O papel modulador do gene AIRE - capes

MATERIAL E MÉTODOSse o reagente MirVANA (Ambion), seguindo as instruções dofabricante. As células da linhagem 3.10 foram destacadas das garrafas decultura de 25 cm 3 utilizando-se 4.75 ml de solução de tripsina 1x (2.5g detripsina suína por litro em HBSS) + 0.25 ml de EDTA pH 8.0 por 5minutos, seguido de inativação da tripsina com meio de cultura + SBF ecolhidas por centrifugação a 1000xg durante 5 minutos. As células foramlavadas duas vezes com PBS 1x, seguida de centrifugação a 1000 xgdurante 5 minutos. Adicionou-se 1000 µl de solução de lise. Agita-sevigorosamente (pipetagem e 10 segundos no vórtex) para lisarcompletamente as células e obter um lisado homogêneo. Adiciona-se 100µl de miRMA Homogenate Additive e mistura bem (vórtex 15 segundos).Deixa a mistura no gelo por 10 minutos. Adiciona-se 1000 µl de Ácido-Fenol:Clorofórmio e agita-se vigorosamente no vórtex por 60 segundos. Olisado é então centrifugado a 10000 xg por 5 minutos à temperaturaambiente. A fase aquosa é cuidadosamente transferida para um novotubo e então é adicionado 1.25x volume recuperado após a centrifugaçãode ethanol 100% à temperatura ambiente. Para cada amostra é montadauma coluna em um tubo coletor. 700 µl da mistura foram pipetados nacoluna e centrifugados 15 segundos à 10000xg. O líquido foi descartado eo procedimento foi repetido até que toda a mistura lisado/etanol tenhasido filtrado. Aplicou-se 700 µl de miRNA Wash Solution 1 à coluna ecentrifugou-se por 10 segundos à 10000 xg. Descartou-se o líquido e 500µl de miRNA Wash Solution 2/3 foram aplicados à coluna ecentrifugados 10 segundos à 10000 xg. Repetiu-se o último passo e, apósdescartar o líquido, centrifugou-se 1 minuto para remover resíduoslíquidos no filtro. A coluna foi transferida para um tubo novo coletor e aela foram adicionados 100 µl de água DEPC pré-aquecida (95°C).Centrifugou-se 30 segundos para recuperar o RNA.42