O papel modulador do gene AIRE - capes

MATERIAL E MÉTODOScom estes RNAs foram submetidas a reações de PCR (método de RT-PCR) para avaliarmos a melhor seqüência inibitória.As reações de RT-PCR do experimento piloto para a seleção daseqüência de RNAi anti-Aire foram realizadas a partir de 2 µg de cadaamostra de RNA, que foram convertidas a cDNA utilizando a enzimatranscriptase reversa SuperScript II ® (Invitrogen). Utilizamos então 5 µLdo produto da reação e a amplificação por PCR foi feita em diluiçõessucessivas (1:1 a 1:128) em cada reação de RT-PCR semi-quantitativa. Asseqüências dos oligonucleotídeos primers utilizados encontram-se naTabela I.As condições de PCR foram: mix com volume final de 25 µl,contendo 200µM de dNTPs, 1,5 mM de MgCl2, 50 mM KCl, 10 mMTris-HCl (pH 8,4 a 25°C), 10 µM de cada primer e 2 U de Taq DNA polimerase.Ciclagem térmica: trinta e cinco ciclos foram realizados, cada um com trêspassos. Para o gene Aire: desnaturação a 94°C, 30 segundos; anelamento a57°C, 30 segundos; extensão a 72°C, 30 segundos e para o gene HPRT:desnaturação a 94°C, 30 segundos; anelamento a 60°C, 30 segundos;extensão a 72°C, 30 segundos.Os produtos da amplificação foram submetidos à eletroforese emgel de agarose 2% corado com brometo de etídeo.39