técnicas de laboratorio para el diagnóstico y la caracterización de ...
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INDICESeguridad en <strong>el</strong> Laboratorio. 1Colecta <strong>de</strong> muestras <strong>para</strong> <strong>el</strong> diagnóstico <strong>de</strong> <strong>de</strong>ngue 5Ais<strong>la</strong>miento <strong>de</strong>l virus <strong>de</strong>l Dengue. 9Inmunofluorescencia. 28Titu<strong>la</strong>ción <strong>de</strong>l virus <strong>de</strong>l Dengue y neutralización por reducción <strong>de</strong>lnúmero <strong>de</strong> p<strong>la</strong>cas. 33Pre<strong>para</strong>ción <strong>de</strong> antígeno por <strong>el</strong> método <strong>de</strong> sacarosa - acetona. 42Hemaglutinación e inhibición <strong>de</strong> <strong>la</strong> hemaglutinación. 45Pre<strong>para</strong>ción <strong>de</strong> conjugado anti-Dengue - peroxidasa. 53ELISA <strong>de</strong> Inhibición. 58ELISA <strong>de</strong> captura <strong>de</strong> IgM. 63“ Kit Diagnóstico “: Dengue * IgM 68Sistema Ultramicro-ELISA <strong>para</strong> <strong>la</strong> <strong>de</strong>tección <strong>de</strong> Acs IgM al virus Dengue(UMELISA-DENGUE). 71AuBioDOT IgM anti-Dengue. 72Detección <strong>de</strong> antígeno a <strong>de</strong>ngue mediante un ELISA <strong>de</strong> amplificaciónbiotina-estreptavidina (ELISA-BE) 76SDS-PAGE / Western Blot. 79Detección <strong>de</strong> antígenos <strong>de</strong>l virus <strong>de</strong>ngue en tejidos embebidos en<strong>para</strong>fina. 85Detección <strong>de</strong> apoptosis en tejidos embebidos en <strong>para</strong>fina. 91Detección <strong>de</strong> los virus <strong>de</strong>l Dengue mediante Reverso 97Transcripción/Reacción en Ca<strong>de</strong>na <strong>de</strong> <strong>la</strong> Polimerasa (RT/PCR).I<strong>de</strong>ntificación <strong>de</strong> los subtipos <strong>de</strong> los virus <strong>de</strong>l <strong>de</strong>ngue mediante 110restricción enzimática.Detección <strong>de</strong> <strong>la</strong> carga <strong>de</strong> virus <strong>de</strong>ngue mediante reverso trascripción- 113reacción en ca<strong>de</strong>na <strong>de</strong> <strong>la</strong> polimerasa en tiempo real (RT/PCR-TR ó CV)Secuenciación nucleotídica directa <strong>de</strong>l producto <strong>de</strong> PCR 116Sistema <strong>de</strong> expresion diferencial <strong>de</strong> mRNA (“RNAimage Kit: mRNAdifferential disp<strong>la</strong>y system”). 120
Ensayo <strong>de</strong> Linfoproliferación a partir <strong>de</strong> célu<strong>la</strong>s humanas <strong>de</strong> sangre 127periférica.Ensayo <strong>de</strong> linfoproliferación a partir <strong>de</strong> esplenocitos <strong>de</strong> ratón 129Ais<strong>la</strong>miento <strong>de</strong> monocitos a partir <strong>de</strong> célu<strong>la</strong>s mononucleares <strong>de</strong> sangreperiférica (c.m.s.p.) 131Detección <strong>de</strong> citoquinas intrac<strong>el</strong>u<strong>la</strong>res y marcadores c<strong>el</strong>u<strong>la</strong>res <strong>de</strong>superficie por citometría <strong>de</strong> flujo en cultivos <strong>de</strong> célu<strong>la</strong>s mononucleares 132murinas estimu<strong>la</strong>das con antígenos/mitógenos.Ensayo <strong>de</strong> inmunoamplificación 134Procedimiento <strong>para</strong> ELISPOT <strong>de</strong> interferón gamma. 136Determinación <strong>de</strong>l polimorfismo <strong>de</strong> los genes <strong>de</strong> citoquinas 138
1SEGURIDAD EN EL LABORATORIOEn los <strong><strong>la</strong>boratorio</strong>s médicos y biológicos se realizan trabajos muy variados quecomportan un gran número <strong>de</strong> riesgos <strong>de</strong> diversa índole <strong>para</strong> <strong>el</strong> trabajador, <strong>el</strong>personal cercano al mismo y <strong>para</strong> <strong>la</strong> comunidad en su conjunto; entre talesriesgos se <strong>de</strong>staca en forma predominante <strong>el</strong> riesgo biológico infeccioso<strong>de</strong>rivado <strong>de</strong> <strong>la</strong> manipu<strong>la</strong>ción o exposición a microorganismos patógenos en <strong>el</strong><strong><strong>la</strong>boratorio</strong>.La infección en <strong>el</strong> personal <strong>de</strong> <strong><strong>la</strong>boratorio</strong> <strong>de</strong>pen<strong>de</strong> básicamente <strong>de</strong> <strong>la</strong>interacción <strong>de</strong> varios factores como son: <strong>el</strong> agente infeccioso implicado; <strong>el</strong>reservorio <strong>de</strong> <strong><strong>la</strong>boratorio</strong>; <strong>el</strong> modo <strong>de</strong> escape, vía <strong>de</strong> transmisión y puerta <strong>de</strong>entrada; y <strong>la</strong> susceptibilidad <strong>de</strong>l hospe<strong>de</strong>ro. Sólo una parte <strong>de</strong> <strong>la</strong>s infeccionescontraídas en <strong>el</strong> <strong><strong>la</strong>boratorio</strong> son atribuibles a acci<strong>de</strong>ntes reconocidos; en <strong>la</strong>mayoría <strong>de</strong> <strong>la</strong>s infecciones ocurridas en este ambiente se <strong>de</strong>sconoce <strong>la</strong> causadirecta <strong>de</strong> <strong>la</strong> infección, aunque se presume que pueda <strong>de</strong>berse acontaminación por aerosoles infecciosos, capaces <strong>de</strong> ser generados pormuchos procedimientos habituales <strong>de</strong> <strong><strong>la</strong>boratorio</strong>.La Organización Mundial <strong>de</strong> <strong>la</strong> Salud (OMS) ha <strong>el</strong>aborado una c<strong>la</strong>sificación <strong>de</strong>agentes biológicos sobre <strong>la</strong> base <strong>de</strong>l riesgo que representan <strong>para</strong> <strong>el</strong> individuoque trabaja con <strong>el</strong>los y <strong>para</strong> <strong>la</strong> comunidad; así se han establecido 4 grupos <strong>de</strong>riesgo en or<strong>de</strong>n creciente <strong>de</strong> p<strong>el</strong>igrosidad como se muestra a continuación:Grupo <strong>de</strong> Riesgo 1 (escaso o nulo riesgo individual y comunitario)Microorganismo que tiene pocas probabilida<strong>de</strong>s <strong>de</strong> provocar enfermeda<strong>de</strong>shumanas o animales.Grupo <strong>de</strong> Riesgo 2 (riesgo individual mo<strong>de</strong>rado, riesgo comunitario bajo)Agente patógeno que pue<strong>de</strong> provocar enfermeda<strong>de</strong>s humanas o animales, peroque tiene pocas probabilida<strong>de</strong>s <strong>de</strong> entrañar un riesgo grave <strong>para</strong> <strong>el</strong> personal <strong>de</strong><strong><strong>la</strong>boratorio</strong>, <strong>la</strong> comunidad, <strong>el</strong> ganado o <strong>el</strong> medio ambiente. La exposición en <strong>el</strong><strong><strong>la</strong>boratorio</strong> pue<strong>de</strong> provocar una infección grave, pero se dispone <strong>de</strong> medidaseficaces <strong>de</strong> tratamiento y /o <strong>de</strong> prevención, y <strong>el</strong> riesgo <strong>de</strong> propagación eslimitado.
2Grupo <strong>de</strong> Riesgo 3 (riesgo individual <strong>el</strong>evado, riesgo comunitario bajo)Agente patógeno que su<strong>el</strong>e provocar enfermeda<strong>de</strong>s humanas o animalesgraves, pero que <strong>de</strong> ordinario no se propaga <strong>de</strong> un individuo infectado a otro.En <strong>el</strong> <strong><strong>la</strong>boratorio</strong> pue<strong>de</strong>n transmitirse por aerosoles. En general no se dispone<strong>de</strong> medidas eficaces <strong>de</strong> tratamiento y prevención.Grupo <strong>de</strong> Riesgo 4 (<strong>el</strong>evado riesgo individual y comunitario)Agente patógeno que su<strong>el</strong>e provocar enfermeda<strong>de</strong>s graves en personas o en losanimales y que pue<strong>de</strong> propagarse fácilmente <strong>de</strong> un individuo a otro, directa oindirectamente. No su<strong>el</strong>e disponerse <strong>de</strong> medidas eficaces <strong>de</strong> tratamiento y <strong>de</strong>prevención.Entre los <strong>el</strong>ementos a consi<strong>de</strong>rar <strong>para</strong> evaluar <strong>el</strong> potencial <strong>de</strong> riesgo <strong>de</strong> unagente biológico se cuentan: <strong>la</strong> capacidad patógena <strong>de</strong>l agente, <strong>el</strong> modo <strong>de</strong>transmisión y su rango hospe<strong>de</strong>ro, <strong>la</strong> disponibilidad <strong>de</strong> medidas <strong>de</strong> prevencióneficaces, disponibilidad <strong>de</strong> tratamiento eficaz, en<strong>de</strong>mismo o exotismo <strong>de</strong><strong>la</strong>gente consi<strong>de</strong>rado y <strong>la</strong> experiencia <strong>de</strong> trabajo con <strong>el</strong> agente. En cada país, se<strong>de</strong>berá c<strong>la</strong>sificar por grupo <strong>de</strong> riesgo a todos los microorganismos que seencuentren en <strong>el</strong> territorio nacional.El término contención se usa <strong>para</strong> <strong>de</strong>scribir métodos seguros <strong>para</strong> <strong>el</strong> manejo<strong>de</strong> agentes infecciosos, en <strong>el</strong> <strong><strong>la</strong>boratorio</strong> don<strong>de</strong> estos son manipu<strong>la</strong>dos omantenidos.La Bioseguridad, disciplina que se ocupa <strong>de</strong> <strong>la</strong> prevención <strong>de</strong>l riesgo biológicoinfeccioso, no es más que un conjunto <strong>de</strong> medidas científico-organizativas ytécnico- ingenieras encaminadas a lograr <strong>la</strong> contención <strong>de</strong> los agentesinfecciosos y proteger al trabajador <strong>de</strong> <strong><strong>la</strong>boratorio</strong> y a <strong>la</strong> comunidad <strong>de</strong> estetipo <strong>de</strong> riesgo.En correspon<strong>de</strong>ncia con los grupos <strong>de</strong> riesgo se han establecido también 4niv<strong>el</strong>es <strong>de</strong> Bioseguridad, o sea combinaciones <strong>de</strong> técnicas y prácticas <strong>de</strong><strong><strong>la</strong>boratorio</strong>, equipos <strong>de</strong> seguridad e insta<strong>la</strong>ciones <strong>de</strong> <strong><strong>la</strong>boratorio</strong>, apropiadas<strong>para</strong> <strong>el</strong> riesgo que representen los agentes infecciosos que se manipulen enestos lugares.En <strong>el</strong> caso <strong>de</strong> los Arbovirus se siguen los mismos criterios que <strong>para</strong> <strong>el</strong> resto <strong>de</strong>los agentes patógenos aunque en particu<strong>la</strong>r, un Subcomité <strong>para</strong> <strong>la</strong> Seguridad
3<strong>de</strong> Laboratorio en Arbovirus (SALS), perteneciente al Comité Americano sobreArbovirus (ACAV), ha categorizado, acor<strong>de</strong> con <strong>la</strong> c<strong>la</strong>sificación <strong>de</strong> <strong>la</strong> OMS, acada uno <strong>de</strong> los virus registrados en <strong>el</strong> Catálogo <strong>de</strong> Arbovirus y Ciertos OtrosVirus <strong>de</strong> Vertebrados.Las categorizaciones <strong>de</strong>l SALS, periódicamente actualizadas <strong>de</strong>s<strong>de</strong> 1980, se basanen <strong>la</strong>s evaluaciones <strong>de</strong> riesgo realizadas a partir <strong>de</strong> <strong>la</strong> información proveída por585 <strong><strong>la</strong>boratorio</strong>s que trabajan con arbovirus en todo <strong>el</strong> mundo. Según estacategorización los virus <strong>de</strong>l <strong>de</strong>ngue han sido asignados al Grupo <strong>de</strong> Riesgo 2.Antes <strong>de</strong> 1988 se habían reportado 12 infecciones por <strong>de</strong>ngue adquiridas en <strong>el</strong><strong><strong>la</strong>boratorio</strong>; <strong>de</strong>s<strong>de</strong> 1988 a 1991 se documentaron 4 casos adicionales.Mientras que los riesgos primarios en <strong>el</strong> <strong><strong>la</strong>boratorio</strong> son <strong>la</strong> inocu<strong>la</strong>ción parentera<strong>la</strong>cci<strong>de</strong>ntal, <strong>el</strong> contacto <strong>de</strong>l virus con <strong>la</strong> pi<strong>el</strong> dañada o <strong>la</strong>s membranas mucosas y<strong>la</strong>s mor<strong>de</strong>duras <strong>de</strong> roedores <strong>de</strong> <strong><strong>la</strong>boratorio</strong> o picaduras por artrópodos infectados,los aerosoles infecciosos pue<strong>de</strong>n también constituir una fuente potencial <strong>de</strong>infección.En los últimos 4 casos reportados, no se utilizaron medios <strong>de</strong> protecciónindividual a<strong>de</strong>cuados y en 3 <strong>de</strong> <strong>el</strong>los también se ignoró <strong>la</strong> contención <strong>de</strong> aerosolespotenciales en cabinas <strong>de</strong> seguridad, especialmente cuando se trabajaba conaltas concentraciones <strong>de</strong> virus. Tales aerosoles o salpicaduras con fluidosinfecciosos pudieran haber producido contaminación <strong>de</strong> <strong>la</strong> pi<strong>el</strong> dañada y noprotegida a<strong>de</strong>cuadamente. La manipu<strong>la</strong>ción segura en <strong>el</strong> <strong><strong>la</strong>boratorio</strong> <strong>de</strong> los virus<strong>de</strong>l Dengue (en especial <strong>la</strong>s pre<strong>para</strong>ciones concentradas) requieren <strong>de</strong> <strong>la</strong>adherencia estricta a <strong>la</strong>s recomendaciones <strong>de</strong>l Niv<strong>el</strong> <strong>de</strong> Bioseguridad 2 (Biosafetyin Microbiological and Biomedical Laboratories. CDC-NIH, 4th ed. 1999).Estas recomendaciones, según <strong>el</strong> manual <strong>de</strong> <strong>la</strong> OMS, compren<strong>de</strong>n en esencia <strong>el</strong>trabajo <strong>de</strong> un <strong><strong>la</strong>boratorio</strong> básico y observar técnicas microbiológicas apropiadas(TMA).
4Algunas <strong>de</strong> <strong>la</strong>s reg<strong>la</strong>s más importantes <strong>para</strong> trabajar en <strong>el</strong> <strong><strong>la</strong>boratorio</strong> conespecímenes infectados por virus:• No pipeteo con <strong>la</strong> boca.• Uso <strong>de</strong> guantes <strong>para</strong> <strong>el</strong> trabajo con muestras <strong>de</strong> sangre u otros líquidosorgánicos y siempre que se prevea <strong>el</strong> contacto con material potencialmenteinfeccioso.• Uso <strong>de</strong> batas, uniformes u otras prendas apropiadas. No se llevará <strong>la</strong> ropa <strong>de</strong>trabajo a áreas fuera <strong>de</strong>l <strong><strong>la</strong>boratorio</strong>.• Descontaminación <strong>de</strong> jeringas y agujas. Es recomendable <strong>el</strong> uso <strong>de</strong> material<strong>de</strong>sechable.• Evitar <strong>la</strong> formación <strong>de</strong> aerosoles y gotas.• Es aconsejable <strong>el</strong> empleo <strong>de</strong> cámaras <strong>de</strong> seguridad cuando existe un granriesgo <strong>de</strong> formación <strong>de</strong> aerosoles.• Limpieza rápida <strong>de</strong> los <strong>de</strong>rrames cubriéndolos con un paño o pap<strong>el</strong> mojado ensolución <strong>de</strong>sinfectante (hipoclorito <strong>de</strong> sodio: 10g en un litro). Debe <strong>de</strong>jarseactuar <strong>el</strong> <strong>de</strong>sinfectante por lo menos 30 minutos antes <strong>de</strong> proce<strong>de</strong>r a <strong>la</strong>recogida <strong>de</strong> los materiales y limpieza <strong>de</strong> <strong>la</strong>s superficies contaminadas.• Descontaminación diaria <strong>de</strong> <strong>la</strong>s mesas y superficies al terminar <strong>el</strong> trabajo.• Descontaminación <strong>de</strong> todos los materiales utilizados en <strong>el</strong> trabajo, incluyendo<strong>la</strong> ropa.• Lavado <strong>de</strong> <strong>la</strong>s manos <strong>de</strong>spués <strong>de</strong> manipu<strong>la</strong>r especímenes y siempre antes <strong>de</strong>salir <strong>de</strong>l <strong><strong>la</strong>boratorio</strong>.• En caso <strong>de</strong> inyecciones, cortaduras o abrasiones acci<strong>de</strong>ntales, <strong>de</strong>ben quitars<strong>el</strong>os guantes, <strong>la</strong>varse <strong>la</strong>s manos, facilitar <strong>el</strong> sangrado <strong>de</strong> <strong>la</strong> herida, aplicar<strong>de</strong>sinfectante a <strong>la</strong> pi<strong>el</strong> si proce<strong>de</strong> y consultar a un médico.• No fumar, comer, beber etc en <strong>el</strong> área <strong>de</strong> trabajo.• No tener alimentos ni bebidas en los refrigeradores <strong>de</strong>l <strong><strong>la</strong>boratorio</strong>.• Las centrífugas <strong>de</strong>ben estar equipadas con mecanismos <strong>de</strong> seguridad <strong>para</strong> queaerosoles potenciales <strong>de</strong> material infeccioso no se diseminen.• Para centrifugar <strong>de</strong>ben utilizarse <strong>de</strong> preferencia tubos plásticos con tapa <strong>de</strong>rosca.
5• Debe existir un reg<strong>la</strong>mento interno <strong>de</strong> bioseguridad así como un responsableque garantice su cumplimiento. Deben existir un p<strong>la</strong>n <strong>de</strong> medidas a tomar encaso <strong>de</strong> acci<strong>de</strong>nte.• El personal <strong>de</strong>l <strong><strong>la</strong>boratorio</strong> <strong>de</strong>be estar vacunado (<strong>de</strong> existir <strong>la</strong>s vacunas) contralos agentes que se trabajan.• El estado <strong>de</strong> salud <strong>de</strong> los trabajadores <strong>de</strong>be chequearse periódicamente.• Las áreas <strong>de</strong> trabajo <strong>de</strong>ben estar a<strong>de</strong>cuadamente señalizadas como <strong>de</strong> "accesorestringido".• Todos los materiales contaminados, muestras y cultivos, tienen que ser<strong>de</strong>scontaminados antes <strong>de</strong> su <strong>el</strong>iminación o limpieza <strong>para</strong> reutilización(preferiblemente autoc<strong>la</strong>ve o incineración).La concepción general e insta<strong>la</strong>ción <strong>de</strong>l <strong><strong>la</strong>boratorio</strong>, así como otros aspectosr<strong>el</strong>ativos a <strong>la</strong> seguridad en los <strong><strong>la</strong>boratorio</strong>s en que se trabajen agentes en Grupos<strong>de</strong> Riesgo <strong>de</strong> tipo 1 y 2, pue<strong>de</strong>n encontrarse en: Laboratorios Básicos-Niv<strong>el</strong>es <strong>de</strong>Bioseguridad 1 y 2. Parte 1. Normas generales. Manual <strong>de</strong> Bioseguridad en <strong>el</strong>Laboratorio. 2da ed. en español. OMS. 1994.El trabajo con agentes <strong>de</strong> los Grupos <strong>de</strong> Riesgo 3 y 4, requiere <strong>de</strong> insta<strong>la</strong>cionesespeciales.COLECTA DE MUESTRAS PARA EL DIAGNOSTICO DE DENGUEEl éxito <strong>de</strong> los resultados <strong>de</strong> <strong>la</strong> pruebas <strong>de</strong> <strong><strong>la</strong>boratorio</strong> <strong>para</strong> <strong>el</strong> ais<strong>la</strong>miento viral<strong>de</strong>pen<strong>de</strong> en gran medida <strong>de</strong> <strong>la</strong>s condiciones en que se realice <strong>la</strong> colecta,manipu<strong>la</strong>ción y transporte <strong>de</strong> <strong>la</strong>s muestras por lo que <strong>la</strong> persona encargada <strong>de</strong>realizar este trabajo <strong>de</strong>be garantizar que <strong>la</strong>s mismas lleguen en buenascondiciones al <strong><strong>la</strong>boratorio</strong> junto a <strong>la</strong> documentación a<strong>de</strong>cuada. Todos losespecímenes <strong>de</strong>ben recogerse observando precauciones universales en frascosestériles y rotu<strong>la</strong>rse cuidadosamente con los datos <strong>de</strong> i<strong>de</strong>ntificación. Esconveniente emplear un mo<strong>de</strong>lo que incluya los siguientes aspectos:
6Documentación <strong>de</strong>l paciente e i<strong>de</strong>ntificación‣ Nombre, ap<strong>el</strong>lidos‣ Edad, sexo y raza‣ Dirección‣ Fecha <strong>de</strong> comienzo <strong>de</strong> los síntomas‣ Fecha <strong>de</strong> toma <strong>de</strong> <strong>la</strong>s muestras‣ Número <strong>de</strong> historia clínica, resumen <strong>de</strong> los datos clínicos yepi<strong>de</strong>miológicos <strong>de</strong>l caso‣ Impresión diagnóstica‣ Tipo <strong>de</strong> muestra colectada‣ Nombre y datos generales <strong>de</strong>l médico <strong>de</strong> atención, hospital y provincia.Todas <strong>la</strong>s muestras <strong>de</strong>ben ser rotu<strong>la</strong>das con <strong>el</strong> nombre <strong>de</strong>l paciente y fecha <strong>de</strong>toma <strong>de</strong> <strong>la</strong> muestra y <strong>de</strong>ben estar acompañadas por los datos anteriores.Muestras <strong>para</strong> ais<strong>la</strong>miento viral: Las muestras <strong>para</strong> ais<strong>la</strong>miento viral o estudios<strong>de</strong> <strong>de</strong>tección <strong>de</strong>l ácido nucleico viral (RCP) <strong>de</strong>ben ser colectadas en los 3 primerosdías <strong>de</strong>l comienzo <strong>de</strong> <strong>la</strong> enfermedad. Deben colectarse asépticamente 10 ml <strong>de</strong>sangre total <strong>la</strong> cual será transferida a tubos estériles libres <strong>de</strong> aditivos opreservativos. Los tubos que contienen <strong>la</strong> sangre se colocaran lo más rápidoposible en hi<strong>el</strong>o o en <strong>el</strong> refrigerador (4 o C). Para asegurar <strong>la</strong>s óptimas condicionesdurante <strong>el</strong> ais<strong>la</strong>miento, <strong>la</strong> se<strong>para</strong>ción <strong>de</strong>l suero <strong>de</strong>l coágulo se realizará <strong>el</strong> mismodía <strong>de</strong> <strong>la</strong> toma <strong>de</strong> <strong>la</strong> muestra y asépticamente.Los tubos con <strong>el</strong> suero se cong<strong>el</strong>arán y almacenarán a temperatura <strong>de</strong> -70 o C. Elsuero <strong>de</strong>be enviarse lo antes posible al <strong><strong>la</strong>boratorio</strong> realizando <strong>el</strong> transporte encong<strong>el</strong>ación. En <strong>la</strong>s primeras 24-48h <strong>de</strong> colectado <strong>el</strong> suero, <strong>el</strong> mismo pue<strong>de</strong>mantenerse a 4 0 C hasta su envío al <strong><strong>la</strong>boratorio</strong> (a igual temperatura).Para <strong>el</strong> ais<strong>la</strong>miento <strong>de</strong>l virus a partir <strong>de</strong> muestras <strong>de</strong> vísceras (bazo, hígado,ganglios), <strong>de</strong>ben transportarse también en frío. Se homogeneizan 20g <strong>de</strong>l tejido en100mL <strong>de</strong> PBS o medio <strong>de</strong> cultivo conteniendo suero <strong>de</strong> ternero (inactivado porcalor) al 10% y antibióticos. Posteriormente se centrifugan a 3000 rpm durante30 minutos a 4 o C y se emplea <strong>el</strong> sobrenadante <strong>para</strong> <strong>el</strong> ais<strong>la</strong>miento. Esconveniente realizar una prueba <strong>de</strong> esterilidad en cada caso.
7Muestras <strong>para</strong> diagnóstico serológico: Usualmente se toman dos muestras <strong>de</strong>suero: <strong>de</strong> fase aguda y convaleciente. El suero <strong>de</strong> fase aguda se extrae durante losprimeros 5 días <strong>de</strong> <strong>la</strong> enfermedad y <strong>el</strong> <strong>de</strong> fase convaleciente <strong>de</strong> 2-3 semanas mástar<strong>de</strong>. Para lograr <strong>el</strong> máximo rendimiento <strong>de</strong>l suero, <strong>la</strong> sangre colectada se <strong>de</strong>ja atemperatura ambiente por una hora y durante toda <strong>la</strong> noche a 4 o C (refrigerador)antes <strong>de</strong> centrifugar. Después <strong>de</strong> <strong>la</strong> centrifugación (1000 rpm por 10 minutos a4 o C) <strong>el</strong> suero se transfiere a un tubo previamente rotu<strong>la</strong>do y se almacenapreferiblemente en cong<strong>el</strong>ación (-20 o C). El envío al <strong><strong>la</strong>boratorio</strong> <strong>de</strong>be realizarsepreferiblemente en cong<strong>el</strong>ación (-20 o C) o a 4 o C. Para <strong>la</strong> <strong>de</strong>terminación <strong>de</strong>anticuerpos IgM a <strong>de</strong>ngue se utiliza una muestra <strong>de</strong> sangre tomada a partir <strong>de</strong>lquinto día <strong>de</strong> comienzo <strong>de</strong> los síntomas <strong>la</strong> que se procesa en forma simi<strong>la</strong>r <strong>para</strong>obtener <strong>el</strong> suero correspondiente.Envío y transporte <strong>de</strong> <strong>la</strong>s muestras: Durante <strong>el</strong> envío y transporte <strong>de</strong> <strong>la</strong>smuestras <strong>de</strong>ben observarse <strong>la</strong>s medidas <strong>de</strong> seguridad <strong>el</strong>ementales <strong>para</strong> proteger,tanto al personal, como a <strong>la</strong>s muestras en sí. El suero <strong>de</strong>be enviarse <strong>de</strong>ntro <strong>de</strong>contenedores especiales con tapa <strong>de</strong> rosca <strong>la</strong>s que <strong>de</strong>ben asegurarse con pap<strong>el</strong>adhesivo. Pue<strong>de</strong>n agruparse varios tubos con una liga y guardarse <strong>de</strong>ntro <strong>de</strong> uncontenedor plástico o metálico que <strong>de</strong>berá envolverse con suficiente pap<strong>el</strong>absorbente <strong>para</strong> evitar <strong>el</strong> <strong>de</strong>rrame <strong>de</strong> líquido en caso <strong>de</strong> rotura. Cada contenedor<strong>de</strong>be enviarse en cajas <strong>de</strong> poliespuma o termos con hi<strong>el</strong>o seco (los tubos no <strong>de</strong>benponerse en contacto directo con <strong>el</strong> hi<strong>el</strong>o seco). De no tener hi<strong>el</strong>o seco, pue<strong>de</strong>nutilizarse refrigerantes o hi<strong>el</strong>o normal. Deben evitarse <strong>la</strong>s cong<strong>el</strong>aciones y<strong>de</strong>scong<strong>el</strong>aciones repetidas <strong>de</strong> <strong>la</strong>s muestras.
8Cada contenedor <strong>de</strong>be tener los siguientes rótulos: URGENTE, FRAGIL,MATERIAL MEDICO, MANTENER EN FRIO, MANTENER EN POSICIÓNVERTICAL.A<strong>de</strong>más, <strong>de</strong>ben cumplirse <strong>la</strong>s regu<strong>la</strong>ciones internacionales específicas que existen<strong>para</strong> <strong>el</strong> transporte <strong>de</strong> muestras. Acompañando al contenedor en <strong>la</strong> parte exterior<strong>de</strong>ben ir los datos <strong>de</strong>l paciente (no <strong>de</strong>ben estar en contacto directo con <strong>el</strong> hi<strong>el</strong>o ocon <strong>la</strong> muestra). Cada país tiene regu<strong>la</strong>ciones específicas <strong>para</strong> <strong>la</strong> importación <strong>de</strong>materiales biológicos.En <strong>el</strong> momento <strong>de</strong>l envío <strong>de</strong>be avisarse al <strong><strong>la</strong>boratorio</strong> (t<strong>el</strong>ex, t<strong>el</strong>éfono, fax) <strong>de</strong>lmomento <strong>de</strong> <strong>la</strong> llegada <strong>de</strong>l mismo lo que asegurará que sea recogidoinmediatamente a su llegada. Es aconsejable que los envíos no lleguen sábados,domingos o días festivos.
