O papel modulador do gene AIRE - capes

MATERIAL E MÉTODOSprocesso de hibridação.4.9. Hibridação das lâminas de microarraysAs lâminas de microarrays foram hibridadas utilizando umprocessador automático de lâminas, “Lucidea Automated Slide Processor”–ASP (Amersham Biosciences) que permite a hibridação e lavagens delâminas em câmaras independentes (12 lâminas por vez). Este aparelhoinclui um software que automatiza a injeção de amostras líquidas esoluções de lavagens ou ar dentro das câmaras e possui parâmetros decontrole de temperatura e velocidade de injeção e circulação destassoluções no interior das mesmas.As lâminas foram hibridadas por 15 horas a 42°C. As condições delavagens foram: 1XSSC/0,2%SDS (2 x 20 seg. à temperatura ambiente);0,1X SSC/0,2% SDS (2 x 20 seg. à temperatura ambiente); 0,1X SSC (2 x 20seg. à temperatura ambiente). A última lavagem das lâminas foi feita comisopropanol, sendo em seguida aquecidas a 42°C, e novamente lavagemcom isopropanol. Após as lavagens as lâminas foram aquecidas a 60°Cpara secagem. As lâminas estavam prontas para serem “lidas” emaparelho “scanner” a laser.4.10. Aquisição de imagens de microarraysAs lâminas foram lidas num aparelho Generation III “ArrayScanner” (Amersham Biosciences) com lasers de 532nm para o Cy3(verde) e 633 nm para o Cy5 (vermelho). A leitura da lâmina gera doisarquivos com imagens separadas com os pontos em preto para os dois58