O papel modulador do gene AIRE - capes

MATERIAL E MÉTODOSAs hibridações com cDNAs oriundos de RNA referência sãoimportantes para os cálculos de normalização, pois reflete a estimativa daquantidade de material depositado em cada ponto do microarray (alvo).4.8. Marcação das sondas complexas de cDNA com fluorocromos CY3 eCY5Amostras de RNA foram convertidas a cDNA e marcadasutilizando o Kit CyScribe Post-Labelling (GE Healthcare -Buckinghamshire, UK) que envolve a preparação e adequação do cDNAem dois passos. No primeiro passo ocorre a síntese da primeira fita decDNA com a incorporação de nucleotídeos amino- alil dUTPmodificados, com posterior degradação da cadeia de RNAm e purificaçãodo cDNA para remoção de nucleotídeos livres e oligômeros (figura 8). Nosegundo passo, o cDNA é marcado com formas reativas de ésteres NHSCy3 e Cy5 que se ligam aos nucleotídeos modificados e após um processode purificação para eliminação dos CyDye não incorporados a sonda estápronta para hibridação (figura 9).52