O papel modulador do gene AIRE - capes

MATERIAL E MÉTODOS4.2. Inibição seletiva do transcrito do gene Aire com RNA interferente(RNAi).4.2.1. Determinação da seqüência de RNAi anti-Aire.O ensaio de silenciamento do transcrito do gene Aire foi realizadoutilizando o sistema de RNAi do Kit TriFECTa (IDT - Integrated DNATecnologies, Coralville, IA, USA). O kit inclui três seqüências diferentesde RNAi anti-Aire, as quais devem ser previamente testadas buscando amelhor eficiência de inibição do transcrito no modelo de estudo. Alémdas seqüências anti-Aire, outras três seqüências estavam incluídas no kit:1) RNAi irrelevante marcado com Cy3 utilizado para medir a eficiênciade transfecção (microscopia de fluorescência), 2) uma seqüência duplexde RNAi irrelevante, o qual não é capaz de alterar a expressão gênica nascélulas em estudo e 3) um controle positivo, constituída de umaseqüência RNAi anti-o transcrito do gene constitutivo HPRT(hypoxanthine guanine phosphoribosyl transferase), utilizada paraavaliar se o processo de transfecção e o sistema modelo são adequadospara inibição com RNAi.O método escolhido para a transfecção das células mTEC emcultura foi o de lipofecção utilizando o Hiperfect Transfection Reagent®da Qiagen (Hilden, Alemanha), seguindo instruções do fabricante.Para se determinar qual a melhor concentração e qual o melhorduplex para o silenciamento do transcrito de Aire, realizou-se umexperimento piloto onde as três seqüências anti-Aire e as demaisseqüências controle foram testadas nas concentrações de 2,5; 5,0 e 10,0ηM. Finalmente amostras de cDNA oriundas das células mTEC tratadas38