9AISLAMIENTO DEL VIRUS DEL DENGUEUno <strong>de</strong> los sistemas biológicos mas empleados en <strong>el</strong> ais<strong>la</strong>miento <strong>de</strong>l virus <strong>de</strong>ngue,a pesar <strong>de</strong> su baja sensibilidad, ha sido <strong>el</strong> ratón <strong>la</strong>ctante inocu<strong>la</strong>do por víaintracerebral. También se han utilizado diferentes sistemas c<strong>el</strong>u<strong>la</strong>res <strong>de</strong>mamíferos entre los que se encuentran <strong>la</strong>s líneas c<strong>el</strong>u<strong>la</strong>res: BSC-1, VERO, BHK-21, LLCMK2.En <strong>la</strong>s últimas décadas se han <strong>de</strong>sarrol<strong>la</strong>do una serie <strong>de</strong> líneas <strong>de</strong> mosquitos quehan resultado ser mucho más sensibles a <strong>la</strong> infección por <strong>el</strong> virus que con lossistemas anteriores. Dentro <strong>de</strong> <strong>la</strong>s más utilizadas se encuentran <strong>la</strong>s célu<strong>la</strong>s AP-61, C6\36, TRA-284 y C6\36 HT. La <strong>el</strong>evada sensibilidad <strong>de</strong> estos sistemas, hapermitido alcanzar un alto índice <strong>de</strong> ais<strong>la</strong>miento.Actualmente se emplea con éxito <strong>la</strong> inocu<strong>la</strong>ción intratorácica <strong>de</strong> mosquitos. Estemétodo ha <strong>de</strong>mostrado ser <strong>el</strong> más sensible.Ratón <strong>la</strong>ctante1. Inocu<strong>la</strong>r por vía intracerebral y subcutánea en ratón <strong>la</strong>ctante (7 ratonespor familia) <strong>de</strong> 1 a 3 días <strong>de</strong> nacidos, 0.02 ml <strong>de</strong> <strong>la</strong> muestra pura y diluida1:10 y 1:50 en medio <strong>de</strong> cultivo o PBS + antibióticos y 2% <strong>de</strong> suero fetalbovino (SFB).2. Observar diariamente durante 21 días (<strong>de</strong>be producirse un cuadroencefálico aunque en ocasiones hay cepas que no se adaptan y sóloproducen cambios ligeros en los ratones como erizamiento <strong>de</strong>l p<strong>el</strong>o,marcha en punta <strong>de</strong> patas entre otros).
103. Si se observa cualquier signo <strong>de</strong> enfermedad <strong>de</strong>be realizarse un pase en <strong>el</strong>mismo sistema (<strong>para</strong> adaptar <strong>la</strong> cepa) y en otro más sensible <strong>de</strong> serposible. Para realizar <strong>el</strong> pase, los ratones son <strong>de</strong>sinfectados con alcohol al70% y sus cerebros son cosechados guardándose a temperaturas <strong>de</strong> -70 o Có <strong>de</strong> lo contrario se pre<strong>para</strong> una suspensión al 10%(v/v) utilizando medio<strong>de</strong> cultivo o PBS con 2% <strong>de</strong> SFB, <strong>la</strong> que pue<strong>de</strong> almacenarse a igualtemperatura o procesarse inmediatemente.4. La i<strong>de</strong>ntificación rápida pue<strong>de</strong> hacerse por Inmunofluorescencia Indirecta(IFI) utilizando Líquidos Ascíticos Hiperinmunes (LAH) y anticuerposmonoclonales (AcM) o por Neutralización. También pue<strong>de</strong> pre<strong>para</strong>rse unantígeno por <strong>el</strong> método <strong>de</strong> extracción <strong>de</strong> sacarosa-acetona <strong>para</strong> i<strong>de</strong>ntificarmediante <strong>la</strong> técnica <strong>de</strong> Inhibición <strong>de</strong> <strong>la</strong> Hemaglutinación (IH).Célu<strong>la</strong>s <strong>de</strong> MamíferosEl virus <strong>de</strong>ngue es capaz <strong>de</strong> multiplicarse en varias líneas c<strong>el</strong>u<strong>la</strong>res <strong>de</strong> mamíferoscomo <strong>la</strong>s célu<strong>la</strong>s BHK21, KB, VERO, no obstante <strong>la</strong>s mas sensibles son <strong>la</strong>s <strong>de</strong>riñón <strong>de</strong> mono ver<strong>de</strong> africano LLCMK2, útiles no solo en <strong>el</strong> ais<strong>la</strong>miento sinotambién <strong>para</strong> <strong>la</strong> i<strong>de</strong>ntificación aunque son menos sensibles que <strong>la</strong>s célu<strong>la</strong>s <strong>de</strong>mosquitos.1. Inocu<strong>la</strong>r, en frasco <strong>de</strong> 25 cm 2 con monocapa c<strong>el</strong>u<strong>la</strong>r confluente, 0.5 ml <strong>de</strong>lsuero previa <strong>de</strong>cantación <strong>de</strong>l medio <strong>de</strong>l frasco. En algunos casos se prefierediluir <strong>la</strong> muestra en medio <strong>de</strong> cultivo (1\20-1\30) <strong>para</strong> <strong>el</strong>iminar <strong>el</strong> efectotóxico que pueda producir en <strong>la</strong>s célu<strong>la</strong>s.2. Incubar a 37 o C por una hora y añadir posteriormente <strong>el</strong> medio <strong>de</strong>mantenimiento <strong>de</strong> <strong>la</strong>s célu<strong>la</strong>s.3. Observar durante 7 días <strong>la</strong> aparición <strong>de</strong> Efecto Citopatógenico (ECP):redon<strong>de</strong>amiento y <strong>de</strong>sprendimiento <strong>de</strong> <strong>la</strong>s célu<strong>la</strong>s.4. Cong<strong>el</strong>ar y <strong>de</strong>scong<strong>el</strong>ar por 3 veces y realizar un pase en <strong>el</strong> mismo sistema<strong>para</strong> aumentar <strong>el</strong> título viral.5. De no observarse ECP, pue<strong>de</strong> hacerse <strong>de</strong> rutina un p<strong>la</strong>queo viral o una<strong>de</strong>tección por IFI <strong>para</strong> saber si se ha multiplicado algún virus.
116. La i<strong>de</strong>ntificación rápida se hace por IFI y <strong>la</strong> confirmación por reducción<strong>de</strong>l número <strong>de</strong> p<strong>la</strong>cas por neutralización.Cultivos c<strong>el</strong>u<strong>la</strong>res <strong>de</strong> mosquitosSon <strong>la</strong>s célu<strong>la</strong>s más sensibles <strong>para</strong> <strong>el</strong> ais<strong>la</strong>miento <strong>de</strong>l <strong>de</strong>ngue y pue<strong>de</strong>n serutilizadas <strong>la</strong>s C6\36, AP61, Tra-284-SF y C6\36 HT en este or<strong>de</strong>n creciente <strong>de</strong>sensibilidad. Es <strong>de</strong> seña<strong>la</strong>r que algunas sublíneas <strong>de</strong>l clono c<strong>el</strong>u<strong>la</strong>r C6\36 se hanvu<strong>el</strong>to menos sensibles a los virus <strong>de</strong>l <strong>de</strong>ngue sugiriendo que este sistema c<strong>el</strong>u<strong>la</strong>rno es homogéneo y ha revertido apareciendo célu<strong>la</strong>s menos sensibles. Aúncuando algunas pocas célu<strong>la</strong>s se infectan, varias cepas no se replican y nofavorecen <strong>la</strong> diseminación al resto <strong>de</strong> <strong>la</strong>s célu<strong>la</strong>s lo que influye en <strong>la</strong> i<strong>de</strong>ntificación<strong>de</strong> los virus utilizando anticuerpos monoclonales. Las ventajas <strong>de</strong> esta líneac<strong>el</strong>u<strong>la</strong>r son su facilidad <strong>de</strong> manipu<strong>la</strong>ción y rapi<strong>de</strong>z <strong>de</strong> crecimiento.La línea c<strong>el</strong>u<strong>la</strong>r AP61 es altamente sensible a los virus <strong>de</strong>l <strong>de</strong>ngue mostrandofrecuentemente ECP <strong>de</strong> tipo sincitial. Aunque algunos autores p<strong>la</strong>ntean <strong>la</strong>dificultad <strong>de</strong> i<strong>de</strong>ntificar los ais<strong>la</strong>mientos en estas célu<strong>la</strong>s utilizando <strong>la</strong> IFI, dichatécnica es útil si se dispersan bien <strong>la</strong>s célu<strong>la</strong>s al realizar <strong>la</strong> suspensión <strong>de</strong> <strong>la</strong>smismas.La línea c<strong>el</strong>u<strong>la</strong>r TRA-284-SF es muy sensible <strong>para</strong> <strong>el</strong> ais<strong>la</strong>miento <strong>de</strong>l <strong>de</strong>ngue. Sonfáciles <strong>de</strong> manipu<strong>la</strong>r y muy económicas ya que crecen en medio libre STF aunquesu v<strong>el</strong>ocidad <strong>de</strong> crecimiento y split no son gran<strong>de</strong>s. Son <strong>de</strong> mayor tamaño que <strong>la</strong>sC6\36 y <strong>el</strong> “screening” mediante <strong>la</strong> IFI es r<strong>el</strong>ativamente fácil.Recientemente ha comenzado a utilizarse una sublínea <strong>de</strong>l clono C6\36 capaz <strong>de</strong>multiplicarse a 34 0 C. Algunos autores p<strong>la</strong>ntean que esta sublínea <strong>de</strong> altatemperatura (C6\36 HT) resiste sólo varias semanas <strong>de</strong> mantenimiento bajo estascondiciones y proponen tomar <strong>el</strong> clono original <strong>de</strong> 28 0 C y readaptarlo a crecer a34 0 C cada vez que <strong>el</strong> <strong>de</strong>terioro provocado por <strong>la</strong> <strong>el</strong>evada temperatura lo exija;entre los investigadores <strong>de</strong> <strong>la</strong> región se ha propagado esta sublínea C6\36 HT queha <strong>de</strong>mostrado mayor eficacia <strong>para</strong> <strong>el</strong> ais<strong>la</strong>miento viral al a<strong>de</strong><strong>la</strong>ntar <strong>la</strong> <strong>de</strong>tecciónpor IFI (inmunofluorescencia indirecta) y aumentar <strong>el</strong> número <strong>de</strong> ais<strong>la</strong>mientos.Como método general se inocu<strong>la</strong> <strong>la</strong> muestra, se espera <strong>de</strong> 10 a 14 días(observando <strong>la</strong> posible aparición <strong>de</strong> efecto citopatogénico (ECP)) y se realiza IFI,primero como “screening” utilizando un “pool” <strong>de</strong> sueros humanos positivos o
12líquidos ascíticos hiperinmunes (LAH). En los casos positivos se realiza una IFIutilizando Acs monoclonales específicos a los 4 serotipos <strong>de</strong>l <strong>de</strong>ngue. Enocasiones se presentan dificulta<strong>de</strong>s al utilizar estos anticuerpos monoclonalesdada <strong>la</strong> alta especificidad <strong>de</strong> los mismos, <strong>el</strong> bajo título viral y <strong>el</strong> grado <strong>de</strong> ECPentre otros factores.La confirmación pue<strong>de</strong> realizarse por neutralización por reducción <strong>de</strong>l número <strong>de</strong>p<strong>la</strong>cas previo título <strong>de</strong>l virus ais<strong>la</strong>do.Inocu<strong>la</strong>ción intratorácica <strong>de</strong> mosquitosDada su <strong>el</strong>evada sensibilidad, <strong>la</strong> inocu<strong>la</strong>ción <strong>de</strong> mosquitos es <strong>el</strong> método <strong>de</strong><strong>el</strong>ección <strong>para</strong> <strong>el</strong> ais<strong>la</strong>miento <strong>de</strong>l <strong>de</strong>ngue principalmente en aqu<strong>el</strong>los casos <strong>de</strong>Fiebre Hemorrágica <strong>de</strong>l Dengue/Síndrome <strong>de</strong> Choque por Dengue (FHD/SCD).Es conveniente utilizar los anticuerpos monoclonales específicos <strong>para</strong> cadaserotipo en <strong>la</strong> i<strong>de</strong>ntificación a partir <strong>de</strong>l cerebro <strong>de</strong>l mosquito infectado. Enalgunos casos pue<strong>de</strong> haber fluorescencia inespecífica lo que conlleva a resultadoserróneos.Entre <strong>la</strong>s especies <strong>de</strong> mosquitos utilizadas en <strong>el</strong> ais<strong>la</strong>miento están <strong>el</strong> Ae<strong>de</strong>saegypti, <strong>el</strong> Ae<strong>de</strong>s albopictus y <strong>el</strong> T. amboinensis. Como vías <strong>de</strong> inocu<strong>la</strong>ción seutilizan <strong>la</strong> intracerebral y <strong>la</strong> intratorácica.Los mosquitos a utilizar en esta técnica se inmovilizan sometiéndolos a bajastemperaturas, pero en algunas ocasiones que son resistentes al frío, se <strong>de</strong>bentomar medidas adicionales principalmente si estamos utilizando hembras que <strong>de</strong>escaparse crearían un riesgo <strong>de</strong> transmisión. Entre <strong>la</strong>s medidas a tomar seencuentran <strong>el</strong> uso <strong>de</strong> CO 2 u otros anestésicos con mucha precaución, ya quepue<strong>de</strong>n causar efectos letales sobre los mosquitos.La zona <strong>de</strong> inocu<strong>la</strong>ción en <strong>el</strong> mosquito <strong>de</strong>pen<strong>de</strong> <strong>de</strong>l sexo y <strong>la</strong> especie.Generalmente <strong>para</strong> los machos se usa <strong>la</strong> membrana <strong>de</strong>l cu<strong>el</strong>lo y <strong>para</strong> <strong>la</strong>shembras, o bien en <strong>el</strong> cu<strong>el</strong>lo o en <strong>la</strong> sutura <strong>de</strong>bajo <strong>de</strong>l primer espiráculo torácico.El equipo diseñado por Rosen et al., es <strong>de</strong> fácil manejo y permite contro<strong>la</strong>r <strong>el</strong>volumen <strong>de</strong> suspensión viral a inocu<strong>la</strong>r. La parte que más se <strong>de</strong>be reponer es <strong>el</strong>capi<strong>la</strong>r-aguja, <strong>el</strong> cual <strong>de</strong>be ser aguzado al calor o en un equipo especial. Estoscapi<strong>la</strong>res son graduados a distancias <strong>de</strong> 1mm lo que correspon<strong>de</strong> a un volumen<strong>de</strong> 0,17µL
13Al escoger <strong>la</strong> especie <strong>de</strong> mosquito <strong>para</strong> ser inocu<strong>la</strong>da se <strong>de</strong>be tener en cuenta, quées lo que queremos ais<strong>la</strong>r o amplificar. A través <strong>de</strong> los estudios <strong>de</strong> Rosen seconoción que <strong>el</strong> Dengue no se replica en Culex quinquefasciatus.A partir <strong>de</strong> <strong>la</strong> imp<strong>la</strong>ntación <strong>de</strong> esta técnica se comenzaron a utilizar mosquitos <strong>de</strong>lgénero Toxorhynchites, que aunque no son vectores <strong>de</strong>bido a que sus estructurasbucales no están acondicionadas <strong>para</strong> <strong>la</strong> hematofagia, son exc<strong>el</strong>entesamplificadores <strong>de</strong> varios arbovirus como <strong>el</strong> <strong>de</strong>ngue.Las principales ventajas que implica <strong>el</strong> uso <strong>de</strong> este método son:1. Los mosquitos vivos son más sensibles a <strong>la</strong> infección por <strong>de</strong>ngue que ningúnotro método <strong>de</strong> ensayo.2. No se necesitan gran<strong>de</strong>s recursos ni equipos sofisticados.3. La replicación <strong>de</strong> virus en mosquitos vivos pue<strong>de</strong> ser mantenida en un rangomás amplio <strong>de</strong> temperatura a diferencia <strong>de</strong> lo que ocurre cuando se utilizancultivos c<strong>el</strong>u<strong>la</strong>res.Materiales:‣ Capi<strong>la</strong>r aguja: Diámetro exterior 0.7-1 mm, diámetro interioraproximadamente 0.5 mm y grosor <strong>de</strong> <strong>la</strong> pared 0.2 mm.‣ Porta capi<strong>la</strong>r.‣ Jeringuil<strong>la</strong> <strong>de</strong> 20 cc.‣ Tubos <strong>de</strong> goma.‣ L<strong>la</strong>ve <strong>de</strong> 3 salidas.‣ Microscopio estereo.Método:1. Pre<strong>para</strong>r <strong>el</strong> sistema <strong>de</strong> inocu<strong>la</strong>ción y materiales a utilizar.2. Colocar los mosquitos en tubo <strong>de</strong> cristal y <strong>de</strong>ntro <strong>de</strong> un baño <strong>de</strong> hi<strong>el</strong>o porespacio <strong>de</strong> 10 - 15 minutos.3. Cargar <strong>el</strong> capi<strong>la</strong>r con <strong>la</strong> suspensión <strong>de</strong>l material a inocu<strong>la</strong>r evitando que <strong>el</strong>líquido llegue al porta-capi<strong>la</strong>r.4. Colocar <strong>el</strong> mosquito sobre <strong>la</strong> p<strong>la</strong>tina <strong>de</strong>l estéreo <strong>para</strong> localizar <strong>el</strong> área <strong>de</strong>inocu<strong>la</strong>ción.
145. Introducir aproximadamente 1 mm <strong>de</strong> <strong>la</strong> punta <strong>de</strong>l capi<strong>la</strong>r en <strong>la</strong> zona <strong>de</strong>inocu<strong>la</strong>ción y accionar <strong>la</strong> jeringuil<strong>la</strong> <strong>de</strong> manera tal que <strong>de</strong>je pasar 1 mm <strong>de</strong>suspensión viral (0,17 uL).6. Colocar <strong>el</strong> mosquito en una pequeña jau<strong>la</strong> sin tocarlo y sobre esta colocar unalgodón embebido en una solución <strong>de</strong> sacarosa al 10%.7. La jau<strong>la</strong> es colocada <strong>de</strong>ntro <strong>de</strong> una bolsa <strong>de</strong> plástico transparente comomedida <strong>de</strong> seguridad <strong>para</strong> evitar <strong>el</strong> escape <strong>de</strong> los mosquitos inocu<strong>la</strong>dos.8. Los mosquitos <strong>de</strong>ben ser observados a <strong>la</strong>s 24 horas <strong>para</strong> <strong>de</strong>tectar <strong>la</strong>mortalidad ocasionada por <strong>la</strong> inocu<strong>la</strong>ción.9. El tiempo <strong>para</strong> colectar los mosquitos <strong>de</strong>spués <strong>de</strong> inocu<strong>la</strong>dos <strong>de</strong>pen<strong>de</strong>rá <strong>de</strong>lvirus o <strong>de</strong> los propósitos <strong>de</strong> investigación.10. La <strong>de</strong>tección viral se pue<strong>de</strong> realizar por medio <strong>de</strong> <strong>la</strong>s siguientes técnicas: FC,IFI, neutralización (Nt), ELISA y otras.
15LÍNEA CELULAR C6\36La línea c<strong>el</strong>u<strong>la</strong>r C6\36 (Igarachi, 1978) es un clono obtenido <strong>de</strong> <strong>la</strong> línea Ae<strong>de</strong>salbopictus <strong>de</strong> Singh (1967), que presenta una alta sensibilidad a los virus <strong>de</strong>l<strong>de</strong>ngue y Chikungunya, aunque en estudios realizados (Kuno, 1985) se ha<strong>de</strong>mostrado que resultan menos sensibles en com<strong>para</strong>ción con otras líneasc<strong>el</strong>u<strong>la</strong>res <strong>de</strong> mosquitos tales como <strong>la</strong> AP61 (ae<strong>de</strong>s albopictus) y <strong>la</strong>s TRA-284.Algunas cepas <strong>de</strong> <strong>de</strong>ngue son capaces <strong>de</strong> producir ECP (efecto citopatogénico) <strong>de</strong>tipo sincitial en <strong>la</strong>s C6\36 pero este fenómeno no es característico <strong>de</strong> <strong>la</strong> línea.Con mucha frecuencia se observa toxicidad en <strong>la</strong>s célu<strong>la</strong>s a causa <strong>de</strong> los inóculosempleados.Medios y Materiales:Medio <strong>de</strong> Crecimiento <strong>para</strong> 100 mlMEM (Earle) 10X10 mLSFB (Inactivado)10 mLSolución 100X aminoácidos no 2 mLesencialesGlutamina 200 mM1 mLCompletar a 100 mL con agua bi<strong>de</strong>sti<strong>la</strong>da y ajustar <strong>el</strong> pH a 7,2-7,4. De <strong>la</strong>s firmascomerciales Gibco y Flow pue<strong>de</strong> obtenerse <strong>el</strong> medio MEM Earle con aminoácidosno esenciales y glutamina, al que sólo es necesario añadir STF.Se requieren pipetas <strong>de</strong> 5-10 mL con <strong>la</strong> punta dob<strong>la</strong>da en ángulo <strong>de</strong> 90 grados opolicía <strong>de</strong> goma.Siembra <strong>de</strong> <strong>la</strong>s célu<strong>la</strong>s1. Decantar <strong>el</strong> medio <strong>de</strong> un frasco Roux con monocapa confluente2. Despren<strong>de</strong>r <strong>la</strong>s célu<strong>la</strong>s en 10 mL <strong>de</strong> medio <strong>de</strong> crecimiento <strong>de</strong> forma tal que <strong>el</strong>medio caiga perpendicu<strong>la</strong>r a <strong>la</strong> monocapa c<strong>el</strong>u<strong>la</strong>r o <strong>de</strong>spren<strong>de</strong>r raspando <strong>la</strong>superficie con un policía <strong>de</strong> goma (grstoit).3. Añadir 1 mL <strong>de</strong> suspensión c<strong>el</strong>u<strong>la</strong>r a cada Roux que contenga <strong>de</strong> 100-120 mL<strong>de</strong> medio <strong>de</strong> crecimiento (“split” 1:10 semanal) lo que es equivalente a 8x10 4célu<strong>la</strong>s/mL incubar a 28 o C. La monocapa estara completa en 4-5 días.
164. Si fuera necesario realizar <strong>la</strong> inocu<strong>la</strong>ción a los tres días <strong>de</strong> sembradas <strong>la</strong>scélu<strong>la</strong>s, <strong>de</strong>be aumentarse <strong>la</strong> concentración a 2-3x10 5 célu<strong>la</strong>s/ mL utilizando<strong>para</strong> <strong>el</strong>lo una razón <strong>de</strong> pase <strong>de</strong> 1:5-1:6. El medio que se emplea <strong>para</strong>mantener <strong>la</strong>s célu<strong>la</strong>s <strong>de</strong>spués <strong>de</strong> inocu<strong>la</strong>das es <strong>el</strong> medio <strong>de</strong> crecimiento <strong>de</strong> <strong>la</strong>línea, pero sólo es necesario suplementarlo con 2% SFB.Cong<strong>el</strong>ación1. Añadir 4 mL <strong>de</strong> medio <strong>de</strong> crecimiento y 1 mL <strong>de</strong> SFB en un frasco <strong>de</strong> 10 mLrotu<strong>la</strong>do como #1. Colóqu<strong>el</strong>o en un baño <strong>de</strong> hi<strong>el</strong>o.2. Añadir 4 ml <strong>de</strong> medio y 1 mL <strong>de</strong> Dimetilsulfóxido (DMS) en otro frasco <strong>de</strong> 10mL rotu<strong>la</strong>do como # 2. Colóqu<strong>el</strong>o en un baño <strong>de</strong> hi<strong>el</strong>o.3. Decantar <strong>el</strong> medio <strong>de</strong> un Roux (monocapa confluente <strong>de</strong> tres a cinco días <strong>de</strong>sembrada).4. Con <strong>la</strong> pipeta <strong>de</strong> 5mL <strong>de</strong> punta curva, extraiga los 5 mL <strong>de</strong>l frasco #1 y<strong>de</strong>sprenda <strong>la</strong>s célu<strong>la</strong>s <strong>de</strong>l Roux. Opcionalmente pue<strong>de</strong> utilizar policía <strong>de</strong> gomay pipeta normal.5. Echar <strong>la</strong> suspensión en <strong>el</strong> frasco #1.6. Añadir con una pipeta <strong>de</strong> 5 mL <strong>el</strong> medio <strong>de</strong>l frasco # 2 al frasco # 1, gota agota y agitando (siempre en baño <strong>de</strong> hi<strong>el</strong>o).7. Colocar 1 mL <strong>de</strong> <strong>la</strong> suspensión c<strong>el</strong>u<strong>la</strong>r (1-2x10 6 célu<strong>la</strong>s/mL) en cada ámpu<strong>la</strong><strong>de</strong> cong<strong>el</strong>ación y manténga<strong>la</strong>s en <strong>el</strong> baño <strong>de</strong> hi<strong>el</strong>o. Deje 0.1 mL <strong>para</strong> <strong>la</strong> prueba<strong>de</strong> esterilidad.8. Guardar <strong>la</strong>s ámpu<strong>la</strong>s a -20 o C durante 1 hora9. Pase <strong>la</strong>s ámpu<strong>la</strong>s a una caja <strong>de</strong> poliespuma y guár<strong>de</strong><strong>la</strong>s a -70 o C por toda <strong>la</strong>noche.10. Coloque <strong>la</strong>s ámpu<strong>la</strong>s en termo <strong>de</strong> nitrógeno líquido (-196).Descong<strong>el</strong>ación1. Saque <strong>el</strong> ámpu<strong>la</strong> <strong>de</strong>l nitrógeno y éch<strong>el</strong>a directamente en agua a 37 o C hastaque se <strong>de</strong>scong<strong>el</strong>e su contenido.2. Desinfecte <strong>el</strong> ámpu<strong>la</strong> (exterior) con alcohol al 70%3. Con una pipeta <strong>de</strong> 1 mL extraiga <strong>el</strong> contenido <strong>de</strong>l ámpu<strong>la</strong> y éch<strong>el</strong>o en unfrasco <strong>de</strong> 25 cm 2 que contenga 4.9 ml <strong>de</strong> medio <strong>de</strong> crecimiento. Guar<strong>de</strong> a28 o C.4. Cambie <strong>el</strong> medio a <strong>la</strong>s 24 horas, por medio fresco <strong>de</strong> crecimiento.
175. Cuando <strong>la</strong> monocapa esté completa pase <strong>la</strong>s célu<strong>la</strong>s con split 1:5 inicialmente,luego pue<strong>de</strong> restablecer <strong>el</strong> split acostumbrado.Inocu<strong>la</strong>ción1. Decante <strong>el</strong> medio <strong>de</strong> un frasco <strong>de</strong> 25 cm 2 con monocapa célu<strong>la</strong>r confluente.2. Inocule 0.2mL <strong>de</strong> una dilución 1:20 <strong>de</strong> <strong>la</strong> muestra <strong>de</strong> suero e incube por 1hora a 28 o C. En ocasiones se produce efecto tóxico por lo que es necesarioinocu<strong>la</strong>r <strong>la</strong> muestra directamente en <strong>el</strong> medio contenido en <strong>el</strong> frasco (Se aña<strong>de</strong>0.2 mL <strong>de</strong> <strong>la</strong> muestra a los 4 ml <strong>de</strong>l medio <strong>de</strong>l frasco)3. Observar durante 10-14 días. Cambiar <strong>el</strong> medio si se produce efecto tóxico.4. Para <strong>la</strong> i<strong>de</strong>ntificación, realizar <strong>la</strong> IFI utilizando anticuerpos monoclonales oLAH. También pue<strong>de</strong> utilizarse <strong>el</strong> sobrenadante como inóculo <strong>para</strong>neutralización por reducción <strong>de</strong>l número <strong>de</strong> p<strong>la</strong>cas.5. En caso <strong>de</strong> utilizar tubos con monocapa confluente, inocu<strong>la</strong>r 0.1mL <strong>de</strong> unadilución <strong>de</strong>l suero 1:30. Después <strong>de</strong> 1h <strong>de</strong> adsorción a <strong>la</strong> temperaturaindicada, añadir 1mL <strong>de</strong> medio <strong>de</strong> mantenimiento.En <strong>la</strong>s fotos 1 y 2 se presenta un cultivo control <strong>de</strong> célu<strong>la</strong>s C6\36 y otroinocu<strong>la</strong>do con virus <strong>de</strong>ngue 2 don<strong>de</strong> pue<strong>de</strong> observarse un sincitio característico.Foto 1 Foto 2
18Línea C<strong>el</strong>u<strong>la</strong>r TRA-284-SFLa línea c<strong>el</strong>u<strong>la</strong>r TRA-284-SF, es una sublínea <strong>de</strong> <strong>la</strong> TRA-284 obtenida por G.Kunoa partir <strong>de</strong> mosquitos T. amboinensis. Crece en medio libre <strong>de</strong> suero fetal bovino(SFB) y algunas cepas <strong>de</strong> <strong>de</strong>ngue pue<strong>de</strong>n producir ECP. Estudios realizados hanmostrado que es más sensible <strong>para</strong> <strong>el</strong> ais<strong>la</strong>miento <strong>de</strong>l virus <strong>de</strong>ngue que <strong>la</strong> AP61 y<strong>la</strong> C6\36.Materiales:‣ Medio <strong>de</strong> crecimiento: L-15 + 50 % <strong>de</strong>caldo Triptosa Fosfato (TBP) al 2.9 %‣ Policía <strong>de</strong> goma‣ Dimetil Sulfóxido (DMSO)Multiplicación <strong>de</strong> <strong>la</strong> línea1. Decante <strong>el</strong> medio <strong>de</strong> un frasco <strong>de</strong> 25 cm 2 .2. Añada 0.3 mL <strong>de</strong> medio <strong>de</strong> crecimiento al frasco.3. Desprenda <strong>la</strong>s célu<strong>la</strong>s con <strong>el</strong> policía <strong>de</strong> goma.4. Pipetee <strong>de</strong>licadamente <strong>la</strong> suspensión c<strong>el</strong>u<strong>la</strong>r <strong>para</strong> disgregar los grumos conpipeta <strong>de</strong> 1 mL.5. Añada 0.1mL <strong>de</strong> <strong>la</strong> suspensión c<strong>el</strong>u<strong>la</strong>r a un frasco <strong>de</strong> 25 cm 2 que contenga 4.9mL <strong>de</strong> medio <strong>de</strong> crecimiento. Split máximo semanal <strong>de</strong> 1:3. Incubar a 28 o C.6. A <strong>la</strong>s 24-48 horas, si no hay buena adhesión o en los grumos c<strong>el</strong>u<strong>la</strong>res no seobserva crecimiento, cambie <strong>la</strong> mitad <strong>de</strong>l medio <strong>de</strong> crecimiento <strong>de</strong> cada frascopor medio fresco. La monocapa tiene aspecto poroso, y raras veces escompletamente confluente.Cong<strong>el</strong>ación1. Coloque un frasco <strong>de</strong> 10 mL en baño <strong>de</strong> hi<strong>el</strong>o.2. Decante <strong>el</strong> medio <strong>de</strong>l frasco <strong>de</strong> 25 cm 2 .3. Añada 1 mL <strong>de</strong> medio fresco.4. Desprenda <strong>la</strong>s célu<strong>la</strong>s con <strong>el</strong> policía <strong>de</strong> goma.5. Con una pipeta <strong>de</strong> 1 mL tome <strong>la</strong> suspensión c<strong>el</strong>u<strong>la</strong>r y pónga<strong>la</strong> en <strong>el</strong> frascosobre <strong>el</strong> baño <strong>de</strong> hi<strong>el</strong>o.6. Añada 0.1mL <strong>de</strong> DMSO al frasco (<strong>de</strong>l baño <strong>de</strong> hi<strong>el</strong>o) que contiene <strong>la</strong>suspensión c<strong>el</strong>u<strong>la</strong>r.7. Ponga en un ámpu<strong>la</strong> <strong>de</strong> cong<strong>el</strong>ación y guár<strong>de</strong><strong>la</strong> a -20 o C durante 30 minutos.
