O papel modulador do gene AIRE - capes

MATERIAL E MÉTODOSlavagem foi repetida mais duas vezes. Uma nova centrifugação foi feita a13800 xg por 10 seg. para retirada do excesso de etanol 80% da amostra. Otubo coletor foi descartado e a coluna contendo o cDNA foi colocada emum tubo de 1,5 µl. Foi adicionada a coluna 60 µl de bicarbonato de sódio0,1 M pH 9,0 e incubado durante 5 minutos. O material foi centrifugado a13800 xg por 1 min.c) Incorporação de Cy3 e Cy5A amostra de cDNA marcada com aminoalil purificado foiadicionada a um tubo com a alíquota de CyDye NHS éster eressuspendida várias vezes. O material foi centrifugado a 13800 xg por 1min e incubado, no escuro, durante 1 hora. Posteriormente, foiadicionado 15 µl de hidroxilamina 4M seguida de incubação no escuro,durante 15 min a temperatura ambiente.d) Purificação do cDNA marcado com CyDye com colunas de purificaçãoCyScribe GFXPara cada amostra de cDNA com volume entre 20 a 100 µl foramadicionados 500 µl de solução “capture buffer” em uma coluna depurificação GFX colocada dentro de um tubo coletor. O produto decDNA marcado com CyDye não purificado foi adicionado à coluna emisturado 5 vezes. A centrifugação foi feita a 13800 xg por 30 segundos.A coluna foi retirada e o líquido contido no tubo coletor foi descartado. Acoluna foi novamente colocada no tubo coletor e foram adicionados 600µl da solução “wash buffer”. A centrifugação foi feita a 13800 xg por 30segundos. A coluna foi retirada e o líquido contido no tubo coletor foidescartado. Esta lavagem foi repetida mais duas vezes. Uma nova56