O papel modulador do gene AIRE - capes

MATERIAL E MÉTODOSmin a 2-8°C. O sobrenadante foi novamente desprezado e a placa secou àtemperatura ambiente overnight. Após a placa seca, o pellet foiressuspenso em 50 µl de água deionizada autoclavada.Uma alíquota de 5 µl destes produtos foi aplicada em gel deagarose 1% contendo brometo de etídeo, visualizado em transluminadorU.V. e fotografado em Polaroid para avaliar a qualidade dos produtosamplificados.As placas foram secas em forno a 42°C e adicionou-se 27 µl desolução de espotagem (DMSO 50% - dimetil sulfóxido) por poço da placa.Em seguida, estas placas foram levadas ao freezer – 20°C e os produtosforam congelados e descongelados por 3 vezes para uma melhordissolução do DNA concentrado. Posteriormente, os clones forampassados para as placas do robô, e estocadas a 4°C até a deposição dosprodutos de PCR em lâminas de vidro.4.6.4. Confecção das lâminas de microarraysAmostras de produtos de PCR purificados foram preparadas paradeposição em lâminas de vidro adicionando-se mesmo volume (1:1) deReagente D (GE Healthcare) e transferidas para microplacas de 384 poços(Genetix). Por meio de um robô Array Spotter III (Amersham MolecularDynamics) as amostras foram depositadas por um conjunto de 12 canetasque deposita um volume de 0,9 nl da amostra baseada na ação decapilaridade em superfície de lâminas de vidro (Corning ® - UltraGaps40015). Após a deposição de cada conjunto de amostras as canetas foramlavadas automaticamente em uma estação de lavagem que utilizasucessivamente água purificada (18 megohm/cm), etanol absoluto48