198. Manténga<strong>la</strong> en una caja <strong>de</strong> poliespuma a -70 o C durante toda <strong>la</strong> noche.9. Pase <strong>el</strong> ámpu<strong>la</strong> directamente a nitrógeno líquido (-196 0 C).Descong<strong>el</strong>ación1. Saque <strong>el</strong> ámpu<strong>la</strong> <strong>de</strong>l nitrógeno directamente a un baño <strong>de</strong> agua a 37 o C hastaque se <strong>de</strong>scong<strong>el</strong>e su contenido.2. Con pipeta <strong>de</strong> 1mL saque <strong>el</strong> contenido <strong>de</strong>l ámpu<strong>la</strong> y viértalo en un frasco <strong>de</strong>siembra <strong>de</strong> 25 cm 2 que contenga 4.9 ml <strong>de</strong> medio <strong>de</strong> crecimiento. Incube a 28 oC.3. A <strong>la</strong>s 4 horas cambie <strong>la</strong> mitad <strong>de</strong>l medio por medio fresco. Tenga cuidado <strong>de</strong>no arrastrar <strong>la</strong>s célu<strong>la</strong>s. Para <strong>el</strong>lo, ponga en posición vertical <strong>el</strong> frasco durante1-2 minutos y <strong>de</strong>je sedimentar <strong>la</strong>s célu<strong>la</strong>s que aún no se han adherido yextraiga <strong>el</strong> medio <strong>de</strong> <strong>la</strong> mitad superior.4. Incube a 28 o C y cambie nuevamente <strong>el</strong> 50% <strong>de</strong> medio a <strong>la</strong>s 24-48 horas.Inocu<strong>la</strong>ción1. En un frasco <strong>de</strong> 25 cm 2 con capa c<strong>el</strong>u<strong>la</strong>r casi confluente al que previamente s<strong>el</strong>e habían quitado 3 mL <strong>de</strong>l medio <strong>de</strong> crecimiento inocu<strong>la</strong>r 0.05mL <strong>de</strong> <strong>la</strong>muestra (suero).2. Incube a 28 o C por una hora.3. Añada 3 mL <strong>de</strong> medio.4. Incubar a 28 o C por 10 días.5. En algunos casos se pue<strong>de</strong> producir ECP.6. La i<strong>de</strong>ntificación se realiza por medio <strong>de</strong> <strong>la</strong> IFI utilizando LAH o Acs.monoclonales o por neutralización por reducción <strong>de</strong>l número <strong>de</strong> p<strong>la</strong>cas.En <strong>la</strong> foto se presenta un cultivo <strong>de</strong>célu<strong>la</strong>s TRA-284 no inocu<strong>la</strong>das.
20Línea C<strong>el</strong>u<strong>la</strong>r AP-61Las célu<strong>la</strong>s <strong>de</strong> mosquito AP61 (Ae<strong>de</strong>s pseudoscut<strong>el</strong><strong>la</strong>ris) han sido ampliamenteutilizadas <strong>para</strong> <strong>el</strong> ais<strong>la</strong>miento e i<strong>de</strong>ntificación <strong>de</strong> los virus <strong>de</strong>l <strong>de</strong>ngue los queproducen efecto citopático <strong>de</strong> tipo sincitial en <strong>la</strong>s mismas. También han sidoutilizadas <strong>para</strong> ais<strong>la</strong>r e i<strong>de</strong>ntificar <strong>el</strong> virus <strong>de</strong> <strong>la</strong> Fiebre Amaril<strong>la</strong> <strong>el</strong> que provoca<strong>de</strong>sprendimiento c<strong>el</strong>u<strong>la</strong>r. Estas célu<strong>la</strong>s fueron obtenidas a partir <strong>de</strong> <strong>la</strong>rvas <strong>de</strong>mosquitos Ae<strong>de</strong>s pseudoscut<strong>el</strong><strong>la</strong>ris por Varma y cols en 1974. Es sensible avarios arbovirus como Chikungunya, Encefalitis Japonesa B, Oeste <strong>de</strong>l Nilo yotros. Se mantiene creciendo en frascos <strong>de</strong> vidrio y los autores recomiendanpasar<strong>la</strong>s a plástico <strong>para</strong> <strong>la</strong> inocu<strong>la</strong>ción. Su mayor sensibilidad ocurre a pasesbajos (menores <strong>de</strong> 60).Materiales:‣ Medio <strong>de</strong> crecimiento.‣ Medio <strong>de</strong> mantenimiento.‣ Policía <strong>de</strong> goma.‣ Suero <strong>de</strong> fetal bovino (Inactivado a 56 o C por 30 minutos).‣ Antibióticos.‣ Incubadora <strong>de</strong> 28 o C.‣ Unidad <strong>de</strong> filtración.‣ Cristalería pre<strong>para</strong>da <strong>para</strong> cultivo <strong>de</strong> tejidos.Medio <strong>de</strong> mantenimientoEl medio <strong>de</strong> mantenimiento pue<strong>de</strong> obtenerse comercialmente y está constituido abase <strong>de</strong> medio Leibovitz (L-15). El mismo se pre<strong>para</strong> <strong>de</strong> <strong>la</strong> siguiente forma:1. Filtrar <strong>el</strong> medio L-15 por membrana 0.22 um2. Realizar prueba <strong>de</strong> esterilidad.Medio <strong>de</strong>crecimientoMedio <strong>de</strong>mantenimientoL-15 (con L glutamina) 80 mL 88 mLCaldo Triptosa fosfato (TPB) 10 mL 10 mLSTF 10 mL 2 mLAntibióticos (0.1 mL/100mL total <strong>de</strong> medio).O sea, 100 U/ml <strong>de</strong> penicilina y 100µg/mL <strong>de</strong> estreptomicina. El SFB, <strong>de</strong>be estar inactivado a 56 o C por 30 minutos.
21Medio <strong>de</strong> crecimiento MM/VP12 combinado:Para un total <strong>de</strong>... 800 mL 1600 mLNaCl 5060 mg 10120 mgNaH 2 PO4 2H2O 320 mg 640 mgMgCl 2 6H2O 490 mg 980 mgMgSO 4 7H2O 480 mg 960 mgKCl 320 mg 640 mgCaCl 2 2H 2 O 260 mg 520 mgNaHCO 3 260 mg 520 mgGlucosa(anhidro) 2800 mg 5600 mgCloruro <strong>de</strong> colina 100 mg 200 mgInositol 160 mL 320 mgHLA 5250 mg 10500 mgAlbumina bovina(V) 400 mg 800 mgYesto<strong>la</strong>te 2500 mg 5000 mgGlutamina (200mM) 2.4 mL 4.8 mLBME vitamina (100x) 8 mL 16 mLAgua <strong>de</strong>sti<strong>la</strong>da 789.6 mL 1579.2 mLAl pre<strong>para</strong>r 800ml, <strong>el</strong> pH es <strong>de</strong> aproximadamente 6.5, llevar hasta 6.8 con 2ml<strong>de</strong> KOH 2%.Al pre<strong>para</strong>r 1600mL, <strong>el</strong> pH es <strong>de</strong> aproximadamente 6.5, llevar hasta 6,8 con 5 ml<strong>de</strong> KOH 2%.Propagación <strong>de</strong> <strong>la</strong> líneaEl volumen <strong>de</strong> medio por frasco <strong>de</strong> 25 cm 2 es <strong>de</strong> 4 mL y <strong>el</strong> total <strong>de</strong> célu<strong>la</strong>s <strong>de</strong>1.6x10 6 <strong>de</strong>pendiendo <strong>de</strong>l tiempo <strong>de</strong> sembrado. La razón <strong>de</strong> pase o split es <strong>de</strong> 1:10.1. Pre<strong>para</strong>r <strong>el</strong> medio <strong>de</strong> crecimiento <strong>de</strong> acuerdo al volumen requerido (<strong>para</strong>propagar <strong>la</strong> línea se utiliza <strong>el</strong> medio <strong>de</strong> crecimiento).2. Eliminar <strong>el</strong> medio <strong>de</strong>l frasco que se va a pasar y añadir 1 mL <strong>de</strong> medioMMVP12 <strong>de</strong> crecimiento (<strong>para</strong> un frasco <strong>de</strong> 25cm 2 ).3. Despren<strong>de</strong>r <strong>la</strong>s célu<strong>la</strong>s usando un policía <strong>de</strong> goma.4. Dispersar <strong>la</strong>s célu<strong>la</strong>s pipeteando varias veces con una pipeta Pasteur o pipeta<strong>de</strong> 1 mL.5. Si se usa más <strong>de</strong> un frasco, hacer un “pool” <strong>de</strong> célu<strong>la</strong>s.6. Contar <strong>la</strong>s célu<strong>la</strong>s: Usar 1 volumen <strong>de</strong> <strong>la</strong> suspensión <strong>de</strong> célu<strong>la</strong>s y añadir 1volumen igual <strong>de</strong> tripan azul al 0.4 % en solución salina. (Esta dilución <strong>de</strong> 1:2<strong>de</strong>be ser tomado en cuenta en <strong>el</strong> conteo).
227. Calcu<strong>la</strong>r <strong>el</strong> volumen total <strong>de</strong> célu<strong>la</strong>s necesarias <strong>de</strong> acuerdo a <strong>la</strong> cantidad <strong>de</strong>frascos a sembrar (pre<strong>para</strong>r 10 ml extra)8. Para obtener <strong>la</strong> monocapa en tres días, sembrar los pases bajos a 5x10 5célu<strong>la</strong>s /mL y los pases altos a 4x10 5 célu<strong>la</strong>s/mL.9. En <strong>la</strong> práctica se toma 0,1 mL <strong>de</strong> <strong>la</strong> suspensión c<strong>el</strong>u<strong>la</strong>r y se aña<strong>de</strong> a un frasco<strong>de</strong> 25cm 2 conteniendo 4,9 ml <strong>de</strong> medio <strong>de</strong> crecimiento. Incubar a 28 o C. Lamonocapa <strong>de</strong>be completarse en una semana.10. Aunque <strong>el</strong> split <strong>de</strong> <strong>la</strong> línea es 1:10 semanal, se <strong>de</strong>be comenzar <strong>de</strong>s<strong>de</strong> 1:3(<strong>de</strong>spués <strong>de</strong> <strong>la</strong> <strong>de</strong>scong<strong>el</strong>ación) hasta que <strong>la</strong> misma esté completamenteadaptada a <strong>la</strong>s condiciones <strong>de</strong>l <strong><strong>la</strong>boratorio</strong>.Pre<strong>para</strong>ción <strong>de</strong> célu<strong>la</strong>s <strong>para</strong> inocu<strong>la</strong>r1. De un frasco <strong>de</strong> 25 cm 2 realizar <strong>el</strong> <strong>de</strong>sprendimiento c<strong>el</strong>u<strong>la</strong>r como se <strong>de</strong>scribióanteriormente, utilizando como medio <strong>de</strong> crecimiento L-15 + 10% TPB (CaldoTriptosa Fosfato en solución al 2,9%) + 10% SFB. El medio <strong>de</strong> mantenimientoposterior a <strong>la</strong> inocu<strong>la</strong>ción es igual pero con SFB al 2%.2. Tomar 0,3 mL <strong>de</strong> <strong>la</strong> suspensión c<strong>el</strong>u<strong>la</strong>r y añadirlo a un frasco plástico <strong>de</strong>25cm 2 que contenga 4,7 mL <strong>de</strong> medio <strong>de</strong> crecimiento <strong>para</strong> <strong>la</strong> inocu<strong>la</strong>ción. Laconcentración c<strong>el</strong>u<strong>la</strong>r aproximada es <strong>de</strong> 4x10 5 <strong>para</strong> que <strong>la</strong> monocapa seasemiconfluente en 3 días que es <strong>el</strong> momento idóneo <strong>para</strong> <strong>la</strong> inocu<strong>la</strong>ción.3. Incubar a 28 o C.Al aumentar <strong>la</strong> concentración <strong>de</strong> célu<strong>la</strong>s se pue<strong>de</strong> producir una monocapa c<strong>el</strong>u<strong>la</strong>rcompleta en tres días, lista <strong>para</strong> inocu<strong>la</strong>r con <strong>el</strong> virus. Con <strong>la</strong>s AP61, <strong>el</strong> efectocitopático es mejor cuando se siembran en superficies plásticas por eso seutilizan frascos plásticos <strong>de</strong> 25 cm 2 .La <strong>de</strong>nsidad <strong>de</strong> siembra <strong>de</strong>be ser <strong>de</strong> 4x10 5 célu<strong>la</strong>s/mL <strong>para</strong> inocu<strong>la</strong>r en 2-3 días y<strong>de</strong> 1-2x10 5 célu<strong>la</strong>s/mL <strong>para</strong> mantener <strong>la</strong> línea y pasar semanalmente.Cong<strong>el</strong>ación1. Eliminar <strong>el</strong> medio <strong>de</strong> un frasco Roux <strong>de</strong> 3 ó 4 días <strong>de</strong> sembrado con monocapac<strong>el</strong>u<strong>la</strong>r semiconfluente.2. Colocar 4 mL <strong>de</strong> medio MMVP12 y 1 ml <strong>de</strong> SFB en un frasco <strong>de</strong> 10 mL (rotu<strong>la</strong>rcomo # 1 y poner en baño <strong>de</strong> hi<strong>el</strong>o).3. Colocar 4 ml <strong>de</strong> medio MMVP12 y 1 ml <strong>de</strong> DMSO en otro frasco <strong>de</strong> 10 mL,rotu<strong>la</strong>rlo como # 2 y ponerlo en baño <strong>de</strong> hi<strong>el</strong>o.
234. Echar los 5 ml <strong>de</strong> frasco # 1 en <strong>el</strong> Roux y <strong>de</strong>spren<strong>de</strong>r con policía <strong>de</strong> goma <strong>la</strong>monocapa c<strong>el</strong>u<strong>la</strong>r.5. Homogenizar <strong>la</strong> suspensión con pipeta <strong>de</strong> 5 mL y pasar<strong>la</strong> al frasco # 1 en <strong>el</strong>baño <strong>de</strong> hi<strong>el</strong>o.6. Con pipeta <strong>de</strong> 5 mL añadir <strong>el</strong> medio <strong>de</strong>l frasco # 2 sobre <strong>el</strong> frasco # 1 gota agota y con agitación manual. Mantener en baño <strong>de</strong> hi<strong>el</strong>o.7. Con pipeta <strong>de</strong> 1 mL dispensar <strong>la</strong> suspensión c<strong>el</strong>u<strong>la</strong>r a 1 mL por cada ámpu<strong>la</strong>.Mantener en frío. Dejar 0,1 mL <strong>para</strong> <strong>la</strong> prueba <strong>de</strong> esterilidad.8. Guardar <strong>la</strong>s ámpu<strong>la</strong>s a -20 o C durante 1 hora.9. Guardar <strong>la</strong>s ámpu<strong>la</strong>s en cajas <strong>de</strong> poliespuma durante toda <strong>la</strong> noche a -70 o C.10. Colocar <strong>la</strong>s ámpu<strong>la</strong>s en termo <strong>de</strong> nitrógeno líquido (-196 0 C).Descong<strong>el</strong>ación1. Extraiga un ámpu<strong>la</strong> <strong>de</strong>l nitrógeno y <strong>de</strong>scongél<strong>el</strong>a completamente a 37 C enbaño <strong>de</strong> agua.2. Extraiga <strong>el</strong> contenido <strong>de</strong> <strong>la</strong> misma con una pipeta <strong>de</strong> 1 mL y pás<strong>el</strong>a a unfrasco <strong>de</strong> 25 cm 2 que contenga 4 mL<strong>de</strong> medio <strong>de</strong> crecimiento (MMVP12 + 10%<strong>de</strong> SFB).3. Incubar a 28 o C y cambiar <strong>el</strong> medio a <strong>la</strong>s 24 h.4. Pasar con split 1:2 o 1:3 cuando se complete <strong>la</strong> monocapa.Ais<strong>la</strong>miento <strong>de</strong> virus Dengue en AP611. Eliminar <strong>el</strong> medio a los frascos plásticos <strong>de</strong> 25cm 2 sembrados <strong>para</strong> inocu<strong>la</strong>r.2. Inocu<strong>la</strong>r 0,2 mL <strong>de</strong> suero. Los sueros pue<strong>de</strong>n ser tóxicos <strong>para</strong> <strong>la</strong>s célu<strong>la</strong>s porlo que en ocasiones se prefiere diluirlos 1:10 o 1:20. Los sueros hemolíticosfrescos, o <strong>la</strong> sangre cong<strong>el</strong>ada son menos tóxicos, pudiendo inocu<strong>la</strong>rse 0,2mL. Las suspensiones <strong>de</strong> macerados <strong>de</strong> <strong>la</strong>rvas o mosquitos adultos pue<strong>de</strong>ninocu<strong>la</strong>rse en volúmenes <strong>de</strong> hasta 1mL. Si en lugar <strong>de</strong> frascos <strong>de</strong> 25 cm 2 seutilizan tubos <strong>de</strong> cultivo, pue<strong>de</strong> inocu<strong>la</strong>rse 0,2 mL <strong>de</strong> <strong>la</strong> muestra diluida 1:10en medio <strong>de</strong> mantenimiento L-15.3. Incubar por 1 h a 28 o C.4. Añadir <strong>el</strong> medio <strong>de</strong> mantenimiento (L-15 + 10% TPB + SFB 2%).5. Incubar a 28 o C por 14 días. Generalmente no se necesita un cambio <strong>de</strong> medio.
246. Observar al microscopio diariamente y cambiar <strong>el</strong> medio si se observatoxicidad.Nota: La contaminación bacteriana <strong>de</strong> <strong>la</strong> muestra pue<strong>de</strong> <strong>el</strong>iminarse diluyendo <strong>la</strong>misma en 1-2 mL <strong>de</strong> medio y filtrando por membrana 0,22 um. Las membranas<strong>de</strong>ben ser pre-tratadas con PBS + 10% <strong>de</strong> SFB <strong>para</strong> prevenir <strong>la</strong> pérdida <strong>de</strong> virus.El virus Dengue induce ECP <strong>de</strong> tipo sincitial al 4to ó 5to día <strong>de</strong> <strong>la</strong> inocu<strong>la</strong>ción. Seobservan áreas a<strong>la</strong>rgadas <strong>de</strong> sincitios que en 3-5 días muestran una fusióncompleta <strong>de</strong> <strong>la</strong> monocapa c<strong>el</strong>u<strong>la</strong>r, seguido por retracción y formación <strong>de</strong> gran<strong>de</strong>smasas <strong>de</strong> célu<strong>la</strong>s. Los cultivos que no presentan efecto citopático pue<strong>de</strong>n pasarsenuevamente a los 14 días previa cong<strong>el</strong>ación y <strong>de</strong>scong<strong>el</strong>ación.Para <strong>la</strong> i<strong>de</strong>ntificación se <strong>de</strong>be guardar una alicuota <strong>de</strong>l sobrenadante a-70 0 C. Lascélu<strong>la</strong>s pue<strong>de</strong>n ser fijadas <strong>para</strong> inmunofluorescencia o pue<strong>de</strong> realizarse unaneutralización por reducción <strong>de</strong> p<strong>la</strong>cas o una fijación <strong>de</strong> complemento utilizandocomo antígeno <strong>el</strong> sobrenadante y como antisuero líquidos ascíticos hiperinmunesespecíficos <strong>de</strong> referencia.En <strong>la</strong> foto se pue<strong>de</strong> observar un sincitio característico producido por <strong>la</strong>multiplicación <strong>de</strong>l virus <strong>de</strong>ngue 2 en célu<strong>la</strong>s AP61.
25Línea C<strong>el</strong>u<strong>la</strong>r C6\36 HTLas célu<strong>la</strong>s <strong>de</strong> mosquito se cultivan tradicionalmente a 28 0 C, sin embargo Zhu ycols., <strong>de</strong>mostraron que <strong>el</strong> clono C6\36 podía adaptarse a crecer a 36 0 C pero bajoesas condiciones <strong>la</strong>s célu<strong>la</strong>s <strong>de</strong>jan <strong>de</strong> multiplicarse cuando <strong>la</strong> temperaturasobrepasa los 35 0 C. Así, Kuno y Oliver (1989) enuncian que <strong>la</strong>s líneas <strong>de</strong> célu<strong>la</strong>s<strong>de</strong> insectos, altamente sensibles y acostumbrada a crecer a 28 0 C al adaptarse atemperaturas mas <strong>el</strong>evadas mejoran su capacidad <strong>para</strong> <strong>la</strong> replicación viral(siempre que <strong>la</strong> temperatura no exceda los 35 0 C).Esta sublínea C6\36 HT está adaptada a crecer a 34 0 C por Kuno y cols. Exhiben<strong>el</strong> mismo ECP que <strong>la</strong>s C6\36 originales aunque éste se manifiesta masrápidamente y se obtienen mayores títulos virales que a 28 0 C.Materiales:‣ Medio <strong>de</strong> crecimiento: Eagle MEM + 2% aminoácidos no esenciales 100X + 2%soln. glutamina 200mM + 1% vitaminas BME + 10% suero fetal bovino (SFB)(pH 6.8).‣ Medio <strong>de</strong> inocu<strong>la</strong>ción o <strong>de</strong> mantenimiento: <strong>el</strong> mismo medio pero suplementadosólo con 2% <strong>de</strong> SFB.Propagación <strong>de</strong> <strong>la</strong>s célu<strong>la</strong>s1. Elimine <strong>el</strong> medio <strong>de</strong> crecimiento <strong>de</strong> <strong>la</strong>s célu<strong>la</strong>s <strong>de</strong>l frasco <strong>de</strong> 25cm 2 .2. Añada 1ml <strong>de</strong> medio fresco y <strong>de</strong>sprenda <strong>la</strong>s célu<strong>la</strong>s golpeando vigorosamente<strong>el</strong> frasco.3. Homogenice con pipeta Pasteur o <strong>de</strong> 1mL.4. Resuspenda en medio <strong>de</strong> crecimiento <strong>de</strong> acuerdo al fín <strong>de</strong> <strong>la</strong>s célu<strong>la</strong>s encultivo:a) Si es <strong>para</strong> <strong>el</strong> pase <strong>de</strong> <strong>la</strong> línea realizar un split <strong>de</strong> 1:8 ó ajustando <strong>la</strong>concentración a 1x10 4 c<strong>el</strong>\ml.b) Si se pre<strong>para</strong> <strong>para</strong> ais<strong>la</strong>miento, aplique un split <strong>de</strong> 1:3-1:4 ó ajustando<strong>la</strong> concentración 1x10 5 c<strong>el</strong>\mL. Podrá utilizarse en 48h. Por tanto <strong>de</strong> unfrasco <strong>de</strong> 25cm 2 se pue<strong>de</strong>n pre<strong>para</strong>r 75 tubos aproximadamente.5. Incubar a 34 0 C.
26Cong<strong>el</strong>ación.Simi<strong>la</strong>r a <strong>la</strong> sublínea C6\36.Descong<strong>el</strong>ación.Simi<strong>la</strong>r a <strong>la</strong> sublínea C6\36.Inocu<strong>la</strong>ción en tubos.1. Decantar <strong>el</strong> medio <strong>de</strong> cada tubo.2. Inocu<strong>la</strong>r 100uL <strong>de</strong> una dilución 1:30 <strong>de</strong>l suero.3. Incubar por 1h a 34 0 Csi hay evi<strong>de</strong>ncias <strong>de</strong> citotoxicidad, <strong>el</strong>imine <strong>el</strong> vehículo.4. Añadir <strong>el</strong> medio (1mL) <strong>de</strong> inocu<strong>la</strong>ción o mantenimiento.5. Incubar a 34 0 C 9-10 días y observar diariamente.6. Realizar una IFI antes <strong>de</strong> dar <strong>la</strong> muestra como negativa.
27AISLAMIENTO DE VIRUS DENGUE EN CÉLULAS C6/36 HT POR EL MÉTODODE CENTRIFUGACIÓN RÁPIDA (SHELL VIAL)Muestras <strong>para</strong> <strong>el</strong> ais<strong>la</strong>miento viral: Suero o sangre <strong>de</strong> pacientes en fase aguda,fragmentos <strong>de</strong> tejidos obtenidos durante <strong>la</strong> autopsia <strong>de</strong> casos fatales (hígado,bazo, cerebro, ganglios linfáticos, pulmón, etc.) y mosquitos infectados.Sistemas <strong>de</strong> ais<strong>la</strong>miento: Cultivos C<strong>el</strong>u<strong>la</strong>res: LLC-MK 2 (riñón <strong>de</strong> mono Rhesus),Vero (riñón <strong>de</strong> mono ver<strong>de</strong>), BHK-21 (riñón <strong>de</strong> hámster recién nacido), AP-61(Ae<strong>de</strong>s pseudoscut<strong>el</strong><strong>la</strong>ris) 28 0 C, TRA-284 (Toxorrhinchitis amboinensis) 28 0 C,C6/36 Sublínea <strong>de</strong> AAL (A. albopictus) 28 0 C y C6/36HT Sublínea <strong>de</strong> C6/36 <strong>de</strong>alta temperatura 34 0 CSHELL VIAL. Consiste en <strong>la</strong> centrifugación <strong>de</strong> <strong>la</strong> muestra durante <strong>el</strong> tiempo <strong>de</strong>contacto virus-célu<strong>la</strong> sobre una superficie excavada o <strong>el</strong> fondo <strong>de</strong> un tubo en <strong>el</strong>cual se encuentren <strong>la</strong>s célu<strong>la</strong>s y se realiza a <strong>la</strong> temperatura óptima <strong>para</strong> <strong>el</strong> virus.Tiene como objetivo ffavorecer <strong>la</strong> adsorción y <strong>la</strong> penetración <strong>de</strong>l virus a <strong>la</strong>scélu<strong>la</strong>s.SHELL VIAL + C6/36HT = MAYOR EFICIENCIA DE AISLAMIENTOMétodo:Para p<strong>la</strong>cas <strong>de</strong> 24 pozos con célu<strong>la</strong>s C6/36 HT (24-48 horas <strong>de</strong> sembradas)1. Eliminar <strong>el</strong> medio <strong>de</strong> crecimiento utilizando una pipeta <strong>de</strong> 5 mL.2. Inocu<strong>la</strong>r 100 µL <strong>de</strong> una dilución <strong>de</strong> suero por triplicado.3. Centrifugar a 2000 rpm durante 30 min a 33°C.4. Eliminar <strong>el</strong> inóculo aspirando cuidadosamente.5. Añadir 1 mL <strong>de</strong> medio <strong>de</strong> mantenimiento por pozo.6. Incubar a 33°C en atmósfera <strong>de</strong> CO2.7. Observar diariamente durante 7-10 días.8. I<strong>de</strong>ntificar mediante IFI utilizando LAH o AcM.Referencias:Rodríguez-Roche R, Alvarez M, Guzmán MG, Morier L and Kouri G. Iso<strong>la</strong>tion of<strong>de</strong>ngue 2 virus in C636/HT c<strong>el</strong>ls by rapid centrifugation/sh<strong>el</strong>l vial assay.Comparison with conventional virus iso<strong>la</strong>tion method. J Clin Microbiol.2000; 38:3508-3510.
28INMUNOFLUORESCENCIALa inmunofluorescencia (IF) o Técnica <strong>de</strong> Anticuerpos Fluorescentes se basa en <strong>la</strong>unión inmunológica <strong>de</strong> un anticuerpo marcado con un fluorocromo a su antígenohomólogo.Se consi<strong>de</strong>ra un fluorocromo a una sustancia que al ser excitada por una ondaluminosa, es capaz <strong>de</strong> emitir luz <strong>de</strong> menor energía (mayor longitud <strong>de</strong> onda) qu<strong>el</strong>a <strong>de</strong> <strong>la</strong> onda que provoca <strong>la</strong> excitación. El fluorocromo <strong>de</strong> más amplia aplicaciónen esta técnica es <strong>el</strong> isotiocionato <strong>de</strong> fluoresceína.En 1941, <strong>la</strong> IF fue introducida por Coons y co<strong>la</strong>boradores, quienes emplearon <strong>el</strong>isocianato <strong>de</strong> fluoresceína <strong>para</strong> marcar tanto antígenos como anticuerpos.Posteriormente, <strong>la</strong>s técnicas <strong>de</strong> conjugación fueron modificadas por Riggs yco<strong>la</strong>boradores. Estos investigadores reemp<strong>la</strong>zaron <strong>el</strong> radical isocianato por <strong>el</strong>isotiocianato, este último más estable, más fácil <strong>de</strong> conjugar y <strong>de</strong> obtenercomercialmente.A partir <strong>de</strong> los años 50, <strong>la</strong> IF ha sido ampliamente utilizada <strong>para</strong> <strong>la</strong> i<strong>de</strong>ntificación<strong>de</strong> parásitos, bacterias y numerosos virus, así como <strong>para</strong> <strong>la</strong> <strong>de</strong>tección <strong>de</strong>anticuerpos contra estos agentes.Principio <strong>de</strong> <strong>la</strong> técnicaLas molécu<strong>la</strong>s proteicas <strong>de</strong> los anticuerpos se unen al marcador fluorescente(fluorocromo) por medio <strong>de</strong> firmes en<strong>la</strong>ces químicos. Como <strong>la</strong> actividadinmunológica <strong>de</strong> estos anticuerpos no se altera, <strong>la</strong> capacidad <strong>de</strong> los mismos <strong>de</strong>unirse a los antígenos homólogos permanece íntegra.Debido a <strong>la</strong> alta especificidad <strong>de</strong> <strong>la</strong> reacción Ag-Ac, <strong>la</strong> IF se ha convertido en unmétodo muy útil <strong>para</strong> <strong>el</strong> diagnóstico. Otra <strong>de</strong> sus ventajas, es <strong>el</strong> tiempor<strong>el</strong>ativamente corto que se requiere <strong>para</strong> <strong>el</strong> procesamiento <strong>de</strong> <strong>la</strong> muestra hastallegar al resultado final.La IF es aplicable a cualquier sustancia antigénica que se localice <strong>de</strong>ntro o fuera<strong>de</strong> <strong>la</strong>s célu<strong>la</strong>s, sean antígenos protozoarios, bacterias, ricketsias, virus,hormonas, enzimas, antígenos tisu<strong>la</strong>res y otros.
