O papel modulador do gene AIRE - capes

MATERIAL E MÉTODOSAo RNA total recuperado na etapa anterior foram adicionados trêsvolumes de etanol absoluto gelado a fim de precipitar e concentrar aamostra e a mistura deixada a -20°C por pelo menos 18 horas.O RNA total foi coletado por centrifugação a frio e o precipitado foilavado duas vezes com 1000 µL de etanol 70 % também a frio. O excessode etanol foi removido do precipitado de RNA por evaporação em tuboaberto tomando cuidado para não ressecar as amostras. Finalmente asamostras de RNA foram dissolvidas em 13 µL de água Milli-Q estéril.O grau de pureza das preparações de RNA total foi calculado pormedidas espectrofotométricas (GENEQUANT – AMERSHAMPHARMACIA BIOTECH) calculando as razões entre as absorbâncias;A260/A280 ~ 2,0 indicando que a preparação estava livre de proteínas eA220/A260 ~ 0,7 livre de fenol. A integridade das preparações foi avaliadapor meio de eletroforese em gel de agarose corado com brometo de etídeoseguindo protocolo convencional.4.3.1. Quantificação de RNA totalO precipitado de RNA total era dissolvido em 13 µl de água Milli-Q previamente tratada com DEPC. A solução de RNA era então diluída100X e submetida a dosagens em espectrofotômetro usando luzultravioleta (GENEQUANT – AMERSHAM PHARMACIA BIOTECH).As dosagens tiveram como base a seguinte estimativa: 1U de A 260 = 40 µgRNA/mL.43