O papel modulador do gene AIRE - capes

MATERIAL E MÉTODOScentrifugação foi feita a 13800 xg por 10 segundos para retirada doexcesso da solução “wash buffer” da amostra. O tubo coletor foidescartado e a coluna contendo o cDNA foi colocada em um tubo de 1,5µl. Foi adicionado a coluna 60 µl da solução “elution buffer” pré-aquecidoà 65°C e incubado durante 5 minutos. O material foi centrifugado a 13800xg por 1 minuto.e) Quantificação do CyDye incorporado no cDNAApós a purificação foi feita a monitoração de incorporação dosfluorocromos por meio de leitura em espectrômetro (Ultrospec 2100, GEHealthcare) em comprimento de onda a 550 nm para Cy3 e 650 nm para oCy5 usando amostras diluídas 100X. A quantidade de Cy3 ou Cy5incorporados no cDNA pode ser calculada através do seu coeficiente deextinção molar 150 000 l mol –1 cm -1 para Cy3 e 250 000 l mol –1 cm -1 paraCy5. As proporções de Cy3 e Cy5 incorporados no cDNA foramcalculados pela fórmula: (A)/E x Z x fator de diluição x 10 12 , onde:A= absorbância de Cy3 a 550 nm ou Cy5 a 650 nmE= coeficiente de extinção para Cy3 ou Cy5 x 10 -6Z= volume (µl) da sonda após purificaçãoPara hibridações com os dois fluorocromos foram adicionados oscDNA marcado com Cy3 e Cy5 em um tubo de microcentrífugaprotegido da luz. A solução de cDNA foi concentrada no aparelho “SpeedVacum”. A seguir o cDNA foi dissolvido em 6 µl de água livre denuclease e desnaturado a 95°C por 2 min. A solução foi imediatamenteresfriada no gelo por 30 seg. A essa reação adicionamos 1,5 µl de A80(1mg/ml) e incubamos a 75 °C por 45 min, estando assim pronta para o57