29La extensa variedad <strong>de</strong> estructuras y propieda<strong>de</strong>s físico-químicas <strong>de</strong> los antígenosimplica que sus requerimientos <strong>para</strong> ser marcados con <strong>el</strong> fluorocromo variarán<strong>para</strong> cada caso en específico, <strong>de</strong> ahí que se haya generalizado <strong>el</strong> procedimiento <strong>de</strong>marcar los anticuerpos (todos los anticuerpos son proteínas). Por <strong>el</strong>lo, <strong>la</strong> IF seconoce también con <strong>el</strong> nombre <strong>de</strong> Técnica <strong>de</strong> Anticuerpos Fluorescentes.Microscopio <strong>para</strong> fluorescenciaEl principio <strong>de</strong> funcionamiento <strong>de</strong>l microscopio <strong>para</strong> <strong>la</strong> fluorescencia es simi<strong>la</strong>r al<strong>de</strong> un microscopio óptico convencional, pero en <strong>el</strong> caso <strong>de</strong>l primero ha <strong>de</strong>utilizarse un sistema <strong>de</strong> excitación que proporcione una energía tal que sea capaz<strong>de</strong> excitar a los fluorocromos empleados <strong>para</strong> marcar los anticuerpos.Se ha comprobado en <strong>la</strong> práctica que <strong>el</strong> sistema <strong>de</strong> excitación ultravioleta es <strong>el</strong>más conveniente, <strong>de</strong>bido a que en gran medida su empleo <strong>el</strong>imina <strong>la</strong> posibilidad<strong>de</strong> confundir <strong>la</strong> fluorescencia específica con <strong>la</strong> autofluorescencia propia <strong>de</strong> <strong>la</strong>scélu<strong>la</strong>s y tejidos. Por <strong>el</strong>lo, en general se emplea como fuente <strong>de</strong> luz una lám<strong>para</strong><strong>de</strong> mercurio acompañada <strong>de</strong> un sistema <strong>de</strong> filtros <strong>de</strong> absorción <strong>de</strong> calor, <strong>de</strong>excitación, <strong>de</strong> "barrera" y otros. Estos filtros aseguran una mayor niti<strong>de</strong>z en <strong>la</strong>observación <strong>de</strong> <strong>la</strong>s muestras ya que s<strong>el</strong>eccionan <strong>la</strong>s longitu<strong>de</strong>s <strong>de</strong> onda masapropiadas <strong>para</strong> <strong>la</strong> excitación, <strong>el</strong>iminando aqu<strong>el</strong><strong>la</strong>s que resulten perjudiciales<strong>para</strong> <strong>el</strong> observador.Existen dos métodos básicos <strong>de</strong> iluminación en <strong>el</strong> microscopio <strong>para</strong> fluorescencia:<strong>la</strong> luz transmitida y <strong>la</strong> luz inci<strong>de</strong>nte, este último método presenta diversasventajas ya que al no requerirse un con<strong>de</strong>nsador campo-oscuro pue<strong>de</strong>n utilizarseobjetivos <strong>de</strong> mayor aumento lo que permite una observación <strong>de</strong> mayor bril<strong>la</strong>ntez eintensidad. Por otra parte, su uso resulta más seguro <strong>para</strong> <strong>la</strong> vista <strong>de</strong>lobservador.En <strong>de</strong>pen<strong>de</strong>ncia <strong>de</strong> los objetivos trazados, se pue<strong>de</strong>n emplear distintas variantes<strong>de</strong> tinción en <strong>la</strong> inmunofluorescencia:Método Directo: El material se tiñe directamente con <strong>el</strong> correspondienteanticuerpo marcado.Antígeno (Ag) + Ac fluorescente (Ac-F) Ag-Ac-F
30Este es <strong>el</strong> método más simple y específico aunque es menos sensible que <strong>el</strong>indirecto. Tiene <strong>la</strong> <strong>de</strong>sventaja <strong>de</strong> que <strong>para</strong> cada antígeno específico se requiere <strong>de</strong>un anticuerpo homólogo marcado con <strong>el</strong> fluorocromo, lo cual no resultaeconómico ni práctico.Método Indirecto: El anticuerpo primario (no marcado) se aña<strong>de</strong> sobre <strong>la</strong>muestra y <strong>el</strong> anticuerpo secundario (marcado) se combina con <strong>el</strong> complejo Ag-Acprimario. Si <strong>la</strong> fluorescencia es específica, se pue<strong>de</strong> i<strong>de</strong>ntificar <strong>el</strong> antígeno cuandose conoce <strong>el</strong> anticuerpo primario o viceversa.Ag + Ac primario Ag-Ac primarioAg-Ac primario + Ac secundario (Ac-F) Ag-Ac primario-(Ac-F)Este método, en com<strong>para</strong>ción con <strong>el</strong> directo, presenta 3 ventajas fundamentales:es más sensible, sirve <strong>para</strong> <strong>de</strong>tectar tanto Ag como Ac y se pue<strong>de</strong> trabajar unaamplia variedad <strong>de</strong> Ag-Ac siempre que se utilicen sueros <strong>de</strong> <strong>la</strong> misma especie.Pre<strong>para</strong>ción <strong>de</strong>l sustrato antigénico <strong>para</strong> <strong>la</strong> inmunofluorescenciaRatón:1. Si se parte <strong>de</strong> un ratón agonizante, hay que extraerle <strong>el</strong> cerebro y colocarlosobre un pap<strong>el</strong> <strong>de</strong> filtro.2. Con <strong>la</strong> punta <strong>de</strong> un bisturí se tomarán pequeñas porciones <strong>de</strong> cerebro, con <strong>la</strong>scuales se practicará frotis sobre los portaobjetos cuidando que que<strong>de</strong>n bienextendidos <strong>para</strong> po<strong>de</strong>r lograr una capa <strong>de</strong> célu<strong>la</strong> lo más fina posibles.3. Esperar que los frotis sequen completamente a temperatura ambiente.4. Después <strong>de</strong> secos se colocarán <strong>la</strong>s láminas en un vaso koplin y se aña<strong>de</strong>acetona a 4 o C hasta cubrir los frotis. Se mantendrán en acetona durante 10minutos.5. Se <strong>el</strong>imina <strong>la</strong> acetona y en los mismos vasos se conservan <strong>la</strong>s láminas encong<strong>el</strong>ación (20 ó -70 o C). Mientras menor sea <strong>la</strong> temperatura, por más tiempose conservarán <strong>la</strong>s muestras. Si están mantenidas a -20 o C, no <strong>de</strong>benalmacenarse por más <strong>de</strong> 1,5 meses.
31Célu<strong>la</strong>s:1. Para utilizar <strong>la</strong>s célu<strong>la</strong>s como sustrato antigénico <strong>para</strong> <strong>la</strong> IFA, estas <strong>de</strong>ben serinocu<strong>la</strong>das como está establecido <strong>para</strong> cada línea c<strong>el</strong>u<strong>la</strong>r en específico, es<strong>de</strong>cir, teniendo en cuenta los requerimientos individuales <strong>de</strong> cada una <strong>de</strong><strong>el</strong><strong>la</strong>s.2. En <strong>el</strong> caso <strong>de</strong>l virus Dengue <strong>la</strong>s célu<strong>la</strong>s <strong>de</strong>ben ser fijadas a partir <strong>de</strong>l tercer díay no antes.3. Para <strong>la</strong> fijación, se <strong>el</strong>iminará <strong>el</strong> sobrenadante <strong>de</strong>l cultivo y <strong>la</strong> monocapa c<strong>el</strong>u<strong>la</strong>rse <strong>la</strong>vará con 2-3 ml <strong>de</strong> PBS, evitando <strong>de</strong>spren<strong>de</strong>r <strong>la</strong>s célu<strong>la</strong>s.4. Posteriormente, a <strong>la</strong> monocapa se aña<strong>de</strong>n 3 ml <strong>de</strong> PBS y se <strong>de</strong>spren<strong>de</strong>n <strong>la</strong>scélu<strong>la</strong>s con un policía <strong>de</strong> goma o golpeando <strong>el</strong> frasco que <strong>la</strong>s contienevigorosamente.5. La suspensión c<strong>el</strong>u<strong>la</strong>r obtenida se gotea sobre láminas porta objeto y seobserva al microscopio óptico <strong>la</strong> concentración c<strong>el</strong>u<strong>la</strong>r, que no <strong>de</strong>be ser nimuy baja (pocas célu<strong>la</strong>s), ni muy alta (muchas célu<strong>la</strong>s que se superponen ydificultan <strong>la</strong> observación).6. Después <strong>de</strong> ajustada <strong>la</strong> concentración a<strong>de</strong>cuada <strong>de</strong> célu<strong>la</strong>s por adición <strong>de</strong>PBS, <strong>el</strong> sustrato antigénico se distribuye sobre <strong>la</strong>s láminas y estas se <strong>de</strong>jansecar a temperatura ambiente. No <strong>de</strong>ben utilizarse secadores <strong>el</strong>éctricos porqueprovocan aerosoles <strong>de</strong> <strong>la</strong>s célu<strong>la</strong>s infectadas.7. Ya secas <strong>la</strong>s muestras, los portaobjetos se colocan en un vaso koplin y seaña<strong>de</strong> acetona a 4 o C durante 10 minutos.8. Se <strong>el</strong>imina <strong>la</strong> acetona y en los mismos vasos koplin se guardan <strong>la</strong>s láminas encong<strong>el</strong>ación hasta su uso. Mientras menor sea <strong>la</strong> temperatura, por mástiempo se conservarán <strong>la</strong>s láminas.Procedimiento <strong>para</strong> <strong>la</strong> IF Indirecta1. Sobre <strong>la</strong> muestra se aña<strong>de</strong> <strong>el</strong> antisuero específico en <strong>la</strong> dilución apropiada yen cantidad suficiente <strong>para</strong> cubrir<strong>la</strong> por completo (aproximadamente 10 ml <strong>de</strong>esta solución). El antisuero específico pue<strong>de</strong> ser líquido ascítico hiperinmune<strong>de</strong> referencia, sueros hiperinmunes, sueros <strong>de</strong> pacientes en faseconvalesciente, anticuerpos monoclonales y otros en <strong>de</strong>pen<strong>de</strong>ncia <strong>de</strong>l objetivo
32<strong>de</strong> <strong>la</strong> experiencia. Las láminas se mantienen a 37 o C durante una hora encámara húmeda.2. Posteriormente se colocan<strong>la</strong>s láminas en los vasos koplin. Se aña<strong>de</strong> PBS quese <strong>el</strong>imina al instante. Se agrega nuevamente PBS y se realiza un <strong>la</strong>vado <strong>de</strong> 5minutos, se <strong>el</strong>imina <strong>el</strong> PBS y <strong>de</strong> esta misma forma se realizan otros <strong>la</strong>vadosdos <strong>la</strong>vados.3. Se extraen <strong>la</strong>s láminas <strong>de</strong> los vasos koplin, se <strong>de</strong>jan secar a temperaturaambiente y entonces, se aña<strong>de</strong> <strong>el</strong> conjugado comercial que ha sidopreviamente titu<strong>la</strong>do <strong>para</strong> <strong>de</strong>terminar <strong>la</strong> dilución <strong>de</strong> trabajo. Esta dilución sepre<strong>para</strong> utilizando PBS + Azul <strong>de</strong> Evans, que servirá <strong>de</strong> contraste.4. Las muestras se mantienen en contacto con <strong>el</strong> conjugado durante 30 min a37 o C en cámara húmeda.5. Después <strong>de</strong> <strong>la</strong>vadas, <strong>la</strong>s láminas se secan a temperatura ambiente y seaña<strong>de</strong>n 2 gotas por lámina <strong>de</strong> glicerina buferada (9 volúmenes <strong>de</strong> glicerina + 1volumen <strong>de</strong> Tris 100 mM). Sobre <strong>la</strong> glicerina se coloca cuidadosamente <strong>el</strong>cubreobjeto con un ángulo <strong>de</strong> 45 grados con respecto a <strong>la</strong> superficie <strong>de</strong> <strong>la</strong>sláminas <strong>de</strong> forma tal que no se forme burbujas que dificultenconsi<strong>de</strong>rablemente <strong>la</strong> observación al microscopio.6. Se observan <strong>la</strong>s láminas al microscopio <strong>para</strong> fluorescencia y se <strong>de</strong>termina si<strong>la</strong>s muestras son positivas o negativas teniendo en cuenta lo observado en loscontroles que <strong>de</strong>ben incluirse en cada experiencia. La IF específica, en <strong>el</strong> caso<strong>de</strong>l virus <strong>de</strong>ngue, se <strong>de</strong>scribe como citop<strong>la</strong>smática perinuclear.Referencias:1. Henchal EA, McCown JM, Seguin MC, Gentry MK, Brandt WE. Rapidi<strong>de</strong>ntification of <strong>de</strong>ngue virus iso<strong>la</strong>tes by using monoclonal antibodies in anindirect immunofluorescence assay. Am J Trop Med Hyg 1983;32(1):164-9.
33TITULACIÓN DEL VIRUS DEL DENGUE Y NEUTRALIZACIÓN PORREDUCCIÓN DEL NÚMERO DE PLACASEntre los métodos <strong>de</strong> i<strong>de</strong>ntificación <strong>de</strong>l <strong>de</strong>ngue, <strong>la</strong> técnica <strong>de</strong> neutralización porreducción <strong>de</strong>l número <strong>de</strong> p<strong>la</strong>cas ha sido ampliamente utilizada por su <strong>el</strong>evadaespecificidad. Para esta prueba los virus pue<strong>de</strong>n ser ais<strong>la</strong>dos en cualquiersistema aunque en ocasiones es necesario realizar un pase por una línea <strong>de</strong>célu<strong>la</strong>s <strong>de</strong> mamífero permisiva como son <strong>la</strong>s célu<strong>la</strong>s LLCMK2, Vero y <strong>la</strong>s <strong>de</strong>mosquito.La utilización <strong>de</strong> <strong>la</strong>s célu<strong>la</strong>s BHK21 en <strong>la</strong> técnica <strong>de</strong> p<strong>la</strong>cas (por micrométodo) habrindado resultados satisfactorios y rápidos. La misma es útil, no sólo <strong>para</strong> <strong>la</strong>i<strong>de</strong>ntificación, sino también <strong>para</strong> <strong>la</strong> <strong>de</strong>tección <strong>de</strong> anticuerpos contra virus<strong>de</strong>ngue. Esta línea c<strong>el</strong>u<strong>la</strong>r, fue obtenida en 1963 a partir <strong>de</strong> una mezc<strong>la</strong> <strong>de</strong>riñones <strong>de</strong> hamsters sirios recién nacidos. La misma ha mostrado ser útil <strong>para</strong> <strong>la</strong>multiplicación <strong>de</strong>l virus <strong>de</strong> <strong>la</strong> rabia, los a<strong>de</strong>novirus y numerosos arbovirus, entreotros.Título <strong>de</strong> Dengue por micrométodoMedios y soluciones:‣ Medio Hanks + 0.5 % STF + Antibióticos‣ Solución salina tamponada con fosfato (PBS)(pH 7.95)‣ Solución <strong>de</strong> tripsina al 0.25%, pH 7.4-7.6‣ Solución <strong>de</strong> versene al 0.02%, pH 7.4-7.6‣ Medio <strong>de</strong> crecimiento <strong>de</strong> <strong>la</strong>s célu<strong>la</strong>s BHK21(clono 15):MEM con glutamina 2mM y aminoácidos no90 mlesenciales 1%Suero fetal bovinoAntibióticos10 ml0.1 mLAjustar a pH 8 con solución <strong>de</strong> bicarbonato <strong>de</strong> sodio al 7.5%
34‣ Medio Over<strong>la</strong>y:STF10 mlL-Glutamina1 ml2x MEM (MBA) sin R.Fenol 100 mlCMC 3% estéril50 mlAntibióticos0.2mlAjustar a pH 8 con solución <strong>de</strong> bicarbonato <strong>de</strong> sodio al 7.5%.La carboximetilc<strong>el</strong>ulosa (CMC) SIGMA # C-4888, viscosidad media se pre<strong>para</strong> al3%: A 50 ml <strong>de</strong> agua bi<strong>de</strong>sti<strong>la</strong>da, se aña<strong>de</strong>n 1.5 g <strong>de</strong> CMC <strong>de</strong>jando que se <strong>de</strong>jadisolver a 4 o C durante uno o dos días.‣ Colorante: Naphthol Blue B<strong>la</strong>ck (NBB)Nafthol Blue B<strong>la</strong>ck 1 gAcetato <strong>de</strong> sodio13.6 gÁcido acético g<strong>la</strong>cial 60 mlH 2 O a completar1000 mlNota: El NBB pue<strong>de</strong> obtenerse <strong>de</strong> Matheson Coleman y B<strong>el</strong>l. El mismo pue<strong>de</strong> noestar estéril y almacenarse por <strong>la</strong>rgos períodos.Materiales y Equipos:‣ Tubos <strong>de</strong> dilución (100 x 13) o p<strong>la</strong>cas <strong>de</strong> 96 pocillos‣ Pipetas <strong>de</strong> cristal‣ P<strong>la</strong>cas <strong>de</strong> 24 pozu<strong>el</strong>os‣ Puntas amaril<strong>la</strong>s estériles‣ Pipetas "Eppendorf" <strong>de</strong> 1000, 200, 100, 50 y 20 µl‣ Incubadora <strong>de</strong> CO 2Siembra <strong>de</strong> célu<strong>la</strong>s BHK21 Clono 151. Frasco Roux <strong>de</strong> monocapa completa (5 ó 7 días).2. Decantar <strong>el</strong> medio.3. Lavar <strong>la</strong>s célu<strong>la</strong>s con PBS (10 ml).
354. Añadir 10 ml <strong>de</strong> tripsina - versene (1:1). Dejar a temperatura ambiente por 3minutos. Eliminar <strong>el</strong> medio e incubar durante 5-10 minutos a 37 o C (<strong>el</strong><strong>de</strong>sprendimiento se hará evi<strong>de</strong>nte).5. Añadir 9 ml <strong>de</strong> medio <strong>de</strong> crecimiento. Resuspen<strong>de</strong>r <strong>la</strong>s célu<strong>la</strong>s pipeteandovigorosamente (10-15 veces).6. Comprobar que <strong>la</strong> monocapa se ha <strong>de</strong>sprendido completamente.7. Distribuir 3 ml <strong>de</strong> célu<strong>la</strong>s por cada frasco Roux (<strong>de</strong> cada Roux se obtienen 3simi<strong>la</strong>res: split 1:3 semanal).8. Completar <strong>el</strong> volumen <strong>de</strong> cada frasco a 100-120 ml <strong>de</strong> medio <strong>de</strong> crecimiento.9. Incubar a 37 o C por 5-7 días. Aproximadamente a los 4-5 días <strong>la</strong> monocapaserá confluente y <strong>la</strong>s célu<strong>la</strong>s crecerán <strong>de</strong> forma organizada en remolinos.Pre<strong>para</strong>ción <strong>de</strong> <strong>la</strong>s célu<strong>la</strong>s <strong>para</strong> <strong>la</strong> titu<strong>la</strong>ción <strong>de</strong>l virus1. Calcu<strong>la</strong>r <strong>el</strong> número <strong>de</strong> célu<strong>la</strong>s necesarias <strong>para</strong> <strong>la</strong> prueba (2.5 x 10 5 célu<strong>la</strong>s /ml x 0.5 ml / pozu<strong>el</strong>o x 24 pozu<strong>el</strong>os x p<strong>la</strong>ca). Hacer una cantidad extra(aproximadamente <strong>de</strong> un frasco <strong>de</strong> 75 cm 2 , se obtienen 3-6 x 10 célu<strong>la</strong>s). Unfrasco <strong>de</strong> 75 cm 2 <strong>de</strong> monocapa confluente (4-5 días) da <strong>para</strong> 10 p<strong>la</strong>cas.2. Decantar <strong>el</strong> medio y <strong>la</strong>var con PBS.3. Añadir 4 ml <strong>de</strong> tripsina-versene y realizar <strong>el</strong> <strong>de</strong>sprendimiento como se<strong>de</strong>scribió anteriormente.4. Despren<strong>de</strong>r <strong>la</strong>s célu<strong>la</strong>s en 5 ml <strong>de</strong> medio <strong>de</strong> crecimiento.5. Añadir toda <strong>la</strong> suspensión c<strong>el</strong>u<strong>la</strong>r a un frasco <strong>de</strong> 200 ml <strong>de</strong> boca ancha quecontenga 120 ml <strong>de</strong> medio <strong>de</strong> crecimiento. Este volumen es suficiente <strong>para</strong> 10p<strong>la</strong>cas a razón <strong>de</strong> 0,5 ml/pozu<strong>el</strong>o.Cong<strong>el</strong>ación <strong>de</strong> <strong>la</strong>s célu<strong>la</strong>s BHK-211. De un frasco Roux con monocapa casi confluente (3-4 días) <strong>de</strong>spren<strong>de</strong>r <strong>la</strong>scélu<strong>la</strong>s como se <strong>de</strong>scribió anteriormente.2. Colocar <strong>la</strong> suspensión c<strong>el</strong>u<strong>la</strong>r en tubos <strong>de</strong> centrífuga y centrifugar 3-5minutos a temperatura ambiente a 1000 r.p.m.3. Decantar <strong>el</strong> sobrenadante y resuspen<strong>de</strong>r <strong>la</strong>s célu<strong>la</strong>s en 5 mL <strong>de</strong> medio MEM +glutamina + aminoácidos no esenciales + 1 mL <strong>de</strong> STF. Colocar en un frascorotu<strong>la</strong>do con <strong>el</strong> # 1 que previamente <strong>de</strong>bió estar en baño <strong>de</strong> hi<strong>el</strong>o.
364. Pre<strong>para</strong>r otro frasco que contenga 4 mL <strong>de</strong>l mismo medio (sin STF) peroañadiendo 1 ml <strong>de</strong> dimetilsulfóxido. Colocarlo sobre <strong>el</strong> baño <strong>de</strong> hi<strong>el</strong>o. Rotu<strong>la</strong>rcon <strong>el</strong> # 2. Comprobar que ambos frascos tienen bien mezc<strong>la</strong>das sussoluciones.5. Con una pipeta <strong>de</strong> 5 mL tomar <strong>el</strong> medio <strong>de</strong>l frasco # 2 y añadir lentamente,gota a gota y agitando, <strong>el</strong> contenido <strong>de</strong>l frasco # 2 en <strong>el</strong> # 1. Siempre en baño<strong>de</strong> hi<strong>el</strong>o.6. Distribuir 1 mL <strong>de</strong> <strong>la</strong> suspensión (aprox. 1 x 10 célu<strong>la</strong>s / mL) por ámpu<strong>la</strong>(siempre en frío). Dejar 0,1 mL <strong>para</strong> <strong>la</strong> prueba <strong>de</strong> esterilidad.7. Guardar durante 1 hora a -20 o C.8. Colocar <strong>la</strong>s ámpu<strong>la</strong>s en una caja <strong>de</strong> poliespuma y guardar a -70 o C por 24horas. Pasar<strong>la</strong>s <strong>de</strong>spués a nitrógeno líquido.Descong<strong>el</strong>ación <strong>de</strong> célu<strong>la</strong>s BHK-211. Extraer <strong>el</strong> ámpu<strong>la</strong> directamente <strong>de</strong>l nitrógeno líquido y colocar<strong>la</strong> a 37 C o enbaño <strong>de</strong> agua hasta que se <strong>de</strong>scong<strong>el</strong>e.2. Extraer su contenido con pipeta <strong>de</strong> 1 mL y verterlo en un frasco plástico <strong>de</strong> 25cm 2 que contenga 4 mL <strong>de</strong> medio <strong>de</strong> crecimiento. Incubar a 37 o C.3. Cambiar <strong>el</strong> medio a <strong>la</strong>s 24 horas.4. Cuando <strong>la</strong> monocapa c<strong>el</strong>u<strong>la</strong>r se complete, pasar <strong>la</strong> línea en split 1:2.Título <strong>de</strong> Dengue en célu<strong>la</strong>s BHK211. Pre<strong>para</strong>r un grupo <strong>de</strong> tubos marcados <strong>de</strong>s<strong>de</strong> 10 -1 y hasta 10 -7 , <strong>de</strong>pendiendo<strong>de</strong>l título viral sospechado.2. Pipetear asépticamente 0.9 ml <strong>de</strong>l diluente (medio Hanks + 0.5% STF) en cadauno <strong>de</strong> los tubos. Mantener en hi<strong>el</strong>o.3. Descong<strong>el</strong>ar rápidamente un vial <strong>de</strong>l virus (preferiblemente a 37 o C). Transferir0.1 mL <strong>de</strong>l virus al primer tubo con diluente, <strong>el</strong>iminar <strong>la</strong> pipeta4. Mezc<strong>la</strong>r vigorosamente en <strong>el</strong> agitador.5. Transferir con una pipeta nueva 0.1 mL <strong>de</strong> <strong>la</strong> dilución <strong>de</strong> virus 10 -1 alsiguiente tubo y así sucesivamente.6. Añadir 0.5 mL <strong>de</strong> <strong>la</strong> suspensión c<strong>el</strong>u<strong>la</strong>r en cada pozu<strong>el</strong>o <strong>de</strong> <strong>la</strong> p<strong>la</strong>ca <strong>de</strong> 24 y<strong>de</strong>jar<strong>la</strong>s en reposo 1 hora a temperatura ambiente.
