O papel modulador do gene AIRE - capes

MATERIAL E MÉTODOSvariam de 500 a 1.500 pb, e está totalmente caracterizada, cujos clonesestão seqüenciados e catalogados. Os clones estão identificados com seusrespectivos “accession numbers” (Acc) no GenBank, Clone ID, o nome dogene e a posição de cada clone nas placas de 384 poços em planilhas doprograma Excel® Microsoft. Conservamos esta biblioteca em E. coli emplacas de microtitulação (384 poços) a -80°C (material gentilmente cedidopela Dra. Catherine Nguyen, do INSERM-TAGC ERM 206, Marseille,França).4.6.2. Amplificação de cDNA para a confecção de microarraysOs clones de E. coli da biblioteca de cDNA IMAGE murina,repicados em placas de 384 poços contendo meio de cultura 2X LB +ampicilina foram incubados durante 16 horas, na proporção de 5 µl dacultura original diluídos em 45 µl de meio de cultura 2X LB (volume finalem cada poço: 50 µl). A seguir uma alíquota de 8µl da cultura foitransferida para outra placa de 384 poços, contendo 72 µl de águadeionizada estéril, e esta placa incubada a 95 o C por 10 min. para lise dascélulas. Após centrifugação a 4000xg por 5 min. foi retirado 10µl dosobrenadante e adicionado a 40µl de um mix para PCR contendo tampãoda reação de PCR (10X), solução de dNTP (2mM), primers com seqüênciasconsenso aos três vetores presentes na biblioteca (10µM), primer LBP 1S(5´TGTGGATTGTGAGCGGATAA3´) e primer 1AS(5´GGGTTGAATTAGCGGAACG3´), Taq polimerase (5U/µl) e águadeionizada estéril q.s.p 50 µl. O programa para amplificação dos insertosteve como base aquele descrito por Menossi et al., 2000: 5 minutos a 94°C,seguidos de 30 ciclos (94°C, por 30 segundos; 55°C por 30 segundos, 72°Cpor 2 minutos), seguida por uma extensão final de 7 minutos a 72°C e 546