O papel modulador do gene AIRE - capes

MATERIAL E MÉTODOS4.4. Eletroforese de RNA total em gel denaturante (Sambrook et al., 1989)4.4.1. Preparação do gelA agarose (70 ml) foi fundida em água Milli-Q autoclavada (1,5%de agarose), e quando à temperatura de 60 ° C, é adicionado 20 ml deformaldeído (37%) e 22 ml de tampão de migração 5X concentrado (20,6 gde MOPS [ácido propano sulfônico 3-(N-morfolino)], dissolvidos em 800ml de acetato de sódio 50mM, pH 7,0 ajustado com NaOH 2N eadicionados 10 ml de EDTA 0,5 M pH 8,0, volume final ajustado para1000ml). O gel foi solidificado em suporte de acrílico que foi,inicialmente, tratado com NaOH 0,5 M por 10 minutos, assim como acuba e o pente para eliminação de RNAase sendo posteriormente lavadocom água Milli-Q autoclavada.4.4.2. Preparação das amostras de RNAEm um tubo tipo Eppendorf novo e autoclavado colocado em banhode gelo foram adicionados 4,5 µl de uma solução de RNA (5 µg de RNA),2 µl de tampão de migração (5X); 3,5 µl de formaldeído (37%) e 10 µl deformamida. A solução é, então, incubada a 65 ° C por 15 minutos, sendoposteriormente resfriado imediatamente em banho de gelo. Foiadicionado tampão de aplicação (1/10 do volume) e, as amostrasaplicadas no gel. A eletroforese foi realizada à 80 V por cerca de 2,5 a 3horas. Para o cálculo do peso molecular dos RNAs utilizamos RNAsribossômicos 28 S (4,8 Kb) e 18 S (1,9 Kb) como marcadores.44