377. Marcar <strong>la</strong>s p<strong>la</strong>cas, se toman 3 pozu<strong>el</strong>os por cada dilución <strong>de</strong> virus comomínimo.8. Dejar <strong>la</strong>s diluciones virales por 1 hora a 37 o C.9. Inocu<strong>la</strong>r 50 uL <strong>de</strong> cada dilución viral a <strong>la</strong>s célu<strong>la</strong>s.10. Incubar por 4 horas a 37 o C en incubadora <strong>de</strong> CO 2, al 5 %.11. Añadir 0.5 mL <strong>de</strong> medio con CMC.El medio <strong>de</strong>be tener un pH <strong>de</strong> 8-8,5 <strong>para</strong><strong>de</strong>ngue 1, 3 y 4. Para <strong>de</strong>ngue 2 pue<strong>de</strong> encontrarse entre 7- 8,512. Incubar a 37 o C por 8 días <strong>para</strong> <strong>el</strong> <strong>de</strong>ngue 4, 5 días <strong>para</strong> <strong>el</strong> <strong>de</strong>ngue 2 y 9 días<strong>para</strong> <strong>el</strong> <strong>de</strong>ngue 1 y 3, en incubadora <strong>de</strong> CO 2 5%.13. Descartar <strong>el</strong> medio. Lavar suavemente con agua corriente. Teñir <strong>la</strong>s célu<strong>la</strong>scon NBB (0.5 mL por pozu<strong>el</strong>o). Después <strong>de</strong> 30 minutos <strong>la</strong>var con agua <strong>de</strong>nuevo. Las p<strong>la</strong>cas pue<strong>de</strong>n ser contadas inmediatamente o cuando se sequen.Neutralización por reducción <strong>de</strong>l número p<strong>la</strong>cas1. Pre<strong>para</strong>r <strong>la</strong>s diluciones <strong>de</strong> los sueros en estudio, usando como diluenteHanks + 2% <strong>de</strong> SFB .Estas diluciones puedne ser pre<strong>para</strong>das previamente ymantenidas a 4 o C no más <strong>de</strong> una semana).2. Pre<strong>para</strong>r una dilución <strong>de</strong> trabajo <strong>de</strong>l virus que contengan aproximadamente<strong>de</strong> 15 a 20 ufp / 50µL. Se pre<strong>para</strong> una dilución <strong>de</strong> trabajo <strong>de</strong> 40 ufp /50uL,que al ser mezc<strong>la</strong>das con igual volumen, dichas diluciones <strong>de</strong> viruscontengan <strong>la</strong>s 20 ufp/50µL3. Calcu<strong>la</strong>r <strong>el</strong> volumen <strong>de</strong> virus necesario <strong>de</strong> <strong>la</strong> dilución <strong>de</strong> trabajomultiplicando por 100µL, <strong>el</strong> número <strong>de</strong> sueros en estudio más <strong>el</strong> número <strong>de</strong>controles.4. Realizar <strong>la</strong>s mezc<strong>la</strong>s <strong>de</strong> virus-suero en p<strong>la</strong>cas <strong>de</strong> 96 pozu<strong>el</strong>os. Cada pozu<strong>el</strong>o<strong>de</strong> esta p<strong>la</strong>ca, contendrá una mezc<strong>la</strong> <strong>de</strong> virus-suero en cantidad suficiente<strong>para</strong> inocu<strong>la</strong>r 3 pozu<strong>el</strong>os <strong>de</strong> <strong>la</strong> p<strong>la</strong>ca <strong>de</strong> 24 pozos. Incluir en esta últimap<strong>la</strong>ca 2 pozu<strong>el</strong>os como mínimo <strong>para</strong> <strong>el</strong> virus control, y 2 pozu<strong>el</strong>os con unadilución <strong>de</strong>l control <strong>de</strong> virus 1:10 y 2 pozu<strong>el</strong>os dilución <strong>de</strong>l control <strong>de</strong> virus<strong>de</strong> 1:100. Colocar <strong>la</strong> p<strong>la</strong>ca sobre hi<strong>el</strong>o.5. Añadir 100 µL <strong>de</strong> <strong>la</strong> dilución <strong>de</strong> trabajo <strong>de</strong>l virus y a los pozos controles <strong>de</strong> <strong>la</strong>forma siguiente:
38Control <strong>de</strong> virus 100 µL <strong>de</strong> <strong>la</strong> dilución <strong>de</strong> virusA <strong>la</strong> 1:10 100uL <strong>de</strong> <strong>la</strong> dilución <strong>de</strong> 1:10A <strong>la</strong> 1:100 100uL <strong>de</strong> <strong>la</strong> dilución <strong>de</strong> 1:100Al control <strong>de</strong> célu<strong>la</strong>s 100uL <strong>de</strong> Hanks6. Utilizar una pipeta "Eppendorf" <strong>de</strong> 100 µL, añadir 100 µL <strong>de</strong> cada suero o<strong>de</strong> <strong>la</strong>s diluciones <strong>de</strong> sueros en estudio. Mezc<strong>la</strong>r 5 veces.7. Cubrir <strong>la</strong> p<strong>la</strong>ca y mantener a 37 o C por 1 hora.8. Marcar <strong>la</strong>s p<strong>la</strong>cas <strong>de</strong> 24 pozu<strong>el</strong>os y añadir 0.5 mL <strong>de</strong> <strong>la</strong> suspensión <strong>de</strong>célu<strong>la</strong>s BHK2.9. Dejar <strong>la</strong>s célu<strong>la</strong>s en reposo durante 1 hora a temperatura ambiente.10. Inocu<strong>la</strong>r 50 uL <strong>de</strong> <strong>la</strong> mezc<strong>la</strong> virus-suero a cada pozu<strong>el</strong>o (por triplicado).11. Incubar por 4 horas a 37 o C en atmósfera <strong>de</strong> 5% <strong>de</strong> CO 2.12. Añadir a cada pozu<strong>el</strong>o 0.5 mL <strong>de</strong>l medio over<strong>la</strong>y.13. Incubar a 37 o C en CO 2 por 8 días <strong>para</strong> <strong>de</strong>ngue 4, 5 días <strong>para</strong> <strong>de</strong>ngue 2 y 9días <strong>para</strong> <strong>de</strong>ngue 1 y 3.14. Teñir <strong>la</strong>s p<strong>la</strong>cas <strong>de</strong> <strong>la</strong> misma forma que se <strong>de</strong>scribió en <strong>el</strong> tópico <strong>de</strong>titu<strong>la</strong>ción viral.Lectura <strong>de</strong> <strong>la</strong>s p<strong>la</strong>casTítulo viral: Para conocer <strong>el</strong> título <strong>de</strong> un virus se aplica <strong>la</strong> siguiente fórmu<strong>la</strong>:Título UFP/mL = P x 10 XVDón<strong>de</strong>:P: Promedio <strong>de</strong>l número <strong>de</strong> p<strong>la</strong>cas obtenido en <strong>la</strong> dilución en que se contaron<strong>la</strong>s p<strong>la</strong>cas.10 x : Dilución en que se contaron <strong>la</strong>s p<strong>la</strong>cas (Factor <strong>de</strong> dilución).V: Volumen <strong>de</strong>l inóculo expresado en mLNota: Siempre que se utilice un volumen <strong>de</strong> inóculo <strong>de</strong> 50 µL <strong>la</strong> fórmu<strong>la</strong> queda <strong>de</strong>al siguiente forma: Título UFP/mL = P x 10 x x 20
39Ejemplo:Dilución # <strong>de</strong> p<strong>la</strong>cas Promedio10 -1 NC NC NC NC10 -2 15 19 17 1710 -3 4 3 2 310 -4 0 0 0 0NC - No contableTítulo= 3 x 10 3 x 20 = 6.0 X 10 4 UFP/mLCálculo <strong>de</strong> <strong>la</strong> dilución <strong>de</strong> trabajo <strong>de</strong> virus a utilizar:La manera mas fácil <strong>de</strong> calcu<strong>la</strong>r <strong>la</strong> dilución <strong>de</strong> trabajo es observando <strong>el</strong> número<strong>de</strong> p<strong>la</strong>cas virales en <strong>la</strong> p<strong>la</strong>ca <strong>de</strong> titu<strong>la</strong>ción y tomando una dilución 2 veces másconcentrada <strong>de</strong> <strong>la</strong> que muestra <strong>el</strong> número i<strong>de</strong>al <strong>de</strong> p<strong>la</strong>cas. Por ejemplo: Si en <strong>la</strong>dilución 1/10000 se observa un promedio <strong>de</strong> p<strong>la</strong>cas virales entre 20 y 30(número i<strong>de</strong>al <strong>de</strong> p<strong>la</strong>cas), <strong>la</strong> dilución <strong>de</strong> trabajo a<strong>de</strong>cuada será <strong>de</strong> 1/5000Cálculo <strong>de</strong>l punto final <strong>de</strong>l 50% <strong>de</strong> reducción <strong>de</strong> p<strong>la</strong>cas:‣ Calcu<strong>la</strong>r <strong>el</strong> promedio <strong>de</strong>l número <strong>de</strong> p<strong>la</strong>cas en <strong>el</strong> control <strong>de</strong> virus o en sulugar, en <strong>el</strong> control <strong>de</strong> virus más suero negativo control.Calcu<strong>la</strong>r <strong>el</strong> % <strong>de</strong> reducción <strong>de</strong> p<strong>la</strong>cas <strong>para</strong> cada mezc<strong>la</strong> virus-suero con respectoal promedio <strong>de</strong>l virus control. Ejemplo:# <strong>de</strong> p<strong>la</strong>cas Promedio (P)Control <strong>de</strong> Virus (CV) 19 20 21 20Virus + suero (V+S) 6 4 5 5% <strong>de</strong> reducción= (1 – P (V+S)) x 100 = (1- 5/20) x 100 = 75%P (CV)
40Para conocer <strong>el</strong> título <strong>de</strong> anticuerpos <strong>de</strong> un suero pue<strong>de</strong>n utilizarse 2métodos:1. El suero se prueba a una dilución específica frente a una dilución constante<strong>de</strong> virus. En este caso se obtiene <strong>el</strong> % <strong>de</strong> reducción <strong>de</strong> p<strong>la</strong>cas <strong>para</strong> <strong>la</strong> dilución<strong>de</strong> suero utilizada, lo cual indicaría si <strong>el</strong> suero tiene o no anticuerpos (% <strong>de</strong>reducción). Cuando este % <strong>de</strong> reducción es <strong>de</strong> >=50%, se consi<strong>de</strong>ra que <strong>el</strong>suero es positivo (presencia <strong>de</strong> Acs).2. El suero se prueba en varias diluciones frente a una concentración constante<strong>de</strong> virus, esto nos permite conocer <strong>el</strong> título <strong>de</strong> anticuerpos <strong>de</strong>l suero. Paracada dilución <strong>de</strong> suero se hal<strong>la</strong> <strong>el</strong> % <strong>de</strong> reducción <strong>de</strong>l número <strong>de</strong> p<strong>la</strong>cas.Estos datos se llevan a un pap<strong>el</strong> semilogarítmico, <strong>para</strong> hal<strong>la</strong>r <strong>la</strong> dilución quereduce en 50% <strong>el</strong> número <strong>de</strong> p<strong>la</strong>cas, <strong>la</strong> cual representa <strong>el</strong> título <strong>de</strong>l suero.Este método es también utilizado <strong>para</strong> i<strong>de</strong>ntificar virus, pues se pone unvirus ais<strong>la</strong>do a una concentración constante previamente <strong>de</strong>finida frente adiluciones <strong>de</strong> un suero hiperinmune conocido.En <strong>la</strong> foto pue<strong>de</strong>n observarse <strong>la</strong>s p<strong>la</strong>cas producidas por una cepa <strong>de</strong> virus <strong>de</strong>ngue2 y una <strong>de</strong> cepa <strong>de</strong>ngue 1 en célu<strong>la</strong>s BHK21 (diluciones virales <strong>de</strong>s<strong>de</strong> 10 -2 a 10 -5 ).Las tres primeras fi<strong>la</strong>s rpresentan <strong>la</strong>s diluciones <strong>de</strong> <strong>de</strong>ngue 1 y <strong>la</strong>s tres restantes<strong>de</strong> <strong>de</strong>ngue 2.10 -2 10 -3 10 -4 10 -5D 1D 2
41En <strong>la</strong> neutralización se pue<strong>de</strong> utilizar <strong>el</strong> método <strong>de</strong> diluciones variables <strong>de</strong> virusfrente a una dilución constantes <strong>de</strong> suero. La dilución <strong>de</strong> virus que infecta <strong>el</strong> 50%<strong>de</strong>l hospe<strong>de</strong>ro se consi<strong>de</strong>ra <strong>el</strong> punto final. Los resultados obtenidos se com<strong>para</strong>ncon <strong>el</strong> título <strong>de</strong>l virus sin suero (control <strong>de</strong> virus) y se hal<strong>la</strong> <strong>el</strong> índice <strong>de</strong>neutralización. Una diferencia <strong>de</strong> al menos 2 en <strong>el</strong> logaritmo <strong>de</strong> base 10 seconsi<strong>de</strong>ra como un criterio <strong>de</strong> neutralización significativa. Este método pue<strong>de</strong> serutilizado <strong>para</strong> i<strong>de</strong>ntificar un virus (frente a un suero hiperinmune conocido a unadilución constante) o <strong>para</strong> conocer diferencias en <strong>el</strong> título neutralizante entre unsuero <strong>de</strong> paciente en fase aguda y un suero en fase convaleciente.El método <strong>de</strong> neutralización basado en una dilución variable <strong>de</strong>l virus que sepone en contacto con diluciones variables <strong>de</strong> suero, no se utiliza en <strong>la</strong> práctica,dada su complejidad.Referencias1. Morens, D.M., Halstead, S.B., Repik, P.M., Putvatana, R.P., and Raybourne, N.Simplified p<strong>la</strong>que reduction neutralization assay for <strong>de</strong>ngue viruses bysemimicro methods in BHK-21 c<strong>el</strong>ls: Comparison of the BHK suspension testwith standard p<strong>la</strong>que reduction neutralization. J. Clin. Microbiol. 1985; 22: 250-542. Alvarez M, Rodriguez-Roche R, Bernardo L, Morier L, Guzman G. ImprovedDengue Virus P<strong>la</strong>que Formation on BHK21 and LLCMK2 C<strong>el</strong>ls: Evaluation ofSome Factors. Dengue Bulletin 2005;29.
42PREPARACIÓN DE ANTÍGENO POR EL MÉTODODE SACAROSA-ACETONAAunque existen varios métodos <strong>para</strong> <strong>la</strong> pre<strong>para</strong>ción <strong>de</strong> antígenos <strong>para</strong> arbovirus,<strong>la</strong> técnica más utilizada es <strong>la</strong> extracción con sacarosa-acetona <strong>de</strong>scrita por C<strong>la</strong>rkey Casals en 1958, <strong>la</strong> cual proporciona antígenos estables con altos títulos.El proceso es potencialmente p<strong>el</strong>igroso y <strong>de</strong>ben tomarse <strong>la</strong>s medidas necesarias<strong>para</strong> <strong>la</strong> manipu<strong>la</strong>ción <strong>de</strong>l virus infeccioso, <strong>de</strong> <strong>la</strong> acetona (inf<strong>la</strong>mable) y <strong>de</strong> <strong>la</strong>sustancia inactivadora <strong>de</strong>l virus.Este método proporciona antígenos hemaglutinantes y fijadores <strong>de</strong>l complementopor lo que pue<strong>de</strong>n utilizarse <strong>para</strong> ambas técnicas.La acetona permite un mayor rendimiento viral al actuar sobre los lípidos <strong>de</strong>lcerebro. La sacarosa protege <strong>de</strong> <strong>la</strong> acción <strong>de</strong> <strong>la</strong> acetona sobre <strong>la</strong> envoltura <strong>de</strong>lvirus mediante un mecanismo que aun no ha sido dilucidado por completo. Lar<strong>el</strong>ación entre <strong>la</strong>s concentraciones <strong>de</strong> sacarosa, cerebro, acetona y agua parecenser críticas en <strong>el</strong> rendimiento viral.Materiales y Equipos:‣ Gabinete <strong>de</strong> seguridad‣ Centrífuga refrigerada‣ Homogenizador mecánico o <strong>el</strong>éctrico‣ CristaleríaReactivos:‣ Sacarosa‣ Acetona , calidad reactiva a -70 o C‣ Solución Borato Salina pH 9 (BS)‣ Tris ( Hydroxymethyl aminomethane, Gibco 130910 )‣ Beta propio<strong>la</strong>ctona (BPL) (Betaprone, F<strong>el</strong>lows Testagar, Detroit, Michigan)‣ Alcohol 70%
43Obtención <strong>de</strong> cerebros <strong>de</strong> ratones infectados:1. Inocu<strong>la</strong>r por vía intracerebral los ratones <strong>la</strong>ctantes <strong>de</strong> 1-2 días <strong>de</strong> nacidoscon 0.02 ml <strong>de</strong> una suspensión <strong>de</strong> cerebro <strong>de</strong> ratón infectado con alguno <strong>de</strong>los serotipos en cuestión. Esta suspensión usualmente se pre<strong>para</strong> a unadilución 1/50 <strong>de</strong>l cerebro en PBS con 5 % <strong>de</strong> suero <strong>de</strong> ternera inactivadopor calor y antibióticos. Pue<strong>de</strong> usarse en lugar <strong>de</strong> PBS, medio 199 u otro.2. Examinar los ratones inocu<strong>la</strong>dos entre <strong>el</strong> 4to y <strong>el</strong> 7mo día post inocu<strong>la</strong>ción(<strong>de</strong>pendiendo <strong>de</strong> <strong>la</strong> cepa y <strong>el</strong> serotipo inocu<strong>la</strong>do) en busca <strong>de</strong> los signos <strong>de</strong> <strong>la</strong>enfermedad. Cuando <strong>la</strong> mayoría <strong>de</strong> los ratones estén enfermos <strong>de</strong>bencong<strong>el</strong>arse preferiblemente a -20 ó -70 o C hasta su uso.3. Los ratones se <strong>de</strong>sinfectan con alcohol al 70% y se <strong>de</strong>jan secar. El tejidocerebral <strong>de</strong> cada ratón se extrae asépticamente por aspiración colocándolo enun frasco con hi<strong>el</strong>o.4. Para pre<strong>para</strong>r <strong>el</strong> antígeno pue<strong>de</strong>n utilizarse los cerebros previamenteextraídos y guardados a -70 C o pue<strong>de</strong>n guardarse los ratones a -20 ó -70 o Chasta <strong>el</strong> día antes <strong>de</strong> <strong>la</strong> pre<strong>para</strong>ción <strong>de</strong>l antígeno momento en <strong>el</strong> cual se <strong>de</strong>jandurante toda <strong>la</strong> noche a 4 o C <strong>para</strong> su <strong>de</strong>scong<strong>el</strong>ación y posterior extracción<strong>de</strong>l cerebro.Extracción <strong>de</strong>l antígenoEl antígeno se pre<strong>para</strong> asépticamente en un gabinete <strong>de</strong> seguridad grado 2preferiblemente. Tanto <strong>el</strong> antígeno como <strong>la</strong> acetona utilizada son infecciosas porlo que <strong>de</strong>ben manipu<strong>la</strong>rse con extremo cuidado. Debe evitarse <strong>el</strong> uso <strong>de</strong>mecheros durante <strong>el</strong> proceso.1. Por cada volumen <strong>de</strong> cerebro <strong>de</strong> ratón extraído añadir 4 volúmenes <strong>de</strong>sacarosa al 8.5 % en agua <strong>de</strong>sti<strong>la</strong>da. Homogenizar <strong>la</strong> suspensiónexhaustivamente en frío.2. Añadir <strong>la</strong> suspensión <strong>de</strong> cerebro a 20 volúmenes <strong>de</strong> acetona fría (kitasato).Utilizar <strong>para</strong> esto una aguja #18 <strong>la</strong>rga sumergida en <strong>la</strong> acetona.3. Agitar vigorosamente en ambos sentidos y <strong>de</strong>jar reposar en baño <strong>de</strong> hi<strong>el</strong>odurante 15 minutos.
444. Aspirar <strong>la</strong> acetona completamente y añadir otros 20 volúmenes <strong>de</strong> acetonafría. Romper <strong>el</strong> precipitado con un agitador <strong>de</strong> vidrio. Dejar sedimentar <strong>el</strong>antígeno y reposar en baño <strong>de</strong> hi<strong>el</strong>o durante 1,5 horas con agitaciónocasional durante <strong>la</strong> primera hora.5. Aspirar <strong>la</strong> acetona y secar <strong>el</strong> precipitado utilizando una bomba <strong>de</strong> altovacío (10 -2 mB) hasta <strong>la</strong> aparición <strong>de</strong> un polvo rosado c<strong>la</strong>ro(aproximadamente 30 min).6. Rehidratar con buffer tris-borato salina + 5% sacarosa a 0.5 volúmenes <strong>de</strong>lhomogenizado <strong>de</strong> cerebro-sacarosa (<strong>el</strong> tris se pre<strong>para</strong> al 1 M en cloruro <strong>de</strong>sodio al 0,85% y posteriormente se lleva a 0,1 M en buffer borato-salinapH 9 chequeándose este posteriormente).7. Dejar rehidratanto toda <strong>la</strong> noche a 4 o C con agitación.8. Centrifugar 30 minutos a 4 o C a 3000 rpm y <strong>de</strong>sechar <strong>el</strong> precipitado.9. Para inactivar <strong>el</strong> antígeno se aña<strong>de</strong> BPL <strong>para</strong> una concentración final <strong>de</strong>0.1% <strong>para</strong> <strong>de</strong>ngue 1, 3 y 4; al 0.19 % <strong>para</strong> <strong>de</strong>ngue 2. Agitar bien ymantener a 4 o C durante 48 horas.10. Distribuir en alícuotas <strong>para</strong> guardar a -70 o C o <strong>para</strong> liofilizar y guardar a -20 o C.11. Chequear si <strong>la</strong> inactivación fue efectiva inocu<strong>la</strong>ndo con <strong>el</strong> antígenoinactivado por vía intracerebral dos familias <strong>de</strong> ratones <strong>la</strong>ctantes yobservar por 21 días.12. Para los virus Dengue <strong>la</strong> concentración <strong>de</strong> BPL es crítica <strong>de</strong> acuerdo alserotipo, ya que concentraciones mayores reducen <strong>la</strong> actividad <strong>de</strong><strong>la</strong>ntígeno.13. Durante <strong>el</strong> proceso <strong>de</strong> extracción <strong>de</strong>ben reenvasarse varias ámpu<strong>la</strong>sconteniendo cerebro <strong>de</strong> ratón solo en suspensión al 10% (en PBS o medio<strong>de</strong> cultivo + suero <strong>de</strong> ternera al 5% + 100 U por ml <strong>de</strong> antibióticos) <strong>la</strong>scuales se guardarán a -70 o C y servirán como virus "semil<strong>la</strong>" <strong>para</strong> <strong>el</strong>próximo pase en ratones y <strong>de</strong> esta forma mantener <strong>el</strong> virus.
45HEMAGLUTINACIÓN E INHIBICIÓN DE LA HEMAGLUTINACIÓNAlgunos virus son capaces <strong>de</strong> aglutinar los glóbulos rojos. La hemaglutinación(HA) es <strong>la</strong> unión <strong>de</strong> los eritrocitos producida por <strong>el</strong> virus o por alguna estructura<strong>de</strong>l mismo. El resultado visible <strong>de</strong> <strong>la</strong> HA viral es un patrón formado en <strong>el</strong> fondo<strong>de</strong>l pozu<strong>el</strong>o por los eritrocitos unidos por <strong>la</strong> hemaglutinina viral.En <strong>la</strong> hemaglutinación directa <strong>el</strong> virus actúa directamente sobre <strong>la</strong>s célu<strong>la</strong>s y estapropiedad pue<strong>de</strong> ser inhibida por anticuerpos específicos al virus. En <strong>el</strong> caso <strong>de</strong>los arbovirus <strong>la</strong> propia partícu<strong>la</strong> viral es <strong>la</strong> hemaglutinina no existiendo enzima<strong>de</strong>structora <strong>de</strong>l receptor como en los orthomyxovirus.Los anticuerpos obtenidos contra los diferentes arbovirus poseen una ampliareactividad <strong>de</strong> grupo por lo que <strong>la</strong> prueba <strong>de</strong> inhibición <strong>de</strong> <strong>la</strong> hemaglutinación (IH)se utiliza <strong>para</strong> c<strong>la</strong>sificar los mismos en grupos antigénicos.Equipos:‣ Centrífuga refrigerada‣ P<strong>la</strong>cas en fondo U <strong>de</strong>sechables‣ Pipetas eppendorf <strong>de</strong> 25 y 50ul. Pipeta multicanal <strong>de</strong> 25-250ul.‣ CristaleríaReactivos:‣ Solución <strong>de</strong> AlseverDextrosa20.5 gNaCl4.2 gÁcido cítrico(C 6 H 8 O 7 .H 2 O)0.55 gCitrato <strong>de</strong> sodio(Na 3C 6H 5O 7.2H 2O) 8.0 gH 2O <strong>de</strong>sti<strong>la</strong>da a completar1000 mLEsterilizar en autoc<strong>la</strong>ve por 10 minutos a 10 libras <strong>de</strong> presión.‣ Glóbulos rojos <strong>de</strong> ganso, adulto, macho (sangrar sólo cada 6 semanas). Lashembras no se utilizan ya que los cambios en <strong>el</strong> ciclo hormonal pue<strong>de</strong>n variarlos títulos hemaglutinantes.‣ Cloruro <strong>de</strong> sodio 1.5 M.‣ Fosfato dibásico <strong>de</strong> sodio (Na 2HPO 4.12 H 2O) 0.5 M.‣ Fosfato monobásico <strong>de</strong> sodio (NaH 2 PO4.2H 2 O) 1 M.
46‣ Ácido Bórico 0.5 M.‣ Solución borato salina pH 9.‣ Albúmina bovina (fracción V) al 0.4 % en buffer borato salina, pH 9 (BABS)‣ Kaolín (<strong>la</strong>vado en ácido) al 25% en buffer borato salina (Flow <strong>la</strong>boratories) <strong>de</strong>lutilizado <strong>para</strong> <strong>el</strong> diagnóstico <strong>de</strong> Rubéo<strong>la</strong>.‣ Antígenos (pre<strong>para</strong>dos por <strong>el</strong> método sacarosa-acetona).‣ Soluciones stocks:NaCl (1.5 M).87.6g en 1000mL <strong>de</strong> agua <strong>de</strong>sti<strong>la</strong>daNaH 2PO 4 (anhídro) 1M 120g en 1000 mL <strong>de</strong> agua <strong>de</strong>sti<strong>la</strong>daNa 2HPO 4(anhídro)0,5 M 70.59g en 1000mL <strong>de</strong> agua <strong>de</strong>sti<strong>la</strong>da‣ Solución A (pH 8.8):‣ Solución B (pH 4.3):NaCl(1.5M)NaH 2PO 4(1 M)Completar con agua <strong>de</strong>sti<strong>la</strong>da100 mL200 mL1000 mLTab<strong>la</strong> <strong>de</strong> Valores <strong>de</strong> pHpH Solución A(mL)Solución B(mL)5.75 3.95 976.0 12.5 87.56.2 22 786.4 32 686.6 45 556.8 55 457.0 64 367.2 72 287.4 79 21NOTA: El pH final es obtenido mezc<strong>la</strong>ndo volúmenes iguales <strong>de</strong> buffer boratosalinapH 9 con cada una <strong>de</strong> <strong>la</strong>s soluciones anteriores. El ajuste <strong>de</strong> los pH sehace con <strong>la</strong>s soluciones A y B (<strong>de</strong>pendiendo si hay que acidificar o alcalinizar).Las soluciones <strong>de</strong> pH pue<strong>de</strong>n guardarse a 4 o C excepto <strong>la</strong>s que están por encima<strong>de</strong> 6.8 que pue<strong>de</strong>n cristalizar.
47‣ Soluciones stocks <strong>para</strong> buffer borato-salina pH 9:NaOH(1.0M) 40.02g Completar hasta 1000mL con agua<strong>de</strong>sti<strong>la</strong>da.BO 3 H 3 (0.5 M) 30.912g Completar hasta 1000mL con agua<strong>de</strong>sti<strong>la</strong>da.NaCl(1.5 M) 87.6g Completar hasta 1000mL con agua<strong>de</strong>sti<strong>la</strong>da.Buffer borato-salina:NaOH(1.0 M) 24 mLBO 3H 3(0.5 M) 100 mLNaCl(1.5 M) 80 mLCompletar a 1000 mL con agua <strong>de</strong>sti<strong>la</strong>da y ajustar <strong>el</strong> pH a 9. No <strong>de</strong>be usarse pormás <strong>de</strong> 30 días.‣ Albúmina bovina 0.4%:Albúmina bovinaBuffer borato salina pH 90.8 g200 mLAjustar <strong>el</strong> pH a 9 utilizando NaOH 2N. Pue<strong>de</strong> pre<strong>para</strong>rse una solución al 4% encantidad <strong>de</strong> 100 ml y filtrar por "millipore" <strong>la</strong> que pue<strong>de</strong> guardarse en frío hastasu uso momento en <strong>el</strong> cual <strong>de</strong>be diluirse 10 veces en buffer borato salina pH 9.Una vez pre<strong>para</strong>da <strong>de</strong>be utilizarse en una semana y guardarse a 4 o C.Dilución <strong>de</strong>l Antígeno: Las diluciones <strong>de</strong> antígenos y sueros se realizan conalbúmina bovina 0.4%.Pre<strong>para</strong>ción <strong>de</strong> los glóbulos rojos <strong>de</strong> ganso:1. Extraer <strong>la</strong> sangre <strong>de</strong> forma estéril (1 parte <strong>de</strong> sangre y 4 <strong>de</strong> Alsever). Usaruna aguja <strong>de</strong> # 20. Filtrar por gasa estéril.2. Lavar <strong>la</strong>s célu<strong>la</strong>s 3 veces en solución salina (0.9g <strong>de</strong> NaCl en 100 mL <strong>de</strong>agua <strong>de</strong>sti<strong>la</strong>da) o PBS. Centrifugar en un tubo <strong>de</strong> fondo redondo yposteriormente <strong>de</strong> fondo cónico a 1000 rpm por 10 minutos a 4 o C.Eliminar <strong>el</strong> sobrenadante.
483. Para <strong>la</strong> técnica pre<strong>para</strong>r una solución al 0.5 % <strong>de</strong> glóbulos en los buffers<strong>de</strong> diferentes pH previamente ajustados.4. Si no se emplean los glóbulos inmediatamente pue<strong>de</strong>n ser guardados a 4 º Cen solución salina o PBSTratamiento <strong>de</strong> los sueros con Kaolín:El kaolín se utiliza <strong>para</strong> <strong>el</strong>iminar los inhibidores inespecíficos <strong>de</strong> <strong>la</strong>hemaglutinación, que puedan estar presentes en los sueros humanos. Pue<strong>de</strong>nexistir lotes <strong>de</strong> kaolín que no brin<strong>de</strong>n resultados satisfactorios.1. Tomar 0.1 mL <strong>de</strong> suero.2. Añadir 0.4 mL buffer borato salina pH 9 (<strong>el</strong> suero queda diluido 1:5).3. Añadir 0.5 mL <strong>de</strong> Kaolín previamente agitado.4. Agitar <strong>la</strong> mezc<strong>la</strong>.5. Dejar a temperatura ambiente por 20 minutos con agitación ocasional.6. Centrifugar a 2,500 rpm durante 30 minutos a temperatura ambiente.7. El suero queda diluido 1:10.Para <strong>el</strong>iminar <strong>la</strong>s aglutininas inespecíficas se absorben los sueros ya tratados conglóbulos rojos <strong>de</strong> ganso <strong>de</strong> <strong>la</strong> siguiente forma:1. Pre<strong>para</strong>r una suspensión <strong>de</strong> glóbulos rojos <strong>de</strong> ganso al 50% en soluciónsalina ó PBS.2. Añadir 0,025 mL <strong>de</strong> <strong>la</strong> sunspensión anterior al suero ya tratado y agitar.3. Mantener a 4 o C durante 20 minutos con agitación ocasional.4. Centrifugar a 1,500 rpm 10 minutos a 4 o C.5. Guardar en frío (si se transfiere a otro tubo pue<strong>de</strong> mantenerse durantevarios días a 4 o C sin pérdida apreciable <strong>de</strong>l título <strong>de</strong> anticuerpos) No<strong>de</strong>ben almacenarse por tiempo in<strong>de</strong>finido ya que los títulos no son establesy <strong>la</strong>s aglutininas inespecíficas pue<strong>de</strong>n reaparecer.
