O papel modulador do gene AIRE - capes

MATERIAL E MÉTODOSTabela I. Oligonucleotídeos primers utilizados nas reações de RT-PCR.(For = forward, Rev = reverse)Gene Seqüência dos primers Produto PCR (pb)HPRT(For) 5’ GCTTGCTGGTGAAAAGGACCTCTCGAAG 3’117HPRT(Rev) 5’CCCTGAAGTACTCATTATAGTCAAGGGCAT3’Aire (For) 5’ CATCCTGGATTTCTGGAGGA 3’253Aire (Rev) 5’ GCTCTTTGAGGCCAGAGTTG 3’4.2.2. Silenciamento do transcrito do gene Aire em cultura de células mTEC3.10.Ao atingirem semiconfluência as células da linhagem 3.10 foramdestacadas das garrafas de cultura de 75 cm 3 utilizando-se 9.5 ml desolução de tripsina 1x (2.5g de tripsina suína por litro em HBSS) + 0.5 mlde EDTA pH 8.0 por 5 minutos e as células foram contadas em câmara deNewbauer. As células foram colhidas por centrifugação a 1000xg durante 5minutos. 5x10 5 células foram semeadas em garrafas de cultura de 25 cm 3contendo 2,3 ml de meio RPMI e 10% de soro fetal bovino (SFB), umahora antes do início do experimento com RNAi anti-Aire e colocadas emcondições normais de cultura. Após colocar as culturas em estufa,procedeu-se com a preparação dos complexos RNAi-lipofectamina. Cinconanomoles de RNAi foram gentilmente misturados à 100 µl de MEMfiltrado sem SBF e então foram adicionados 6 µl de Hiperferct (Qiagen).Essa mistura foi vigorosamente agitada durante 10 segundos e emseguida incubadas 10 minutos à temperatura ambiente para a formação40