O papel modulador do gene AIRE - capes

MATERIAL E MÉTODOSminutos a 4 °C. Foi realizada em um aparelho termociclador “MastercyclerGradient” (Eppendorf), em placas de PCR seladas com adesivo laminadopara evitar evaporação.Cerca de 2 amplificações PCR de cada clone foram realizadas,sempre totalizando 50µl de volume.A avaliação da qualidade dos produtos amplificados pela PCR foifeita em gel de agarose 1%, em tampão TAE 1X (Tris-acetato 0,04 M,EDTA 0,001 M) contendo brometo de etídio (10mg/ml) a 80V, durante 15min. A visualização das bandas foi realizada utilizando transluminadorU.V. e fotografados em Polaroid.4.6.3. Purificação dos produtos de PCRPara obtenção de uma eficiente fixação dos insertos de cDNAamplificados tanto nas membranas de náilon ou nas lâminas de vidro énecessária a remoção de nucleotídeos não incorporados e primers dareação de PCR (Hedge et al. 2000). Utilizamos a purificação dos produtosde PCR por precipitação com etanol.Os produtos de PCR (50 µl) foram transferidos para placas decultivo com fundo em “U” e foram adicionados 10 µl de acetato de sódio3M pH 4,8 em cada poço de uma placa de 96 poços. Em seguida, osprodutos das duas PCR foram agrupados, totalizando 100 µl, que foramtransferidos para esta mesma placa. Após a adição de 100 µl de etanolabsoluto, as placas foram incubadas por 16 horas (overnight) a –20 o C.Após este tempo, as placas foram centrifugadas a 4000xg por 60 min. a 2-8°C. O sobrenadante foi desprezado e o pellet foi ressuspenso em 100 µlde etanol 70%. As placas foram novamente centrifugadas a 4000xg por 3047