O papel modulador do gene AIRE - capes

4.5. PCRs semi-quantitativas para os genes Aire e HPRT.MATERIAL E MÉTODOSDois microgramas de cada amostra de RNA total foramconvertidos a cDNA utilizando a enzima SuperScript II ® (Invitrogen) emuma reação de rt-PCR. Cinco microlitros do produto da reação de rt-PCRforam amplificados em diluições sucessivas (1:2, 1:4, 1:8, até 1:1024) emcada reação de PCR semi-quantitativa. Foram usados pares de primersespecíficos (Tabela 1) para ambos os genes: Aire e HPRT. Um volumefinal de 25 µl de uma reação típica de PCR, contendo 200µM de dNTP, 1,5mM de MgCl2, 50 mM KCl, 10 mMTris-HCl (pH 8,4 a 25°C), 10 µM decada primer e 2 U de Taq DNA polimerase, foi submetida a ciclagemtérmica. Trinta e cinco ciclos foram realizados, cada um com três passos.Para o gene Aire foi desnaturação: 94°C, 30 segundos; anelamento: 57°C,30 segundos; extensão: 72°C, 30 segundos e para o gene HPRT foidesnaturação: 94°C, 30 segundos; anelamento: 60°C, 30 segundos;extensão: 72°C, 30 segundos. Os produtos da amplificação foramsubmetidos a uma eletroforese em gel de agarose 2% em paralelo ao ladode um marcador de peso molecular de 50 pb (Promega, EUA).4.6. Preparação de cDNA microarrays em lâminas de vidro4.6.1. Biblioteca de cDNAs murinosNosso laboratório mantém uma biblioteca de cDNA murino(Biblioteca MTB IMAGE), com cerca de 9.000 clones de timo provenientesdo “IMAGE Consortium” (http://image.llnv.gov). São clones comseqüências “expressed sequence tags” (EST), cujos tamanhos moleculares45