49Hemaglutinación (HA)1. Hidratar los antígenos liofilizados y mantenerlos a 4 o C por al menos 1hora, pero preferiblemente toda <strong>la</strong> noche.2. Pre<strong>para</strong>r diluciones seriadas (al doble) en <strong>la</strong>s p<strong>la</strong>cas previamenterotu<strong>la</strong>das, a los diferentes pH <strong>de</strong> trabajo (<strong>el</strong> pH óptimo <strong>para</strong> <strong>el</strong> antígeno, <strong>el</strong>valor superior <strong>de</strong> pH y <strong>el</strong> valor inferior). De no conocer <strong>el</strong> pH óptimo <strong>de</strong>cada antígeno, <strong>de</strong>be titu<strong>la</strong>rse a todos los pH.3. Añadir 0,025 mL <strong>de</strong> BABS a cada pozu<strong>el</strong>o <strong>de</strong> <strong>la</strong> p<strong>la</strong>ca.4. Añadir 0,025 mL <strong>de</strong>l antígeno al primer pozu<strong>el</strong>o <strong>de</strong> cada hilera.5. Hacer diluciones al doble comenzando por <strong>el</strong> primer pozu<strong>el</strong>o y utilizandopipetas “multicanal”.6. Agitar <strong>la</strong> p<strong>la</strong>ca.7. Añadir 0,025 mL <strong>de</strong> <strong>la</strong> solución glóbulos rojos al 0.5% pre<strong>para</strong>dos en cadauno <strong>de</strong> los diferentes pH.8. Agitar y <strong>de</strong>jar reposar <strong>de</strong> 30-40 minutos a temperatura ambiente.9. Leer <strong>la</strong> hemaglutinación (una capa fina y bien distribuida <strong>de</strong> glóbulos).Para <strong>de</strong>terminar <strong>el</strong> título hemaglutinante y <strong>el</strong> pH óptimo <strong>de</strong> antígeno se usa comopunto final <strong>la</strong> más alta dilución <strong>de</strong> antígeno que muestra aglutinación completa(título <strong>de</strong>l antígeno). El pH óptimo es aqu<strong>el</strong> don<strong>de</strong> <strong>el</strong> título <strong>de</strong>l antígeno es mayor.Para <strong>la</strong> IH se utiliza una dilución <strong>de</strong> antígeno que contenga <strong>de</strong> 4 a 8 unida<strong>de</strong>shemaglutinantes (UH) por 0,025 ml:Ejemplo:Si <strong>el</strong> título <strong>de</strong>l antígeno es 1:2048, entonces:2048 1 UH1024 2 UH512 4 UH256 8 UHPor tanto, <strong>de</strong>be realizarse una dilución <strong>de</strong>l antígeno <strong>de</strong> 1:256 que dará <strong>la</strong>s 8 UH /0,025 mL. La dilución <strong>de</strong>l antígeno se hace en BABS, y es aconsejable retitu<strong>la</strong>r <strong>el</strong>mismo una vez hecha <strong>la</strong> dilución <strong>para</strong> comprobar que contenga <strong>la</strong>s 8 UH.
50Patrón <strong>de</strong> hemaglutinación:‣ No hemaglutinación: Los glóbulos rojos sedimentan en <strong>el</strong> fondo <strong>de</strong>l pozu<strong>el</strong>oobservándose como un botón.‣ Hemaglutinación parcial: Se observa un anillo <strong>de</strong> célu<strong>la</strong>s aglutinadasalre<strong>de</strong>dor <strong>de</strong> un botón en <strong>el</strong> centro. No se lee como punto final <strong>de</strong>hemaglutinación.‣ Hemaglutinación completa: Los glóbulos rojos dan una capa fina y biendistribuida en <strong>el</strong> pozu<strong>el</strong>o. Se lee como punto final <strong>de</strong> <strong>la</strong> hemaglutinación.Inhibición <strong>de</strong> <strong>la</strong> hemaglutinación (IH)1. Rotu<strong>la</strong>r <strong>la</strong>s p<strong>la</strong>cas con <strong>el</strong> número <strong>de</strong> los sueros a probar y <strong>el</strong> antígeno autilizar. Es recomendable usar una p<strong>la</strong>ca por antígeno. Los sueros sonprobados utilizando 4, 8 ó 12 diluciones <strong>de</strong> los mismos contra <strong>el</strong> antígeno;<strong>de</strong>pendiendo esto <strong>de</strong>l tipo <strong>de</strong> suero, <strong>de</strong>l propósito y <strong>de</strong> <strong>la</strong> experiencia <strong>de</strong>l<strong><strong>la</strong>boratorio</strong> en <strong>el</strong> diagnóstico o encuestas serológicas. Los pares <strong>de</strong> suero <strong>de</strong>un paciente <strong>de</strong>ben ser tratados y probados en <strong>el</strong> mismo ensayo.2. Añadir 0,025 mL <strong>de</strong> BABS a cada pozu<strong>el</strong>o.3. Añadir 0,025 mL <strong>de</strong>l suero a titu<strong>la</strong>r en <strong>el</strong> primer pozu<strong>el</strong>o <strong>de</strong> cada hilera.4. Diluir los sueros con pipeta “multicanal”.5. Añadir a cada pozu<strong>el</strong>o 0,025 mL <strong>de</strong> <strong>la</strong> dilución <strong>de</strong> antígeno que contiene 8unida<strong>de</strong>s hemaglutinantes.6. Agitar y <strong>de</strong>jar reposar a temperatura ambiente durante 45 minutos.7. Añadir 0,05 ml <strong>de</strong> glóbulos rojos diluidos en <strong>el</strong> pH óptimo <strong>para</strong> <strong>el</strong> virus.8. Agitar y <strong>de</strong>jar reposar a temperatura ambiente durante 30 minutos.Lectura:La inhibición <strong>de</strong> <strong>la</strong> hemaglutinación presenta un patrón <strong>de</strong> no hemaglutinación.El título <strong>de</strong> anticuerpos inhibidores <strong>de</strong> <strong>la</strong> hemaglutinación es <strong>la</strong> mayor dilución <strong>de</strong>cada suero que produce inhibición <strong>de</strong> <strong>la</strong> hemaglutinación completa o casicompleta y se expresa como <strong>la</strong> dilución <strong>de</strong>l suero. Como <strong>el</strong> patrón <strong>de</strong> aglutinaciónpue<strong>de</strong> cambiar con <strong>el</strong> tiempo, <strong>el</strong> punto final pue<strong>de</strong> ser marcado sobre <strong>la</strong> p<strong>la</strong>ca conun plumón tan pronto como se forme.
51Controles:‣ Control <strong>de</strong> glóbulos rojos <strong>de</strong> ganso (permite <strong>de</strong>tectar aglutinación inespecífica<strong>de</strong> <strong>la</strong>s célu<strong>la</strong>s en ausencia <strong>de</strong> suero y antígeno); solo contiene BABS y glóbulosrojos.‣ Control <strong>de</strong> suero positivo o líquido ascítico hiperinmune con anticuerpos a<strong>la</strong>ntígeno utilizado.‣ Control <strong>de</strong> suero negativo al antígeno utilizado.‣ Control <strong>de</strong> célu<strong>la</strong>s <strong>para</strong> cada suero <strong>para</strong> <strong>de</strong>tectar aglutinación no específica(sólo contiene una dilución baja <strong>de</strong> suero 1:10 o 1:20 y glóbulos rojos.‣ Control <strong>de</strong> <strong>la</strong>s unida<strong>de</strong>s hemaglutinantes <strong>de</strong>l antígeno.En <strong>la</strong> foto se muestra <strong>el</strong> título <strong>de</strong>AcsIH en 6 pares <strong>de</strong> sueros frentea virus <strong>de</strong>ngue 2.Suero 1 (
52Interpretación <strong>de</strong> <strong>la</strong> respuesta <strong>de</strong> Acs IH a <strong>de</strong>ngueRespuesta <strong>de</strong>AnticuerposIntervalo 1er y 2dosueroTítulo sueroconvalecienteInterpretaciónaumento >= 4 veces >= 7 días = 4 veces cualquier muestra >= 1:2560infeccióncomprobada,secundariaaumento >= 4 veces < 7 días = 1:2560presunta infección,secundariasin cambio >= 7 días
53PREPARACIÓN DE CONJUGADO ANTI-DENGUE-PEROXIDASAEn los últimos años se han <strong>de</strong>sarrol<strong>la</strong>do métodos inmunológicos que han tenidouna aplicación creciente en <strong>el</strong> campo <strong>de</strong> <strong>la</strong> virología. Algunos <strong>de</strong> estos métodos sehan agrupado bajo <strong>el</strong> nombre <strong>de</strong> "Métodos rápidos <strong>para</strong> <strong>el</strong> diagnóstico virológico",entre los cuales se <strong>de</strong>staca <strong>el</strong> Inmunoensayo Enzimático Sobre Fase Sólidaconocido como ELISA, que por reunir características que lo hacen muy útil <strong>para</strong><strong>la</strong> <strong>de</strong>tección <strong>de</strong> anticuerpos y antígenos ha reforzado o reemp<strong>la</strong>zado algunos <strong>de</strong>los métodos clásicos.Uno <strong>de</strong> los componentes principales <strong>de</strong> este sistema lo constituyen losconjugados, los cuales están formados por una enzima ligada a un antígeno oanticuerpo <strong>de</strong>terminado.Existe una gran variedad <strong>de</strong> enzimas que han sido utilizadas como marcadores,por ser estables, altamente reactivas y puras, entre <strong>la</strong>s que se encuentran: <strong>la</strong>Acetil colinesterasa, Citocromo C, B-D-ga<strong>la</strong>ctosidasa y otras. Sin embargo <strong>la</strong>Fosfatasa alcalina y <strong>la</strong> peroxidasa han sido <strong>la</strong>s más utilizadas por su bajo costo,fácil conjugación y su amplia variedad <strong>de</strong> sustrato.En <strong>el</strong> proceso <strong>de</strong> conjugación es importante que tanto <strong>la</strong> enzima como <strong>el</strong>anticuerpo o antígeno mantengan al máximo su actividad, a<strong>de</strong>más <strong>de</strong> lograr unóptimo acop<strong>la</strong>miento <strong>de</strong> ambos componentes. Entre los métodos <strong>de</strong> conjugaciónmás utilizados se encuentran <strong>el</strong> <strong>de</strong> Glutaral<strong>de</strong>hido <strong>de</strong> 2 pasos y <strong>el</strong> <strong>de</strong>l Peryodato,siendo este último <strong>el</strong> que brinda mejores resultados cuando se trabaja conperoxidasa (Nakane PK et al., 1974).Precipitación <strong>de</strong> inmunoglobulinas con sulfato <strong>de</strong> amonioMateriales:‣ Solución saturada <strong>de</strong> sulfato <strong>de</strong> amonio (pH 7). La solución <strong>de</strong>be pre<strong>para</strong>rsecon varios días <strong>de</strong> anticipación <strong>para</strong> garantizar su saturación y <strong>de</strong>be serfiltrada antes <strong>de</strong> usarse.‣ Solución salina al 0.85%: 8,5 g en 1L <strong>de</strong> agua <strong>de</strong>sti<strong>la</strong>da.
54Método:‣ Adicionar 2 ml <strong>de</strong> suero humano conteniendo anticuerpos inhibidores <strong>de</strong> <strong>la</strong>hemaglutinación con títulos <strong>de</strong> 1/1280 o más, contra los 4 serotipos <strong>de</strong> virus<strong>de</strong>ngue a 2 ml <strong>de</strong> solución salina al 0,85%.‣ La mezc<strong>la</strong> es mantenida en agitación con <strong>la</strong> adición lenta <strong>de</strong> 4 ml <strong>de</strong> <strong>la</strong>solución saturada <strong>de</strong> sulfato <strong>de</strong> amonio, continuar <strong>la</strong> agitación durante 45minutos.‣ La mezc<strong>la</strong> es centrifugada a 5000 rpm por 30 minutos a 4 o C. El sobrenadantees <strong>el</strong>iminado.‣ El precipitado es resuspendido en 2 ml <strong>de</strong> solución salina. Se adicionanlentamente y agitando, 2 ml <strong>de</strong> sulfato <strong>de</strong> amonio, manteniéndose <strong>la</strong> agitaciónpor unos minutos. Centrifugar nuevamente.‣ Se repite <strong>el</strong> paso anterior.‣ Se resuspen<strong>de</strong> con 2 ml <strong>de</strong> solución salina y se dializa contra gran<strong>de</strong>svolúmenes <strong>de</strong> dicha solución (3 veces por 2 litros <strong>de</strong> salina) a 4 o C.‣ Determinar <strong>la</strong> concentración <strong>de</strong> inmunoglobulinas mediante <strong>la</strong> lectura <strong>de</strong> <strong>la</strong><strong>de</strong>nsidad óptica a 280 y 260 nm.Concentración <strong>de</strong> inmunoglobulinasPara <strong>de</strong>terminar <strong>la</strong> concentración <strong>de</strong> proteínas <strong>de</strong> una muestra, se <strong>de</strong>termina <strong>la</strong><strong>de</strong>nsidad óptica <strong>de</strong> <strong>la</strong> muestra a 280 y a 260; se calcu<strong>la</strong> <strong>la</strong> r<strong>el</strong>ación (R 280 / 260),y se <strong>de</strong>termina <strong>el</strong> factor (F) correspondiente en <strong>la</strong> tab<strong>la</strong>, se proce<strong>de</strong> entonces asustituir en <strong>la</strong> siguiente ecuación:Concentración <strong>de</strong> proteínas (mg/mL) = F x 1/d x DO 280Don<strong>de</strong>: d es <strong>el</strong> ancho <strong>de</strong> <strong>la</strong> cubeta en cm.
55Algunos valores <strong>de</strong> F y R (280 / 260)R 280 / 260 % Ácidos nucleicos F1.75 0.00 1.1161.63 0.25 1.0811.52 0.50 1.0511.40 0.75 1.0231.36 1.00 0.9941.30 1.25 0.9701.25 1.50 0.9441.16 2.00 0.8901.09 2.50 0.8521.03 3.00 0.8140.979 3.500 0.7700.939 4.00 0.7430.874 5.00 0.6280.846 5.50 0.6500.822 6.00 0.6320.801 6.50 0.6070.781 7.00 0.5850.767 7.50 0.5650.753 8.00 0.5450.730 9.00 0.5060.705 10.00 0.4780.671 12.00 0.4220.644 14.00 0.3770.615 17.00 0.3220.505 20.00 0.278Conjugación por <strong>el</strong> método <strong>de</strong>l peryodato <strong>de</strong> sodioMateriales:‣ Buffer Acetato <strong>de</strong> sodio 1mM, pH 4.4.Solución A: Acetato <strong>de</strong> sodio anhidro 8.24 g en 1 L <strong>de</strong> agua <strong>de</strong>sti<strong>la</strong>daSolución B: Ácido acético 6 ml en 1L <strong>de</strong> agua <strong>de</strong>sti<strong>la</strong>da.Añadir una parte <strong>de</strong> A <strong>para</strong> dos partes <strong>de</strong> B.Diluir 1:100 con agua <strong>de</strong>sti<strong>la</strong>da <strong>para</strong> obtener 1mM. Chequear pH 4,4‣ Buffer Bicarbonato <strong>de</strong> sodio 0,2 M pH 9,5.Solución A: Carbonato <strong>de</strong> sodio anhidro 0,2 M 0.212g/10mL <strong>de</strong> agua<strong>de</strong>sti<strong>la</strong>da.Solución B: Bicarbonato <strong>de</strong> sodio 0,2 M 0.16802g/10mL <strong>de</strong> agua <strong>de</strong>sti<strong>la</strong>da.Añada A a B hasta obtener pH 9,5.
56‣ Buffer Carbonato / Bicarbonato 0,01M pH 9,5.Carbonato <strong>de</strong> sodio anhidro 1,59gBicarbonato <strong>de</strong> sodio2,93g.Disolver en 1 L <strong>de</strong> agua <strong>de</strong>sti<strong>la</strong>da y ajustar <strong>el</strong> pH si es necesario. Diluir 1:5 <strong>para</strong>obtener 0,01 M.‣ Buffer Borato, 0,1 M, pH 7,4.Ácido bórico 24,732 g en 4 L <strong>de</strong> agua <strong>de</strong>sti<strong>la</strong>daBórax 19,07 g en 500 mL <strong>de</strong> agua <strong>de</strong>sti<strong>la</strong>da.Añada aproximadamente 115 ml <strong>de</strong> bórax a 4 L <strong>de</strong> ácido bórico, ajuste pH 7,4.‣ Peryodato <strong>de</strong> sodio‣ Borohidruro <strong>de</strong> sodio.Método:1. Disu<strong>el</strong>va 8 mg <strong>de</strong> Peroxidasa <strong>de</strong> Rábano picante ( tipo VI ) "Sigma"en 1 mL <strong>de</strong>agua <strong>de</strong>sti<strong>la</strong>da.2. Prepare solución fresca <strong>de</strong> peryodato <strong>de</strong> sodio 0.01 M (21 mg/mL) en agua<strong>de</strong>sti<strong>la</strong>da. Añada 0.2 mL <strong>de</strong> esta solución a <strong>la</strong> <strong>de</strong> peroxidasa suavemente yagitando, manténgalo en agitación durante 20 min. a temperatura ambiente.3. La mezc<strong>la</strong> <strong>de</strong> peroxidasa y peryodato es dializada toda <strong>la</strong> noche contra unexceso <strong>de</strong> buffer acetato <strong>de</strong> sodio 1mM pH 4,4 a 4 o C. Se dializa también 1mL<strong>de</strong> <strong>la</strong>s Igs a conjugar en concentraciones <strong>de</strong> 10 mg/mL contra buffercarbonato-bicarbonato 0.01M pH9,5.4. Añadir 20 uL <strong>de</strong> buffer bicarbonato <strong>de</strong> sodio 0.2M pH 9.5 a <strong>la</strong> peroxidasa.Chequear pH y añadir otros 20µL si fuese necesario. Adicione 1mL <strong>de</strong> Igsdializadas. Agite <strong>la</strong> mezc<strong>la</strong> suavemente por 2 horas a temperatura ambiente.5. Adicione 0.1 mL <strong>de</strong> borohidruro <strong>de</strong> sodio (4mg/mL) recién pre<strong>para</strong>da, a <strong>la</strong>mezc<strong>la</strong>. Mantenga <strong>la</strong> agitación por 2 horas a 4 o C.Después <strong>de</strong>l paso <strong>de</strong>l borohidruro se pue<strong>de</strong>n hacer dos variantes <strong>para</strong> <strong>la</strong>purificación y/o concentración <strong>de</strong>l conjugado:
57Primera variante:1. Dialice <strong>la</strong> mezc<strong>la</strong> contra buffer borato pH 7.4 toda <strong>la</strong> noche a 4 o C.2. Para se<strong>para</strong>r <strong>el</strong> conjugado <strong>de</strong>l no conjugado pasar <strong>la</strong> mezc<strong>la</strong> por unacolumna <strong>de</strong> Sepha<strong>de</strong>x G-200 equilibrada con buffer borato. Determinar losvalores <strong>de</strong> <strong>de</strong>nsidad óptica <strong>de</strong> cada fracción, a 280 y 403 nm, colectandoaqu<strong>el</strong><strong>la</strong>s don<strong>de</strong> coincidan los valores máximos <strong>para</strong> ambas longitu<strong>de</strong>s <strong>de</strong>onda (concentrar a 1 mL). Agregar albúmina bovina fracción V aconcentración final <strong>de</strong>l 1% y glicerol a igual volumen <strong>de</strong>l conjugado.Homogeneizar bien.3. Determinar <strong>el</strong> título <strong>de</strong>l conjugado mediante <strong>la</strong> técnica ELISA.4. El título se <strong>de</strong>termina realizando varias diluciones <strong>de</strong>l conjugado,utilizando como dilución <strong>de</strong> trabajo aqu<strong>el</strong><strong>la</strong> que presente un valor <strong>de</strong><strong>de</strong>nsidad óptica cercano a 1.0.5. Envasar en alicuotas y almacenar a -20 o C.Segunda variante1. Precipitación con sulfato <strong>de</strong> amonio: Después <strong>de</strong>l paso con borohidruroañadir al conjugado igual volumen <strong>de</strong> sulfato <strong>de</strong> amonio saturado gota agota y agitando. Dejar 5 minutos en agitación y centrifugar a 5 000 rpmpor 10 minutos. Eliminar sobrenadante y resuspen<strong>de</strong>r <strong>el</strong> p<strong>el</strong>let en 1 mL <strong>de</strong>PBS. Dializar toda <strong>la</strong> noche contra PBS.2. Agregar albúmina bovina fracción V <strong>para</strong> una concentración final <strong>de</strong>l 1 % yglicerol a igual volumen <strong>de</strong>l conjugado. Homogeneizar bien.3. Determinar <strong>el</strong> título <strong>de</strong>l conjugado mediante <strong>la</strong> técnica ELISA.4. El título se <strong>de</strong>termina realizando varias diluciones <strong>de</strong>l conjugado,utilizando como dilución <strong>de</strong> trabajo aqu<strong>el</strong><strong>la</strong> que presente un valor <strong>de</strong><strong>de</strong>nsidad óptica cercano a 1.0.5. Envasar en alicuotas y almacenar a -20 o C.Referencias1. Nakane PK and Kawoi A 1974. Peroxidase-<strong>la</strong>b<strong>el</strong>ed antibody. A new method ofconjugation. J. Histochem. Cytochem. 22: 1084
58MÉTODO ELISA DE INHIBICIÓN (MEI)Las técnicas serológicas constituyen un auxiliar imprescindible <strong>para</strong> <strong>el</strong> diagnósticovirológico y se les confiere esta importancia por lo difícil que resulta, en <strong>la</strong> mayoría <strong>de</strong>los casos, lograr <strong>el</strong> diagnóstico por ais<strong>la</strong>miento viral.Para <strong>el</strong> diagnóstico <strong>de</strong> los arbovirus se han aplicado pruebas serológicas que por suamplio uso se consi<strong>de</strong>ran como técnicas clásicas; tal es <strong>el</strong> caso <strong>de</strong> <strong>la</strong> Inhibición <strong>de</strong> <strong>la</strong>Hemaglutinación (IH), <strong>la</strong> Fijación <strong>de</strong>l Complemento (FC) y <strong>la</strong> Neutralización (Nt), sinembargo <strong>de</strong>s<strong>de</strong> hace varios años se han introducido técnicas <strong>de</strong> mayor sensibilidad yfacilidad <strong>de</strong> ejecución, que han ido ganando terreno en <strong>el</strong> campo <strong>de</strong>l diagnóstico enVirología, sobre todo por lograr resultados rápidos. Entre <strong>el</strong><strong>la</strong>s se encuentran losinmunoensayos enzimáticos y <strong>de</strong> estos, <strong>el</strong> Inmunoensayo enzimático sobre fasesólida (ELISA), ha sido <strong>de</strong> gran aplicación en <strong>el</strong> diagnóstico <strong>de</strong> otros virus comoHepatitis, Rubéo<strong>la</strong>, Encefalitis B Japonesa, Citomegalovirus y otros.ELISA DE INHIBICIONMUESTRA NEGATIVA(SIN ANTICUERPOS)COLORMUESTRA POSITIVANO COLORconjugadoanti-<strong>de</strong>nguemuestraantígenoIg anti <strong>de</strong>ngue
59Materiales:‣ Inmunoglobulinas humanas anti-<strong>de</strong>nguePool <strong>de</strong> sueros humanos conteniendo anticuerpos inhibidores <strong>de</strong> <strong>la</strong> hemaglutinacióncon título mayor o igual a 1/1280 contra los virus <strong>de</strong>l complejo <strong>de</strong>ngue, precipitadospor <strong>el</strong> método <strong>de</strong>l sulfato <strong>de</strong> amonio y <strong>de</strong>terminando su concentración mediante <strong>la</strong>lectura <strong>de</strong> <strong>la</strong> <strong>de</strong>nsidad óptica a 280 y 260 nm.‣ Antígeno <strong>de</strong> Dengue 2Antígeno pre<strong>para</strong>do según <strong>el</strong> método <strong>de</strong> sacarosa‣ Buffer <strong>de</strong> Recubrimiento (coatting) 0,05 M pH 9,5Carbonato <strong>de</strong> sodio (Na 2CO 3)anhidro 1,59g ; Bicarbonato <strong>de</strong> sodio (NaHCO 3)2,93g. Disu<strong>el</strong>va en 1L <strong>de</strong> agua <strong>de</strong>sti<strong>la</strong>da, ajuste pH si es necesario. (Duraciónmáxima <strong>de</strong> 15 días, mantener a 4 o C)‣ PBS-Tween 20 (PBS-T) pH 7,4Cloruro <strong>de</strong> sodio (NaCl) 8g; Cloruro <strong>de</strong> potasio (KCl) 0,2g; Fosfato monobásico <strong>de</strong>potasio (KH 2PO 4) 0,2g; Fosfato dibásico <strong>de</strong> sodio anhidro (Na 2HPO 4) 1,2g.Disu<strong>el</strong>va en 1L <strong>de</strong> agua <strong>de</strong>sti<strong>la</strong>da y agregue 0,5 mL <strong>de</strong> Tween-20. (Mantenerlo atemperatura ambiente)‣ Fosfato-citrato 0,05M pH 5:Ácido cítrico 5,1g; Fosfato dibásico <strong>de</strong> sodio anhidro 7,47g.Disu<strong>el</strong>va en 1L <strong>de</strong> agua <strong>de</strong>sti<strong>la</strong>da. Ajuste pH a 5.‣ Ortofenilendiamina (OPD)‣ Peróxido <strong>de</strong> hidrógeno (p.a.) 100 vol/ 30%‣ Albúmina bovina sérica fracción V (ABS) al 1%Disu<strong>el</strong>va 1g <strong>de</strong> ABS en 100mL <strong>de</strong> buffer <strong>de</strong> recubrimiento (coatting). (Pre<strong>para</strong>rloal momento <strong>de</strong> ser usado)‣ Sustrato25 mL <strong>de</strong> buffer fosfato-citrato; 10mg <strong>de</strong> OPD + 10ul H 2 O 2 .(Proteger <strong>de</strong> <strong>la</strong> luz)
60Método:1. Adsorber en p<strong>la</strong>ca <strong>de</strong> poliestireno Igs humanas anti-<strong>de</strong>ngue en buffercarbonato / bicarbonato pH 9,5 a una concentración <strong>de</strong> 10ug/mL (100uL porpozo). Dejar <strong>la</strong>s p<strong>la</strong>cas en cámara húmeda tapada toda <strong>la</strong> noche a 4 o C. Senecesita un volumen <strong>de</strong> 10 mL por p<strong>la</strong>ca.2. Vaciar <strong>el</strong> contenido <strong>de</strong> <strong>la</strong>s p<strong>la</strong>cas y hacer un bloqueo con 150ul en cada pozo<strong>de</strong> <strong>la</strong> solución <strong>de</strong> ABS al 1% en buffer Carbonato/Bicarbonato. Incubar a 37 o Cpor 1 hora. Volumen total <strong>de</strong> 15 mL por p<strong>la</strong>ca.3. Lavar <strong>la</strong>s p<strong>la</strong>cas 3 veces con PBS-T.4. Agregar 100ul <strong>de</strong> <strong>la</strong> dilución <strong>de</strong> trabajo <strong>de</strong> <strong>la</strong> suspensión <strong>de</strong>l antígeno en cadapozo (diluido en PBS-T en <strong>de</strong>pen<strong>de</strong>ncia <strong>de</strong>l título obtenido).5. Incubar <strong>la</strong> p<strong>la</strong>ca 1 hora a 37 o C.6. El título <strong>de</strong>l antígeno se <strong>de</strong>termina realizando varias diluciones <strong>de</strong> este yutilizando como control negativo antígeno <strong>de</strong> cerebro normal <strong>de</strong> ratón extraídosegún <strong>el</strong> método <strong>de</strong> sacarosa acetona a <strong>la</strong>s mismas diluciones <strong>de</strong>l antígenoviral, se realiza <strong>la</strong> curva <strong>de</strong> dosis-respuesta <strong>de</strong>terminando <strong>la</strong> dilución <strong>de</strong>antígeno cuya <strong>de</strong>nsidad óptica <strong>de</strong> cercana a 1,0 y que este valor, alr<strong>el</strong>acionarlo con <strong>el</strong> <strong>de</strong>l control negativo, sea <strong>de</strong> 5 a 10 veces mayor. Ejemplo: Sia <strong>la</strong> dilución <strong>de</strong> 1/40 da un valor <strong>de</strong> DO <strong>de</strong> 1,105 y <strong>el</strong> control negativo a esamisma dilución da 0,12 entonces <strong>la</strong> dilución <strong>de</strong> trabajo <strong>de</strong>l antígeno será1:40.7. Lavar 3 veces con PBS-T.8. Agregar 100uL por pozo <strong>de</strong> los sueros diluidos 1/20 en PBS-T, al igual qu<strong>el</strong>os sueros controles (positivo por duplicado y negativo por cuadruplicado).Agregar en 2 pozos PBS-T a igual volumen que los sueros. Incubar a 37 o C por1 hora.9. Lavar 3 veces con PBS-T.10. Añadir 100 uL por pozo <strong>de</strong>l conjugado anti-<strong>de</strong>ngue-peroxidasa diluido 1/8000en PBS-T con 2% <strong>de</strong> suero <strong>de</strong> ternero. Dejar incubando 1 hora a 37 o C.11. Lavar 3 veces con PBS-T.12. Añadir <strong>el</strong> sustrato 100uL por pozo. El sustrato <strong>de</strong>be ser pre<strong>para</strong>do unosminutos antes <strong>de</strong> su utilización. Esperar 30 minutos <strong>de</strong> reacción.
6113. Detener <strong>la</strong> reacción agregando 100 uL <strong>de</strong> ácido sulfúrico al 12,5 % en cadapozo.14. Determinar los valores <strong>de</strong> <strong>de</strong>nsidad óptica a 492nm en un lector Micro-ELISA.15. Calcu<strong>la</strong>r los % <strong>de</strong> inhibición <strong>para</strong> cada muestra según <strong>la</strong> siguiente fórmu<strong>la</strong>:% <strong>de</strong> Inhibición <strong>de</strong> ELISA = 1 - (DO <strong>de</strong> <strong>la</strong> muestra/ DO <strong>de</strong> <strong>la</strong> media <strong>de</strong>lcontrol negativo) x 100Criterio <strong>de</strong> positividadAqu<strong>el</strong>los sueros que presenten un % <strong>de</strong> inhibición mayor o igual al 50% conr<strong>el</strong>ación al control negativo.En casos <strong>de</strong> pares <strong>de</strong> sueros, se consi<strong>de</strong>ra seroconversión en aqu<strong>el</strong>los cuyoprimer suero sea negativo y <strong>el</strong> segundo positivo, en los que presenten positivida<strong>de</strong>n ambas sueros evi<strong>de</strong>nciando un aumento <strong>de</strong> anticuerpos expresado en <strong>el</strong>aumento <strong>de</strong>l porciento <strong>de</strong> inhibición en un 10% ó más <strong>de</strong>l segundo suero conrespecto al primero y aqu<strong>el</strong>los que presenten valores <strong>de</strong>l % <strong>de</strong> inhibición fijos<strong>el</strong>evados <strong>de</strong>l 85% ó más. Estos casos <strong>de</strong>ben ser titu<strong>la</strong>dos <strong>para</strong> confirmarpositividad, expresándose en un aumento <strong>de</strong> 4 veces o más en <strong>el</strong> título <strong>de</strong>anticuerpos <strong>de</strong>l segundo suero con respecto al primero.En monosueros:Se <strong>de</strong>fine como caso probable aqu<strong>el</strong> paciente cuyo suero presente un título <strong>de</strong>Acs.>= 1\5120.Se <strong>de</strong>fine como caso <strong>de</strong> infección secundaria aqu<strong>el</strong> paciente cuyo suero presenteun título <strong>de</strong> Acs.>=1\10240.En pares <strong>de</strong> sueros:Se <strong>de</strong>fine como caso confirmado aqu<strong>el</strong> paciente que presente seroconversión o<strong>el</strong>evación <strong>de</strong> 4 veces <strong>el</strong> título <strong>de</strong> Acs. entre los dos sueros.Se <strong>de</strong>fine como caso <strong>de</strong> infección primaria aqu<strong>el</strong> paciente cuyo segundo sueropresente un título <strong>de</strong> Acs. < 1\5120.
