 323. OBJETIVOS ............................................................................................................... 344. MATERIAL E MÉTODOS ...................................................................................... 364.1. Linhagem celular mTEC 3.10 (células tímicas epiteliais medulares) ....... 364.2. Inibição seletiva do transcrito do gene Aire com RNA interferente(RNAi). ...................................................................................................................... 384.2.1. Determinação da seqüência de RNAi anti-Aire. .......................................... 384.2.2. Silenciamento do transcrito do gene Aire em cultura de células mTEC 3.10. .. 404.3. Extração de RNA total...................................................................................... 414.3.1. Quantificação de RNA total ......................................................................... 434.4. Eletroforese de RNA total em gel denaturante (Sambrook et al., 1989) ... 444.4.1. Preparação do gel .......................................................................................... 444.4.2. Preparação das amostras de RNA................................................................. 444.5. PCRs semi-quantitativas para os genes Aire e HPRT. ................................ 454.6. Preparação de cDNA microarrays em lâminas de vidro ............................ 454.6.1. Biblioteca de cDNAs murinos ...................................................................... 454.6.2. Amplificação de cDNA para a confecção de microarrays ............................. 464.6.3. Purificação dos produtos de PCR ................................................................. 474.6.4. Confecção das lâminas de microarrays ......................................................... 484.7. Delineamento das hibridações em microarrays ........................................... 494.8. Marcação das sondas complexas de cDNA com fluorocromos CY3 e CY5.............. 52
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227coincided (CBA/J) with expressio
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