O papel modulador do gene AIRE - capes

MATERIAL E MÉTODOSa) Preparação da primeira fita de cDNA por incorporação de AAdUTPEm um tubo Eppendorf de 1,5 µl imerso em gelo picado foramadicionados 10 µg de RNA total, 1 µl de primers randômicos, 3 µl de oligo(dT) e 0,5 µl de controle denominado “spike mix” para o UniversalScoreCard em um volume total de 11 µl (Proporção de 2 µl de spike mixpara cada 1 µg de RNA marcado). A reação foi cuidadosamente montadae incubada a 70°C por 5 min, sendo posteriormente resfriada a 4°Cdurante 5 min. A extensão da cadeia de cDNA foi realizada utilizando 4µl de tampão 5X CyScript , 2 µl de DDT 0,1 M, 1µl de nucleotídeo “mix”,1µl de AA-dUTP (a quantidade de um tubo contendo AA-dUTPliofilizado foi ressuspenso em 30 µl de água livre de nucleases e mantidoa -20°C por no máximo 30 dias), 1 µl de transcriptase reversa CyScript, emum volume final de reação de 20 µl. A reação foi incubada a 42°C por 1,5hora. Procedemos à degradação do RNAm adicionando 2 µl de NaOH 2.5M com incubação a 37°C durante 15 min, posteriormente foi adicionado20 µl de HEPES 2M.b) Purificação do cDNA com colunas de purificação CyScribe GFXPara cada amostra de cDNA com volume entre 20 a 100 µl foramadicionados 500µl de solução “capture buffer” em uma coluna depurificação GFX colocada dentro de um tubo coletor. O produto decDNA marcado com aminoalil não purificado foi adicionado à coluna emisturado 5 vezes. A centrifugação foi feita a 13800 xg por 30 seg. Acoluna foi retirada e o líquido contido no tubo coletor foi descartado. Acoluna foi novamente colocada no tubo coletor e foram adicionados 600µlde etanol 80%. A centrifugação foi feita a 13800 xg por 30 seg. A colunafoi retirada e o líquido contido no tubo coletor foi descartado. Esta55