O papel modulador do gene AIRE - capes

MATERIAL E MÉTODOSdos complexos de transfecção RNAi-lipofectamina. Os complexos foramadicionados à cultura, permanecendo por 42 horas. Após 24 horas que ascélulas foram semeadas, foram adicionados mais 2 ml de RPMI contendo10% (SBF).Foram utilizados 4 controles: 1) mTEC 3.10 sem RNAi; 2) mTEC3.10 em presença apenas de lipofectamina; 3) mTEC 3.10 em presença deum RNAi irrelevante, sem a capacidade de silenciar qualquer gene decamundongo; 4) mTEC 3.10 na presença de um RNAi anti-HPRT, umcontrole positivo, que indica a funcionalidade do método.Para a avaliação da eficiência da transfecção fez-se uso demicroscopia fluorescente onde a seqüência duplex de RNAi irrelevantemarcada com Cy3 foi testada em diferentes concentrações: 1; 2.5; 5 e 10ηM .A avaliação da transfecção das células mTEC 3.10 utilizandomicroscopia de fluorescência foi realizada no Laboratório da Profa. Dra.Elza Tiemi Sakamoto-Hojo no Departamento de Genética da Faculdadede Medicina de Ribeirão Preto.4.3. Extração de RNA totalA fim de prevenir da contaminação por ribonucleases durante aextração e manuseio dos RNAs, toda a vidraria, tubos plásticos, espátulase pinças utilizadas foram previamente autoclavados. O material plástico(tubos e ponteiras) eram novos e previamente autoclavados. Todo oprocedimento foi realizado usando luvas de látex sem talco edescartáveis.Após 42 horas o RNA total de cada cultura foi extraído utilizando-41