62Referencias1. S. Vázquez , R. Fernán<strong>de</strong>z. Utilización <strong>de</strong> un método <strong>de</strong> Inhibición <strong>de</strong>ELISA en <strong>el</strong> diagnóstico serológico <strong>de</strong> <strong>de</strong>ngue. Rev. Cub. Med. Trop. 41, (1)p. 18-26, 1989.2. R.Fernán<strong>de</strong>z,S.Vázquez Serological diagnosis of <strong>de</strong>ngue by ELISAInhibition Method (EIM) Mem.Inst. Oswaldo Cruz, Rio <strong>de</strong> Janeiro vol 85(3),347-351,1990.3. S.Vázquez,R.Fernán<strong>de</strong>z,C.Llorente Utilidad <strong>de</strong> sangre almacenada enpap<strong>el</strong> <strong>de</strong> filtro <strong>para</strong> estudios serológicos por ELISA <strong>de</strong> Inhibición Inst.Med.Trop.SaoPaulo vol33 No4 309-312, 1991.4. S.Vázquez, J. Bravo, AB Pérez, MG. Guzmán ELISA <strong>de</strong> Inhibición suutilidad <strong>para</strong> c<strong>la</strong>sificar un caso <strong>de</strong> <strong>de</strong>ngue. Rev.Cub. Med. Trop. 49 (2),1997.5. S. Vázquez, J. Bravo, AB Pérez, MG. Guzmán ELISA <strong>de</strong> Inhibición . Unaalternativa en <strong>el</strong> estudio serológico <strong>de</strong> los casos <strong>de</strong> <strong>de</strong>ngue. Bol. Epi<strong>de</strong>m.OPS vol 18, No 2 pag. 7-8, 19976. S, Vázquez, O Valdés, Pupo M, D<strong>el</strong>gado I, Álvarez M, P<strong>el</strong>egrino JL andGuzmán MG. MAC-ELISA and ELISA inhibition methods for <strong>de</strong>tection ofantibodies in Y<strong>el</strong>low fever vaccinated individuals. Vázquez J VirolMethods Jun; 110(2):179-84, 2003.7. S. Vázquez., A.B. Perez, D. Ruiz, R. Rodriguez, M. Pupo, N. Calzada, L.González, D. González, O. Castro, T. Serrano, M.G. Guzmán. Serologicalmarkers during <strong>de</strong>ngue 3 primary and secondary infections. J. Clin. Virol.Vol 33: 132-137,2005.
63ELISA DE CAPTURA DE IgM (CAM- ELISA)En <strong>la</strong> infección primaria por cualquier virus <strong>de</strong>l complejo Dengue se produce unarespuesta <strong>de</strong> anticuerpos <strong>de</strong> <strong>la</strong> c<strong>la</strong>se IgM, los cuales aparecen en niv<strong>el</strong>es<strong>de</strong>tectables una vez finalizada <strong>la</strong> fiebre y <strong>la</strong> viremia, por lo que se recomienda qu<strong>el</strong>as muestras utilizadas <strong>para</strong> <strong>la</strong> <strong>de</strong>terminación <strong>de</strong> este anticuerpo sean extraídas<strong>de</strong>spués <strong>de</strong>l 5to día <strong>de</strong> establecimiento <strong>de</strong> <strong>la</strong> enfermedad.El inmunoensayo enzimático sobre fase sólida (ELISA) ha sido utilizado comométodo <strong>para</strong> <strong>el</strong> diagnóstico serológico en numerosas enfermeda<strong>de</strong>s virales. Uno<strong>de</strong> los métodos aplicados es <strong>el</strong> <strong>de</strong> Captura <strong>de</strong> IgM; utilizado <strong>para</strong> <strong>de</strong>mostrarinfecciones actuales o recientes. Para <strong>el</strong>lo se emplean Igs anti-IgM humanas <strong>la</strong>scuales se fijan a <strong>la</strong> p<strong>la</strong>ca.La <strong>de</strong>tección <strong>de</strong> anticuerpos IgM al virus Dengue resulta <strong>de</strong> extrema utilidadtanto en <strong>el</strong> diagnóstico <strong>de</strong> casos clínicamente sospechosos como en los sistemas<strong>de</strong> vigi<strong>la</strong>ncia epi<strong>de</strong>miológica <strong>para</strong> esta enfermedad.Gubler <strong>de</strong>scribió un método ELISA <strong>de</strong> captura <strong>de</strong> IgM <strong>para</strong> <strong>la</strong> vigi<strong>la</strong>ncia <strong>de</strong>lDengue y Dengue Hemorrágico. Comparó los resultados <strong>de</strong>l estudio con <strong>la</strong> IHencontrando una buena sensibilidad y una especificidad muy semejante a <strong>la</strong> <strong>de</strong>esta técnica, p<strong>la</strong>nteando que dicho método es rápido <strong>para</strong> <strong>de</strong>terminar infecciones<strong>de</strong> Dengue en casos hospitalizados <strong>de</strong> áreas endémicas, siendo aun más útil en <strong>la</strong>vigi<strong>la</strong>ncia en áreas no endémicas ya que se pue<strong>de</strong> estar seguro que cualquier casopositivo indica infección reciente. Es <strong>de</strong> seña<strong>la</strong>r que se requiere una so<strong>la</strong> muestra<strong>para</strong> realizar <strong>el</strong> diagnóstico.ELISA DE CAPTURAANTI-IgMconjugado anti-virusantígenoIgM (suero <strong>de</strong>l paciente)anti IgMsoporte sólido
64Materiales:‣ Buffer fosfato-salina (PBS) pH 7,4:NaCl 8 gKCl 0,2 gKH 2PO 4 0,14 gNa 2HPO 4 0,91 gCompletar con agua <strong>de</strong>sti<strong>la</strong>da hasta 1L.‣ Buffer carbonato/bicarbonato pH 9,6:Na 2CO 3 1,59 gNaHCO 3 2,39 gCompletar con agua <strong>de</strong>sti<strong>la</strong>da hasta 1L.‣ Inmunoglobulinas anti-IgM humana purificada por cromatografía <strong>de</strong> afinidad(SIGMA).‣ Albúmina bovina sérica fracción V (ABS)‣ Antígeno <strong>de</strong> complejo Dengue obtenido por <strong>el</strong> método <strong>de</strong> sacarosa-acetona(ver técnica IH).‣ Suero humano negativo <strong>de</strong> anticuerpos a virus <strong>de</strong>ngue (SNH).‣ Conjugado anti-<strong>de</strong>ngue peroxidasa (ver método <strong>de</strong> conjugación)‣ Buffer fosfato-citrato pH 5 (ver ELISA <strong>de</strong> Inhibición)‣ OPD (ver ELISA <strong>de</strong> Inhibición)‣ Peróxido <strong>de</strong> hidrógeno o urea peróxido (ver ELISA <strong>de</strong> Inhibición)‣ Sustrato (ver ELISA <strong>de</strong> Inhibición)Método:1. A una p<strong>la</strong>ca (maxisorb) se le agrega 100uL por pozo <strong>de</strong> Igs anti- IgM humanasa una concentración <strong>de</strong> 5ug/mL en buffer <strong>de</strong> recubrimiento (coatting); estevalor se <strong>de</strong>termina probando <strong>el</strong> sistema con varias concentraciones <strong>de</strong> Igsgeneralmente entre 0,1 y 10 ug/mL obteniéndose <strong>la</strong> concentración <strong>de</strong>saturación que se i<strong>de</strong>ntifica al no presentarse incremento <strong>de</strong>l valor <strong>de</strong> DO apartir <strong>de</strong> esa dilución. La p<strong>la</strong>ca es colocada a 4 o C toda <strong>la</strong> noche.2. Lavar 5 veces con PBS.3. Añadir 150uL por pozo <strong>de</strong> ABS al 4% en buffer <strong>de</strong> recubrimiento (coatting) por30 minutos a 37 o C. Se requiere un total <strong>de</strong> 15 mL por p<strong>la</strong>ca.
654. Lavar 5 veces con PBS.5. Agregar los sueros a probar diluidos 1/20 en PBS-ABS al 0.5%. 50uL porpozo. Se <strong>de</strong>ben incluir sueros positivos y sueros negativos como controlesdiluidos también 1/20.6. Lavar 5 veces con PBS.7. Añadir <strong>el</strong> antígeno pre<strong>para</strong>do <strong>para</strong> 16 UH (esto se calcu<strong>la</strong> en función <strong>de</strong>l títulohemaglutinante y se necesita 5 ml por p<strong>la</strong>ca) 50uL por pozo. Este antígeno sepre<strong>para</strong> en PBS-SNH al 5%. Colocar <strong>la</strong> p<strong>la</strong>ca a 4 o C toda <strong>la</strong> noche. (Se incluy<strong>el</strong>os 4 serotipos)8. Lavar 5 veces con PBS.9. Agregar conjugado anti-<strong>de</strong>ngue peroxidasa diluido en PBS-SNH al 5%, 50uLpor pozo y se incuba 1 hora a 37 o C. La dilucion <strong>de</strong>l conjugado (1/2500) secalculó realizando varias diluciones y se tomó aqu<strong>el</strong><strong>la</strong> que establecíadiferencia entre <strong>el</strong> control positivo y <strong>el</strong> negativo <strong>de</strong> 5 veces o más.10. Lavar 7 veces con PBS.11. Agregar <strong>el</strong> sustrato 100 uL por pozo. Mantener <strong>la</strong> reacción durante 30minutos su cámara a temperatura ambiente y <strong>de</strong>tener con100 µL por pozo <strong>de</strong>ácido sulfúrico al 12.5%.12. Leer <strong>la</strong> p<strong>la</strong>ca en un lector <strong>de</strong> ELISA a 492nm.Cálculo <strong>de</strong> los resultadosDeterminar <strong>la</strong> media geométrica <strong>de</strong> <strong>la</strong>s DO <strong>de</strong> los controles negativos y multiplicarpor 2. Toda muestra que tenga un valor mayor o igual al calcu<strong>la</strong>do será positiva.El negativo <strong>de</strong>be incluirse varias veces <strong>para</strong> po<strong>de</strong>r hacer <strong>el</strong> cálculo, a<strong>de</strong>más <strong>de</strong>beprobarse <strong>la</strong> vali<strong>de</strong>z <strong>de</strong>l ensayo dividiendo DOpositivo/DOnegativo y dicho valor<strong>de</strong>be ser mayor o igual que 5.Otras aplicaciones <strong>de</strong>l ELISA <strong>de</strong> capturaEsta técnica pue<strong>de</strong> ser utilizada <strong>para</strong> <strong>la</strong> <strong>de</strong>tección <strong>de</strong> anticuerpos IgA e IgE. Seemplea <strong>el</strong> mismo principio y los mismos reactivos excepto <strong>la</strong>s Igs anti-IgA e anti-IgE que sustituyen a <strong>la</strong>s Igs anti-IgM.
66Muestras <strong>de</strong> sangre en pap<strong>el</strong> <strong>de</strong> filtroDeterminación <strong>de</strong> <strong>la</strong> presencia <strong>de</strong> anticuerpos IgM en muestras <strong>de</strong> sangre totalcapi<strong>la</strong>r tomadas en pap<strong>el</strong> <strong>de</strong> filtro (Blood Sampling Paper, NOBUTO, Toyo RoshiKaisha, Ltd. Japón): Para <strong>la</strong> toma <strong>de</strong> sangre total capi<strong>la</strong>r, se punciona con <strong>la</strong>ncetaestéril <strong>el</strong> pulpejo <strong>de</strong>l <strong>de</strong>do índice <strong>de</strong>jando absorber <strong>la</strong> sangre sobre <strong>el</strong> pap<strong>el</strong> <strong>de</strong>filtro hasta que <strong>el</strong> mismo estuvo totalmente impregnado por ambos <strong>la</strong>dos.Previamente, cada pap<strong>el</strong> <strong>de</strong> filtro <strong>de</strong>be ser rotu<strong>la</strong>do en <strong>la</strong> zona B utilizando grafito.Después que <strong>la</strong> sangre es totalmente absorbida sobre <strong>el</strong> pap<strong>el</strong>, esta se <strong>de</strong>ja secara temperatura ambiente en posición vertical, con <strong>la</strong> zona B hacia abajo.Posteriormente, se guardan en sobres preferiblemente a 4 0 C.FIGURA 1: PAPEL EMPLEADO EN EL ESTUDIO, SEÑALANDOSE LAS ZONASA (ABSORCION DE SANGRE) Y B (IDENTIFICACION).AB5 mm 10 mm30 mm 18 mmProcesamientoLas muestras <strong>de</strong> sangre total capi<strong>la</strong>r colectadas en pap<strong>el</strong> <strong>de</strong> filtro son <strong>el</strong>uídasdurante toda <strong>la</strong> noche a 4 o C en 400uL <strong>de</strong> solución fosfato-salina (PBS)conteniendo albúmina bovina al 0,5% (correspondiente a una dilución <strong>de</strong> suero<strong>de</strong> 1/10). Posteriomente, a cada muestra se le <strong>de</strong>termina <strong>la</strong> presencia <strong>de</strong>anticuerpos IgM a virus <strong>de</strong>ngue en forma simi<strong>la</strong>r a como se procesan los sueros.
67Referencias1. S. Vázquez., A.B. Perez, D. Ruiz, R. Rodriguez, M. Pupo, N. Calzada, L.González, D. González, O. Castro, T. Serrano, M.G. Guzmán. Serologicalmarkers during <strong>de</strong>ngue 3 primary and secondary infections. J. Clin. Virol.33: 132-137,2005.2. S. Vázquez, MG. Guzman y col. Detección <strong>de</strong> IgM contra virus <strong>de</strong>l <strong>de</strong>ngueen sangre total absorbida en pap<strong>el</strong> <strong>de</strong> filtro. Rev. Pan. Salud Pub. Pan. Am.J. Pub. Health. 3(3), 1998.
68"Kit Diagnóstico": Dengue* IgMEl "kit Diagnóstico Dengue* IgM se conformó <strong>para</strong> realizar un total <strong>de</strong> 180<strong>de</strong>terminaciones, ya sea en p<strong>la</strong>cas completas o en grupos <strong>de</strong> 4 tiras <strong>de</strong>smontables,siendo los componentes <strong>de</strong>l sistema los siguientes:♦ 2 P<strong>la</strong>cas <strong>de</strong> poliestireno sensibilizadas con anti-IgM♦ 1 Frasco <strong>de</strong> diluyente <strong>de</strong> muestra 25X (3mL)♦ 2 frascos <strong>de</strong> control positivo (1mL c/u) y 2 <strong>de</strong> negativo (1.5mL c/u) listos <strong>para</strong>usar.♦ 1 frasco <strong>de</strong> solución <strong>de</strong> <strong>la</strong>vado 25X (100mL)♦ 1 frasco <strong>de</strong> suero humano negativo (2mL)♦ 6 frascos <strong>de</strong> antígeno inactivado liofilizado conteniendo los 4 serotipos (2mLc/u).♦ 1 frascos <strong>de</strong> conjugado prediluído.♦ 6 frascos <strong>de</strong> sustrato liofilizado (5mL c/u)♦ 1 frasco <strong>de</strong> peróxido <strong>de</strong> hidrógeno (200uL)El antígeno <strong>de</strong> <strong>de</strong>ngue, los controles positivos y negativos y <strong>el</strong> suero humanonegativo (SHN) están inactivados. Los controles y <strong>el</strong> suero humano negativo son “noreactivos” <strong>para</strong> los virus VIH 1 y 2, y <strong>para</strong> HBAgs. No obstante, <strong>de</strong>ben manejarsecon precaución.Procedimiento:1. Retirar <strong>de</strong>l estuche <strong>la</strong>s p<strong>la</strong>cas o tiras a utilizar según <strong>el</strong> número <strong>de</strong> muestras aprocesar. Se recomienda confeccionar un esquema <strong>de</strong> trabajo i<strong>de</strong>ntificandocorrectamente <strong>la</strong> posición <strong>de</strong> cada muestra y los controles.2. Dispensar 50 uL <strong>de</strong>l diluyente <strong>de</strong> muestra 1X en todos los pocillos con excepción<strong>de</strong> los pocillos <strong>para</strong> los controles positivos y negativos. Añada entonces siguiendo<strong>el</strong> esquema <strong>de</strong> distribución 2,5 uL <strong>de</strong> cada suero, agitando ligeramente <strong>la</strong> p<strong>la</strong>ca<strong>para</strong> homogenizar <strong>la</strong> dilución. Se recomienda utilizar no menos <strong>de</strong> 2 pocillos<strong>para</strong> <strong>el</strong> control positivo y 4 <strong>para</strong> <strong>el</strong> negativo.3. Incubar en cámara húmeda 2 horas a temperatura ambiente.
694. Lavar <strong>la</strong> p<strong>la</strong>ca 5 veces con <strong>la</strong> solución <strong>de</strong> <strong>la</strong>vado 1x, utilizando un volumen <strong>de</strong>250-300 uL por pozo. Si se dispone <strong>de</strong> <strong>la</strong>vador automático seguir simi<strong>la</strong>rprocedimiento. Secar <strong>la</strong> p<strong>la</strong>ca invirtiéndo<strong>la</strong> sobre pap<strong>el</strong> <strong>de</strong> filtro.5. Dispensar 50 ul <strong>de</strong> antígeno por pozo, reconstituido previamente con 2 mL <strong>de</strong>solución <strong>de</strong> <strong>la</strong>vado conteniendo SHN al 5%. Incubar a 4 o C durante toda <strong>la</strong>noche.6. Lavar 5 veces con solución <strong>de</strong> <strong>la</strong>vado como en <strong>el</strong> punto 4.7. Dispensar 50 uL por pozo <strong>de</strong>l conjugado previamente diluido (80uL <strong>de</strong>conjugado + 100uL <strong>de</strong> SNH + 1.82mL <strong>de</strong> PBS). Incubar 1 hora a 37 o C encámara húmeda.8. Lavar 7 veces con solución <strong>de</strong> <strong>la</strong>vado como en <strong>el</strong> punto 4.9. Añadir 100 uL <strong>de</strong>l sustrato reconstituido previamente con 5 mL <strong>de</strong> agua<strong>de</strong>sti<strong>la</strong>da, adicionando 2 uL <strong>de</strong> peróxido <strong>de</strong> hidrógeno. Incubar 30 minutos atemperatura ambiente en oscuridad.10. Detener <strong>la</strong> reacción adicionando 100 uL por pozo <strong>de</strong> <strong>la</strong> solución <strong>de</strong> ácidosulfúrico al 12,5% en <strong>el</strong> mismo sentido en que se añadió <strong>el</strong> sustrato.11. Realizar <strong>la</strong> lectura <strong>de</strong> <strong>la</strong> <strong>de</strong>nsidad óptica utilizando un filtro <strong>de</strong> 492 nm yajustando b<strong>la</strong>nco con <strong>el</strong> aire.Cálculo <strong>de</strong> los resultados:1. Calcu<strong>la</strong>r <strong>la</strong> media <strong>de</strong> <strong>la</strong> <strong>de</strong>nsidad óptica <strong>de</strong> los controles negativos (Xn)2. Calcu<strong>la</strong>r <strong>la</strong> media <strong>de</strong> <strong>la</strong> <strong>de</strong>nsidad óptica <strong>de</strong> los controles positivos (Xp)Vali<strong>de</strong>z <strong>de</strong> <strong>la</strong> prueba: Xp>5Xn;Valor limite = 2XnEl valor <strong>de</strong> corte se establece en función <strong>de</strong> <strong>la</strong> media <strong>de</strong>l control negativoconsi<strong>de</strong>rando como positivos aqu<strong>el</strong>los sueros que presenten un valor <strong>de</strong> <strong>de</strong>nsidadóptica mayor o igual a dos veces <strong>la</strong> media <strong>de</strong>l negativo. La vali<strong>de</strong>z <strong>de</strong>l sistema seestablece por <strong>la</strong> r<strong>el</strong>ación <strong>de</strong> <strong>la</strong> media <strong>de</strong> los positivos y los negativos <strong>la</strong> cual <strong>de</strong>be serigual o mayor <strong>de</strong> 5.
70IMPORTANTE: Un resultado negativo a <strong>la</strong> presencia <strong>de</strong> IgM contra <strong>de</strong>ngue noexcluye <strong>la</strong> posibilidad <strong>de</strong> exposición anterior a este virus por lo que en caso <strong>de</strong>síntomas clínicos compatibles, se recomienda probar una nueva muestra variosdías <strong>de</strong>spués.Almacenaje y Estabilidad:Cuando no se encuentran en uso, los reactivos <strong>de</strong>ben almacenarse a unatemperatura <strong>de</strong> 2 a 8 o C. Los reactivos y p<strong>la</strong>cas así conservadas tendrán unaestabilidad garantizada durante 6 meses. Verifique <strong>la</strong> fecha <strong>de</strong> expiración reflejadaen <strong>la</strong>s etiquetas antes utilizar <strong>el</strong> Kit.Medidas <strong>de</strong> Bioseguridad:Al manipu<strong>la</strong>r sueros humanos <strong>para</strong> su testaje mediante <strong>la</strong> prueba <strong>de</strong>ben observars<strong>el</strong>as precauciones requeridas <strong>para</strong> evitar infecciones por <strong>el</strong> virus <strong>de</strong> <strong>la</strong>Inmuno<strong>de</strong>ficiencia humana (VIH), Hepatitis B u otros agentes simi<strong>la</strong>res.
71SISTEMA ULTRA MICRO ELISA PARA LA DETECCIÓN DEAcs Ig M AL VIRUS DENGUE (UMELISA-DENGUE)El UMELISA-DENGUE es un análisis inmunoenzimático heterogéneo, en suvariante <strong>de</strong> captura, en <strong>el</strong> cual se utiliza como fase sólida una p<strong>la</strong>ca <strong>de</strong>ultramicroELISA (10 microlitros por pocillo) revestida previamente conanticuerpos contra IgM humana.Las muestras se incuban por duplicado en los pocillos <strong>de</strong> <strong>la</strong> p<strong>la</strong>ca y <strong>la</strong> IgMpresente en <strong>el</strong> suero se fijará a los anticuerpos <strong>de</strong> recubrimiento. A continuación,previo <strong>la</strong>vado que <strong>el</strong>imina los componentes no fijados, se aña<strong>de</strong> <strong>el</strong> antígenoespecífico <strong>de</strong> Dengue (los 4 serotipos); seguido nuevamente <strong>de</strong> incubación y<strong>la</strong>vado. A continuación se aña<strong>de</strong> un anticuerpo monoclonal <strong>de</strong> ratón contra virusDengue conjugado con fosfatasa alcalina. En caso <strong>de</strong> reacción positiva, esteanticuerpo marcado se unirá al complejo formado previamente sobre <strong>la</strong> fasesólida. Un nuevo <strong>la</strong>vado <strong>de</strong> <strong>la</strong> p<strong>la</strong>ca <strong>el</strong>iminará <strong>el</strong> conjugado en exceso. Al añadirseun sustrato fluorigénico, este será hidrolizado y <strong>la</strong> fluorescencia emitida permitirá<strong>de</strong>tectar <strong>la</strong> presencia <strong>de</strong> anticuerpos IgM específicos contra <strong>el</strong> virus Dengue.El sistema UMELISA-DENGUE esta compuesto por los siguientes <strong>el</strong>ementos:‣ Lector SUMA‣ Paquete <strong>de</strong> Programas UMELISA-DENGUE‣ Multipipeta ERIZO‣ Juego <strong>de</strong> accesorios <strong>de</strong> <strong><strong>la</strong>boratorio</strong> SUMALa técnica <strong>de</strong>tal<strong>la</strong>da aparece en <strong>el</strong> prospecto adjunto al Kit Comercial"UMELISA-DENGUE" <strong>para</strong> <strong>la</strong> <strong>de</strong>tección <strong>de</strong> anticuerpos IgM al virus Dengue
72AuBioDOT IgM anti-Dengue96 pruebasSistema diagnóstico visual <strong>para</strong> <strong>la</strong> <strong>de</strong>tección <strong>de</strong> anticuerpos IgM contra <strong>el</strong> virus <strong>de</strong>lDengue basado en <strong>el</strong> uso <strong>de</strong> anticuerpos monoclonalesCARACTERISTICAS PRINCIPALESEl AuBioDOT IgM anti-Dengue es un inmunoensayo que usa un anticuerpo monoclonal conjugado conoro coloidal y amplificación con rev<strong>el</strong>adores <strong>de</strong> p<strong>la</strong>ta, <strong>para</strong> <strong>la</strong> <strong>de</strong>tección en suero <strong>de</strong> anticuerpos IgM contra <strong>el</strong>virus <strong>de</strong>l Dengue (IgM anti-Dengue) en pacientes con 5 o más días <strong>de</strong> evolución <strong>de</strong> <strong>la</strong> enfermedad.El sistema emplea anticuerpos y antígenos que aseguran una buena sensibilidad y especificidad <strong>de</strong>l sistema,según estudios realizados con pan<strong>el</strong>es <strong>de</strong> muestras positivas y negativas, caracterizadas mediante técnicasinmunoenzimáticas.El AuBioDOT IgM anti-Dengue es un sistema especialmente <strong>de</strong>sarrol<strong>la</strong>do <strong>para</strong> <strong>la</strong> operación manual ylectura visual <strong>de</strong> los resultados, por lo que su empleo es recomendable <strong>para</strong>:• El diagnóstico serológico <strong>de</strong> infección por <strong>el</strong> virus Dengue en diferentes niv<strong>el</strong>es <strong>de</strong> salud que realicen unavigi<strong>la</strong>ncia activa, principalmente en áreas con condiciones mínimas <strong>de</strong> <strong><strong>la</strong>boratorio</strong>• Para <strong>el</strong> diagnóstico rápido a virus <strong>de</strong>ngue en caso <strong>de</strong> brotes y/o epi<strong>de</strong>mias.PRINCIPIO DEL METODOEl inmunoensayo consiste en <strong>el</strong> uso <strong>de</strong> soportes <strong>de</strong> poliestireno b<strong>la</strong>nco opaco con excavaciones circu<strong>la</strong>res,sensibilizadas con un anticuerpo IgG que tiene s<strong>el</strong>ectividad por anticuerpos <strong>de</strong>l tipo IgM humanos.Las muestras son incubadas en dichasexcavaciones y los anticuerpos IgMpresentes en <strong>la</strong> muestra se fijaran a <strong>la</strong> fasesólida.. Después <strong>de</strong>l <strong>la</strong>vado <strong>de</strong>l exceso <strong>de</strong>los reactivos, se aña<strong>de</strong> una pre<strong>para</strong>ción <strong>de</strong> 4antígenos <strong>de</strong> <strong>de</strong>ngue los cuales seránreconocidos específicamente por losanticuerpos IgM <strong>de</strong> los individuos enfermosDespués <strong>de</strong>l <strong>la</strong>vado <strong>de</strong>l exceso <strong>de</strong> losreactivos, se aña<strong>de</strong> un anticuerpo conjugadocon oro coloidal dirigido contra losantígenos. Después <strong>de</strong> <strong>la</strong> incubación <strong>la</strong>s tirasson <strong>la</strong>vadas y <strong>la</strong> reacción es finalmenteamplificada por <strong>la</strong> adición <strong>de</strong> rev<strong>el</strong>adoresfísicos basados en iones <strong>de</strong> p<strong>la</strong>ta,produciéndose in situ reacciones coloreadasinsolubles <strong>de</strong> color pardo c<strong>la</strong>ro a oscuro,cuya intensidad es proporcional a <strong>la</strong>concentración <strong>de</strong> anticuerpos presentes en<strong>la</strong>s muestras.La lectura se realizará directamente enlos pocillos <strong>de</strong> <strong>la</strong>s p<strong>la</strong>cas mediantesimple inspección visual y <strong>la</strong>s mismaspue<strong>de</strong>n ser archivadas <strong>para</strong> <strong>el</strong> registropermanente <strong>de</strong> los resultados.Fase sólidasensibilizada+Anticuerpo inmovilizadoen <strong>la</strong> fase sólidaAntígeno inmovilizadoen <strong>la</strong> fase sólidaI.- Incubación con <strong>la</strong>s muestrasAnticuerpos IgM+15 minTemperatura AmbienteIII.- Inmunotinción con oro coloidalAcM anti antígenoconjugadoComplejo anticuerpos-antígenos-AcM anti antígeno conjugadoIones <strong>de</strong> p<strong>la</strong>taII.- Incubación con los antígenos+Antígenos15 minTemperatura Ambiente15 minT emperatura AmbienteIV.- Amplificación con p<strong>la</strong>ta10 minTemperatura AmbienteAnticuerpo inmovilizadoen <strong>la</strong> fase sólidaAntígeno inmovilizadoen <strong>la</strong> fase sólidaComplejo anticuerpos-antígenos-AcM anti antígeno conjugadoSeñal amplificada por <strong>de</strong>posición<strong>de</strong> p<strong>la</strong>ta metálica
73PRESENTACIÓNSistema <strong>para</strong> 96 <strong>de</strong>terminaciones cualitativas, compuesto por:‣ 1 bolsa metálica conteniendo una p<strong>la</strong>ca <strong>de</strong> poliestireno b<strong>la</strong>nco opaco sensibilizada con un anticuerpomonoclonal. Cada p<strong>la</strong>ca pue<strong>de</strong> dividirse en tiras <strong>de</strong> 8 <strong>de</strong>terminaciones.‣ 1 frasco con 3 mL <strong>de</strong> tampón <strong>de</strong> dilución <strong>de</strong>l conjugado.‣ 1 frasco con 0,3 mL <strong>de</strong>l Conjugado <strong>de</strong>l anticuerpo monoclonal - oro coloidal. Este frasco contieneconjugado líquido <strong>para</strong> diluir 10 veces con tampón <strong>de</strong> dilución <strong>de</strong>l conjugado.‣ 6 bulbos con <strong>la</strong> mezc<strong>la</strong> <strong>de</strong> antígenos liofilizados‣ 1 frasco (rótulo negro) con 1,4 mL <strong>de</strong> Solución Amplificadora (reactivo A <strong>de</strong>l rev<strong>el</strong>ador físico).‣ 1 frasco (rótulo b<strong>la</strong>nco) con 1,4 mL <strong>de</strong> Solución Iniciadora (reactivo B <strong>de</strong>l rev<strong>el</strong>ador físico).‣ 1 frasco con 0,3 mL <strong>de</strong> Suero <strong>de</strong> Control Negativo listo <strong>para</strong> usar no reactivo <strong>para</strong> IgM anti-Dengue,AgsHB, anti HCV, anti HIV, VDRL.‣ 1 frasco con 0,3 mL <strong>de</strong> Suero <strong>de</strong> Control Positivo listo <strong>para</strong> usar (inactivado por calor, no reactivo <strong>para</strong>AgsHB, HCV, anti HIV, VDRL).‣ 1 plástico con 9,55 g <strong>de</strong> Sales mezc<strong>la</strong>das, en cantidad <strong>para</strong> reconstituir tampón <strong>de</strong> <strong>la</strong>vado PBS en 500 mL <strong>de</strong>agua <strong>de</strong>sti<strong>la</strong>da. La solución tampón contiene azida <strong>de</strong> sodio como preservativo.‣ 1 vial con 0,5 mL <strong>de</strong> Tween-20.MATERIALES ADICIONALES REQUERIDOS• Agua <strong>de</strong>sti<strong>la</strong>da <strong>para</strong> <strong>la</strong> reconstitución <strong>de</strong>l Tampón <strong>de</strong> <strong>la</strong>vado.• Micropipetas automáticas y puntas <strong>de</strong>sechables <strong>para</strong> dispensar volúmenes <strong>de</strong> 20; 100; 500 µLrespectivamente.• Pap<strong>el</strong> <strong>de</strong> filtro <strong>para</strong> <strong>el</strong> secado <strong>de</strong> <strong>la</strong>s tiras.• Viales o tubos <strong>para</strong> pre<strong>para</strong>r <strong>el</strong> volumen exacto <strong>de</strong>l rev<strong>el</strong>ador físico a utilizar.ALMACENAMIENTO Y ESTABILIDADLos componentes <strong>de</strong>l sistema AuBioDOT IgM anti-Dengue en su forma original <strong>de</strong> presentación,mantienen <strong>la</strong> estabilidad hasta <strong>la</strong> fecha <strong>de</strong> vencimiento impresa en <strong>el</strong> envase, si son <strong>de</strong>bidamente conservados<strong>de</strong> 2 a 8 0 C.No cong<strong>el</strong>ar ninguno <strong>de</strong> los componentes. Mantener <strong>la</strong>s p<strong>la</strong>cas <strong>de</strong> poliestireno bien cerradas todo <strong>el</strong> tiempo yjunto a <strong>la</strong> bolsa <strong>de</strong> g<strong>el</strong> <strong>de</strong> sílice. Antes <strong>de</strong> comenzar <strong>la</strong> prueba <strong>de</strong>je que los reactivos alcancen <strong>la</strong> temperaturaambiente <strong>para</strong> evitar <strong>la</strong> con<strong>de</strong>nsación.El conjugado reconstituído mantiene <strong>la</strong> máxima actividad biológica hasta 30 días, si es conservado <strong>de</strong> 2 a 80 C .PRECAUCIONES Y RECOMENDACIONES• Evite tocar con los <strong>de</strong>dos los pocillos <strong>de</strong> <strong>la</strong>s p<strong>la</strong>cas. Todos los componentes <strong>de</strong> <strong>la</strong> sangre y materialesbiológicos <strong>de</strong>ben ser consi<strong>de</strong>rados como potencialmente infecciosos, por lo que <strong>de</strong>be tomarse precaucióndurante <strong>la</strong> manipu<strong>la</strong>ción <strong>de</strong> los mismos. Es recomendable usar guantes durante <strong>la</strong> realización <strong>de</strong> <strong>la</strong> prueba.• Las muestras <strong>de</strong>ben ser frescas y estar libres <strong>de</strong> partícu<strong>la</strong>s extrañas y contaminantes por lo que se aconsejaprevia centrifugación. Evite <strong>la</strong> contaminación entre los reactivos usando puntas diferentes <strong>para</strong> cada uno.• Si se <strong>de</strong>sean archivar <strong>la</strong>s tiras plásticas o <strong>la</strong>s p<strong>la</strong>cas como registro permanente <strong>de</strong> los resultados, serecomienda una inmersión previa <strong>de</strong> <strong>la</strong>s mismas en una solución alcohólica al 70 % .• No mezcle los reactivos <strong>de</strong> diferentes lotes y no utilice reactivos vencidos.• La azida pue<strong>de</strong> reaccionar con <strong>el</strong> cobre o <strong>el</strong> plomo utilizado en <strong>de</strong>terminadas tuberías y formar salesexplosivas. Aunque <strong>la</strong>s cantida<strong>de</strong>s utilizadas en este juego son pequeñas, cuando se <strong>de</strong>seche material quecontenga azida <strong>de</strong>ber <strong>el</strong>iminarse con abundante agua.INSTRUCCIONES PARA EL USOA) PREPARACION DE REACTIVOS:• P<strong>la</strong>cas sensibilizadas: Evitar <strong>el</strong> contacto <strong>de</strong> los <strong>de</strong>dos con <strong>la</strong>s áreas circu<strong>la</strong>res sensibilizadas con <strong>el</strong>anticuerpo.
