O papel modulador do gene AIRE - capes

MATERIAL E MÉTODOS6 hibridaçõesA B CA’ B’ C’1) Troca de fluorocromos (dye swap)C’A6 hibridações CA’2) Experimentos em volta (looping)B’BA B C6 hibridaçõesR R RA’ B’ C’3) Amostra de referência (RNA de referência)R R RFigura 7. Esquema dos principais tipos de delineamento experimental para microarrays.A, B e C - amostras controle; A’,B’ e C’- amostras teste; R – pool de RNA de referência.O pool de RNA derivado de linhagens celulares é a amostra dereferência mais utilizada atualmente. Para fornecer a cobertura ótima dosgenes depositados na lâmina, as amostras de referência sãofreqüentemente constituídas de diferentes linhagens celulares oriundasde vários tecidos. Nos experimentos com microarrays do presente trabalhoadotou-se a estratégia do RNA de referência ao invés do dye-swap, poispara realizar os experimentos com troca de corantes seria necessáriomarcar a mesma amostra de RNA com os dois corantes (Cy3 e Cy5).Porém, tal abordagem passa a ser inviável, pois a quantidade de RNAseria insuficiente para a repetição das hibridações.O pool de RNA de referência neste caso foi uma mistura“equimolar” de RNA total de timos de camundongos C57BL/6 adultoscujas amostras foram extraídas exatamente nas mesmas condições dasexperimentais. Como neste trabalho escolheu-se o uso de RNA dereferência, segue algumas considerações:50