74• Conjugado Anticuerpo monoclonal - oro coloidal: En <strong>de</strong>pen<strong>de</strong>ncia <strong>de</strong>l número <strong>de</strong> muestras a estudiar<strong>de</strong>berá hacerse una dilución previa <strong>de</strong> 1/10 <strong>de</strong>l conjugado 10X en tampón <strong>de</strong> dilución <strong>de</strong>l conjugado.No. <strong>de</strong> ensayos Vol. <strong>de</strong> conjugado (µl) Vol. <strong>de</strong> diluente (µl)16 35 31524 50 4548 100 90072 150 135096 200 1800• Tampón <strong>de</strong> <strong>la</strong>vado: Pre<strong>para</strong>r <strong>el</strong> tampón PBS - Tween 20, mediante disolución <strong>de</strong> <strong>la</strong>s sales contenidas en <strong>el</strong>frasco <strong>de</strong> Sales Mezc<strong>la</strong>das en 500 mL <strong>de</strong> agua <strong>de</strong>sti<strong>la</strong>da. Adicionar posteriormente <strong>el</strong> reactivo Tween-20,enjuagando repetidas veces <strong>el</strong> vial hasta <strong>la</strong> completa disolución <strong>de</strong>l contenido. Conservar <strong>de</strong> 2 a 8°C hasta suuso.• Muestras: Se utilizarán muestras frescas, puras y previamente centrifugadas.• Antígenos: Reconstituir <strong>el</strong> bulbo en 0,4mL <strong>de</strong> agua <strong>de</strong>sti<strong>la</strong>da. Después <strong>de</strong> reconstituida <strong>la</strong> pre<strong>para</strong>ciónantigénica queda lista <strong>para</strong> ser usada.• Rev<strong>el</strong>ador: El volumen exacto <strong>de</strong> rev<strong>el</strong>ador físico <strong>de</strong>be ser pre<strong>para</strong>do al momento <strong>de</strong> su empleo, en <strong>el</strong> paso<strong>de</strong> <strong>la</strong> amplificación argéntica <strong>de</strong> <strong>la</strong> reacción. La pre<strong>para</strong>ción <strong>de</strong>l rev<strong>el</strong>ador <strong>de</strong>berá hacerse en un tubo limpio yse <strong>de</strong>ben usar puntas plásticas diferentes <strong>para</strong> cada solución.No. <strong>de</strong> ensayos Vol. <strong>de</strong> solución A (µl) Vol. <strong>de</strong> solución B (µl)16 170 17024 250 25048 500 50072 730 73096 1000 1000B) PROCEDIMIENTO1.- PRELAVADO DE LAS LÁMINAS.Sumerja <strong>la</strong>s p<strong>la</strong>cas a utilizar en tampón <strong>de</strong> <strong>la</strong>vado por 5 min, <strong>para</strong> <strong>el</strong>iminar <strong>el</strong> preservativo.2.- INCUBACION DE LAS MUESTRAS.Colocar 20 µL <strong>de</strong> <strong>la</strong>s muestras y los controles sobre <strong>la</strong>s correspondientes áreas <strong>de</strong> reacción. Incubardurante 15 min a temperatura ambiente y en cámara húmeda.3.- LAVADO.Eliminar previamente <strong>el</strong> exceso <strong>de</strong> reactivos mediante abundante goteo o enjuague directo <strong>de</strong> <strong>la</strong>s p<strong>la</strong>cascon agua. Transferir <strong>la</strong>s mismas a un recipiente a<strong>de</strong>cuado que contenga <strong>la</strong> solución <strong>de</strong> <strong>la</strong>vado, <strong>para</strong>continuar <strong>el</strong> <strong>la</strong>vado durante 5 min a temperatura ambiente, o hacer cuatro <strong>la</strong>vados usando un frasco<strong>la</strong>vador. Eliminar <strong>el</strong> exceso <strong>de</strong> líquido invirtiendo y golpeando <strong>la</strong> p<strong>la</strong>ca ligeramente contra un pap<strong>el</strong> <strong>de</strong>filtro, evitando <strong>el</strong> contacto con <strong>la</strong>s áreas <strong>de</strong> reacción.4.- INCUBACION CON LOS ANTIGENOSColocar 20 µL <strong>de</strong> los antígenos sobre <strong>la</strong>s correspondientes áreas <strong>de</strong> reacción. Incubar durante 15 min atemperatura ambiente y en cámara húmeda.6.- LAVADO.Repetir <strong>la</strong>s operaciones <strong>de</strong> <strong>la</strong>vado como en <strong>el</strong> paso 3.7.- INMUNOTINCIÓN.Colocar 20 µL <strong>de</strong>l conjugado diluído sobre cada área <strong>de</strong> reacción e incubar durante 15 min a temperaturaambiente y en cámara húmeda.8.- LAVADO.Repetir <strong>la</strong>s operaciones <strong>de</strong> <strong>la</strong>vado como en <strong>el</strong> paso 3.9.- AMPLIFICACION ARGENTICA.Depositar 20 µL <strong>de</strong> <strong>la</strong> mezc<strong>la</strong> rev<strong>el</strong>adora. Incubar durante 10 min (temperatura ambiente y cámara húmeda).10.- LAVADO.Eliminar <strong>el</strong> exceso <strong>de</strong> reactivos mediante suficiente goteo o enjuague directo <strong>de</strong> <strong>la</strong>s p<strong>la</strong>cas con agua <strong>de</strong>sti<strong>la</strong>da.
75INTERPRETACION DE LOS RESULTADOSLos resultados son interpretados directamente por simple inspección visual sobre <strong>la</strong>s áreas <strong>de</strong> reacción.La muestra se consi<strong>de</strong>ra REACTIVA cuando se produce in situ una coloración pardo c<strong>la</strong>ro a oscuro, queabarca toda <strong>el</strong> área circu<strong>la</strong>r <strong>de</strong> reacción. La intensidad <strong>de</strong> <strong>la</strong> coloración <strong>de</strong>pen<strong>de</strong>rá <strong>de</strong> <strong>la</strong> concentración <strong>de</strong>anticuerpos presentes en <strong>la</strong>s muestras.La muestra se consi<strong>de</strong>ra NEGATIVA cuando no evi<strong>de</strong>ncia señales <strong>de</strong> coloración respecto a <strong>la</strong> textura b<strong>la</strong>nca<strong>de</strong> <strong>la</strong> superficie sólida. Si alguna muestra presenta efectos muy débiles <strong>de</strong> coloración <strong>de</strong> fondo, <strong>la</strong> intensidad<strong>de</strong> <strong>la</strong> misma, visualmente com<strong>para</strong>da, <strong>de</strong>be ser igual o menor al control negativo correspondiente. Paramuestras con resultados dudosos, se recomienda repetir <strong>la</strong> prueba con otro suero <strong>de</strong>l paciente con más días <strong>de</strong>evolución <strong>de</strong> <strong>la</strong> enfermedad.BIBLIOGRAFIA1. Sánchez Vizcaino, JM. Técnicas inmunoenzimáticas en patología animal y vegetal. Madrid 1981.2. Peterson D L., Nath N., Gavi<strong>la</strong>ns F. Structure of Hepatitis B Surface Antigen. J. of Biol. Chem. Vol. 257 pp10 414-10 420, 1982.3. Santiso C. Resúmenes <strong>de</strong>l III Seminario Internacional Ingeniería Genética y Biotecnología, 1989.4. Miranda, A. et al. A comparison of VDRL and immunoassays <strong>de</strong>v<strong>el</strong>op with a recombinant TmpA antigen inthe screening of antibodies to Treponema pallidum, 1997.Centro <strong>de</strong> Ingeniería Genética y BiotecnologíaP.O. Box 6162, La Habana, CubaT<strong>el</strong>éfonos: (53-7) 21 8008, 21 8039Fax: (53-7) 33 6008, 21 8070T<strong>el</strong>ex: 51 2330Instituto Pedro KouríP.O. Box: 601 Marianao, La Haban, CubaT<strong>el</strong>éfonos:(53-7)220426Fax:(53-7)220633T<strong>el</strong>ex: 51 1902cuipk
76DETECCIÓN DE ANTÍGENO A DENGUE MEDIANTE UN ELISA DEAMPLIFICACIÓN BIOTINA-ESTREPTAVIDINA (ELISA-BE)La <strong>de</strong>tección directa <strong>de</strong>l virus <strong>de</strong>ngue en muestras <strong>de</strong> suero mediante sistemasinmunoenzimáticos, es una alternativa útil <strong>para</strong> <strong>el</strong> diagnóstico temprano <strong>de</strong> <strong>la</strong>enfermedad. Se han <strong>de</strong>sarrol<strong>la</strong>do algunos sistemas que incluyen <strong>la</strong> amplificaciónmediada por biotina-estreptavidina, <strong>la</strong> cual permite establecer un método <strong>de</strong> altasensibilidad y especificidad, lográndose esto último, al incluir <strong>el</strong> uso <strong>de</strong>anticuerpos monoclonales.SUSTRATOESTREPTAVIDINA-PEROXIDASAACM ANTI-COMPLEJODENGUE-BIOTINASUEROIGS HUMANAS ANTI-DENGUEMateriales:‣ P<strong>la</strong>cas <strong>de</strong> poliestireno Maxisorb (NUNC), constituidas por 12 tiras <strong>de</strong> 8 pozoscada una.‣ Inmunoglobulinas humanas anti-<strong>de</strong>ngue Pool <strong>de</strong> sueros humanosconteniendo anticuerpos inhibidores <strong>de</strong> <strong>la</strong> hemaglutinación con títulosmayores o iguales a 1/1280 contra los virus <strong>de</strong>l complejo <strong>de</strong>ngue,precipitados por <strong>el</strong> método <strong>de</strong>l sulfato <strong>de</strong> amonio y <strong>de</strong>terminada suconcentración mediante <strong>la</strong> lectura <strong>de</strong> DO a 280 y 260 nm.‣ Anticuerpo monoclonal anti-complejo <strong>de</strong>ngue conjugado con biotina‣ Conjugado estreptavidina peroxidasa (Amersham)‣ Buffer <strong>de</strong> Recubrimiento (coatting) 0,05 M pH 9,5Carbonato <strong>de</strong> sodio (Na 2CO 3) anhidro 1,59g; Bicarbonato <strong>de</strong> sodio (NaHCO 3)2,93g. Disu<strong>el</strong>va en 1L <strong>de</strong> agua <strong>de</strong>sti<strong>la</strong>da, ajuste pH si es necesario. (Duraciónmáxima <strong>de</strong> 15 días, mantener a 4 o C)
77‣ PBS-Tween (PBS-T) pH 7,4Cloruro <strong>de</strong> sodio (NaCl) 8g; Cloruro <strong>de</strong> potasio (KCl) 0,2g; Fosfato monobásico <strong>de</strong>potasio (KH 2 PO 4 ) 0,2g; Fosfato dibásico <strong>de</strong> sodio anhidro (Na 2 HPO 4 ) 1,2g.Disu<strong>el</strong>va en 1L <strong>de</strong> agua <strong>de</strong>sti<strong>la</strong>da y agregue 0,5 mL <strong>de</strong> Tween-20. (Mantenerlo atemperatura ambiente)‣ Fosfato-citrato 0,05M pH 5:Ácido cítrico 5,1g; Fosfato dibásico <strong>de</strong> sodio anhidro 7,47g.Disu<strong>el</strong>va en 1L <strong>de</strong> agua <strong>de</strong>sti<strong>la</strong>da y ajuste <strong>el</strong> pH a 5.‣ Ortofenilendiamina (OPD)‣ Peróxido <strong>de</strong> hidrógeno (p.a.) 100 vol/ 30%‣ Albúmina bovina sérica fracción V (ABS) al 3%3 g <strong>de</strong> ABS en 100ml <strong>de</strong> buffer <strong>de</strong> recubrimiento (coatting). (Pre<strong>para</strong>rlo almomento <strong>de</strong> ser usado)‣ Sustrato25 mL <strong>de</strong> buffer fosfato-citrato; 10mg <strong>de</strong> OPD + 10ul H 2O 2. Proteger <strong>de</strong> <strong>la</strong> luz.Método:1. Adsorber en p<strong>la</strong>ca <strong>de</strong> poliestireno Igs humanas anti-<strong>de</strong>ngue en buffercarbonato / bicarbonato pH 9,5 a una concentración <strong>de</strong> 5ug/ml (100uL porpozo). Dejar <strong>la</strong>s p<strong>la</strong>cas en cámara húmeda tapada toda <strong>la</strong> noche a 4 o C. Senecesita un volumen <strong>de</strong> 10 mL por p<strong>la</strong>ca.2. Vaciar <strong>el</strong> contenido <strong>de</strong> <strong>la</strong>s p<strong>la</strong>cas y hacer un bloqueo con 150uL en cada pozo<strong>de</strong> <strong>la</strong> solución <strong>de</strong> ABS al 3% en buffer Carbonato/Bicarbonato. Incubar a 37 o Cpor 1 hora. Volumen total <strong>de</strong> 15 mL por p<strong>la</strong>ca.3. Lavar <strong>la</strong>s p<strong>la</strong>cas 3 veces con PBS-T.4. Agregar 100uL <strong>de</strong> una dilución <strong>de</strong> <strong>la</strong> muestra <strong>de</strong> suero 1/20 en PBS-T. Seincluirá un control negativo por cuadruplicado y uno positivo por duplicado.Incubar <strong>la</strong> p<strong>la</strong>ca 2 horas a 37 o C.5. Lavar 3 veces con PBS-T.6. Agregar 100uL por pozo <strong>de</strong>l AcM conjugado a Biotina diluido 1/500 en PBS-T+ 2% <strong>de</strong> STF. Incubar a 37 o C por 1 hora.7. Lavar 3 veces con PBS-T.
788. Añadir 100 uL por pozo <strong>de</strong>l conjugado estreptavidina-peroxidasa diluido1/2000 en PBS-T + 2% <strong>de</strong> STF. Dejar incubando 1 hora a 37 o C.9. Lavar 3 veces con PBS-T.10. Añadir <strong>el</strong> sustrato 100uL por pozo. El sustrato <strong>de</strong>be ser pre<strong>para</strong>do unosminutos antes <strong>de</strong> su utilización. Esperar 30 minutos <strong>de</strong> reacción.11. Detener <strong>la</strong> reacción agregando 100 uL <strong>de</strong> ácido sulfúrico al 12,5 % en cadapozo.12. Determinar los valores <strong>de</strong> <strong>de</strong>nsidad óptica a 492nm en un lector Micro-ELISA.Valor <strong>de</strong> corte (VC): Se calcu<strong>la</strong>rá <strong>la</strong> media <strong>de</strong> <strong>la</strong>s DOs y <strong>de</strong>sviación estándar <strong>de</strong>lcontrol negativo, estableciéndose como VC= <strong>la</strong> media <strong>de</strong> <strong>la</strong>s DO + 3 veces <strong>la</strong><strong>de</strong>sviación estándar.Toda muestra que tenga un valor <strong>de</strong> DO mayor o igual al VC será consi<strong>de</strong>radapositiva.
79SDS-PAGE / Western BlotEl blotting <strong>de</strong> proteínas fue originalmente <strong>de</strong>scrito en 1979 como resultado <strong>de</strong> <strong>la</strong>stécnicas <strong>de</strong> ácido nucleico; recibiendo <strong>la</strong> <strong>de</strong>signación <strong>de</strong> Western Blot (WB) en1981.Esta técnica ha permitido que <strong>la</strong>s proteínas corridas por <strong>el</strong>ectroforesis seencuentren accesibles al análisis a través <strong>de</strong> <strong>la</strong> reacción con anticuerpos oantisueros, lo cual ha tenido aplicación clínica e investigativa.En nuestro <strong><strong>la</strong>boratorio</strong> <strong>la</strong> técnica <strong>de</strong> WB fue normalizada <strong>para</strong> observar <strong>la</strong>respuesta <strong>de</strong> los sueros, tanto <strong>de</strong> infección primaria como secundaria, ante <strong>la</strong>sproteínas <strong>de</strong> los virus <strong>de</strong>ngue. De esta forma hemos podido apreciar diferenciasen cuanto a cantidad <strong>de</strong> proteínas que reconocen los sueros <strong>de</strong> infección primariay secundaria, así como <strong>la</strong> intensidad <strong>de</strong> <strong>la</strong> respuesta.El principio <strong>de</strong> <strong>la</strong> técnica está basado en <strong>la</strong> transferencia <strong>de</strong> <strong>la</strong>s proteínasse<strong>para</strong>das por <strong>el</strong>ectroforesis, en g<strong>el</strong> <strong>de</strong> poliacri<strong>la</strong>mida en presencia <strong>de</strong>duo<strong>de</strong>cilsulfato <strong>de</strong> sodio (SDS-PAGE, Laemmli, 1970) a una membrana <strong>de</strong>nitroc<strong>el</strong>ulosa. Luego <strong>de</strong> <strong>la</strong> transferencia, <strong>la</strong>s membranas son teñidas <strong>para</strong>chequear <strong>la</strong> eficiencia <strong>de</strong> este proceso (<strong>el</strong> colorante empleado es Rojo Ponceau S).Una vez <strong>el</strong>iminado <strong>el</strong> colorante <strong>la</strong> membrana <strong>de</strong>be ser bloqueada con leche <strong>para</strong>prevenir <strong>la</strong>s uniones inespecíficas. Los polipéptidos transferidos pue<strong>de</strong>n seri<strong>de</strong>ntificados usando anticuerpos que se unen a <strong>el</strong>los y <strong>el</strong> complejo antígenoanticuerpoes reconocido por un segundo anticuerpo que es conjugado conperoxidasa <strong>de</strong> rábano picante. Las proteínas pue<strong>de</strong>n ser localizadas según supeso molecu<strong>la</strong>r, utilizando los marcadores molecu<strong>la</strong>res <strong>de</strong> proteínas (Rainbow TM ,Amersham) o pue<strong>de</strong>n ser i<strong>de</strong>ntificadas por anticuerpos monoclonales según <strong>la</strong>disponibilidad. La actividad <strong>de</strong> <strong>la</strong> enzima es visualizada luego <strong>de</strong> una incubación<strong>de</strong> <strong>la</strong> membrana con un sustrato cromógeno apropiado, <strong>el</strong> cual proporciona colora un producto insoluble en <strong>la</strong> membrana. De esta forma, queda i<strong>de</strong>ntificado <strong>el</strong>complejo antígeno- anticuerpo.
80Materiales: Tampón se<strong>para</strong>dor:Tris --------------- 45.5 gSDS--------------- 1gAjustar pH 8.8 con HClEnrazar a 250 mL Tampón concentrador:Tris----------------15.14 gSDS --------------- 1 gAjustar pH 6.8 con HClEnrazar a 250 mL Acri<strong>la</strong>mida-Bisacri<strong>la</strong>mida:Acri<strong>la</strong>mida ----------- 73 gBisacri<strong>la</strong>mida -------- 2 gAmberlite HB1------- 2.5 gEnrazar a 250 mLAgitación toda <strong>la</strong> noche a 4°C en oscuridadFiltrar <strong>para</strong> <strong>el</strong>iminar <strong>el</strong> amberlite. Tampón muestra:Tris-HCl pH 6.8 (1M) -------------- 6.2 mLSolución Bromo fenol azul 1% ----- 1 mLGlicerol ------------------------------ 10 mLH 2O <strong>de</strong>sti<strong>la</strong>da ------------------------ 2.8 mL Tampón <strong>de</strong> Corrida:Tris ------------------- 3 gGlicina ---------------14.4 gSDS ------------------ 1 gCompletar a 1 L con H 2 O <strong>de</strong>sti<strong>la</strong>da.
81 Tampón <strong>de</strong> Transferencia:Tris------------------- 3.03 gGlicina -------------- 14.4 gMetanol ------------- 100 mLCompletar a 1 L <strong>de</strong> H 2 O <strong>de</strong>sti<strong>la</strong>da. Solución Rojo Ponceau S:Rojo Ponceau ------------0.5 gAcido acético g<strong>la</strong>cial --- 1 mLCompletar a 100 mL con H 2O <strong>de</strong>sti<strong>la</strong>da. Solución <strong>de</strong> <strong>la</strong>vado:PBS 1X -------------1 LTween 20----------- 0.5 mL Solución Bloqueadora (PBS-T 20-leche):Leche --------------4 gDiluir en Solución <strong>de</strong> <strong>la</strong>vado. Sustrato:4-cloro-1-naftol ------------------------------------ 10 mgDiluirlo en 5 ml <strong>de</strong> Metanol3.3 diaminobenzidina-tetrahidroclorhídrico ----- 30 mgDiluirlo en 40 mL <strong>de</strong> PBS 1X.Mezc<strong>la</strong>r ambos y adicionar 25 µL <strong>de</strong> peróxido.Procedimiento:Pre<strong>para</strong>ción <strong>de</strong>l material:Se cosechan cepas <strong>de</strong> los 4 serotipos en frascos Roller correspondientes, conmonocapa <strong>de</strong> célu<strong>la</strong>s confluentes Vero, una vez que <strong>el</strong> efecto citopático sea <strong>de</strong>l 70% se proce<strong>de</strong> a <strong>la</strong> pre<strong>para</strong>ción <strong>de</strong>l antígeno <strong>de</strong> trabajo según <strong>el</strong> diagrama <strong>de</strong> flujosiguiente. La fracción s<strong>el</strong>eccionada será <strong>la</strong> que contenga <strong>la</strong>s proteínas NS5, NS3,NS1, E, PreM y C.
82CENTRIFUGACION3000 rpm, 4 0 C, 30 minutosCELULASCong<strong>el</strong>ar (N 2 líquido) y<strong>de</strong>scong<strong>el</strong>ar (37 0 C) 8 vecesCENTRIFUGACION3000 rpm, 4 0 C, 30 minutosSOBRENADANTE SOBRENADANTE RESTOS CELULARES [1]CENTRIFUGACIONCONGELAR10 000 rpm, 4 0 C, 40 minutos (-70 0 C)PRECIPITADO [2]SOBRENADANTECONGELARPRECIPITAR TODA LA NOCHE(-70 0 C) (7% PEG y 2 % NaCl)CENTRIFUGACION15 000 rpm, 4 0 C, 40 minutosPRECIPITADO(Resuspen<strong>de</strong>r PBS 1X)SOBRENADANTE(Descartar)CENTRIFUGACION10 000 rpm, 4 0 C, 5 minutosPRECIPITADO SOBRENADANTE[3] [4]SDS-PAGEPre<strong>para</strong>ción <strong>de</strong>l g<strong>el</strong> <strong>de</strong> acri<strong>la</strong>mida se<strong>para</strong>dor al 10%. Mezc<strong>la</strong>r los reactivos en <strong>el</strong>siguiente or<strong>de</strong>n:Tampón se<strong>para</strong>dor pH8.8 --------9mLAcri<strong>la</strong>mida-Bisacri<strong>la</strong>mida --------8mLH 2 O <strong>de</strong>sti<strong>la</strong>da ----------------------7mLPersulfato <strong>de</strong> amonio 10% -------60µLTEMED -----------------------------30µL
83Una vez adicionado a <strong>la</strong> cámara y polimerizado se adiciona <strong>el</strong> g<strong>el</strong> concentradorPre<strong>para</strong>ción <strong>de</strong>l g<strong>el</strong> concentrador:Tampón concentardor pH6.8 ----3.1 mLAcri<strong>la</strong>mida-bisacri<strong>la</strong>mida---------1.9 mLH 2O <strong>de</strong>sti<strong>la</strong>da ----------------------7mLPersulfato <strong>de</strong> amonio 10% -------60µLTEMED ----------------------------30µLUna vez polimerizado <strong>el</strong> g<strong>el</strong>, se proce<strong>de</strong> a <strong>la</strong> corrida <strong>el</strong>ectroforética en presencia <strong>de</strong>tampón <strong>de</strong> corrida, pre<strong>para</strong>ndose <strong>la</strong> muestra con <strong>la</strong> unión <strong>de</strong>l antígeno y <strong>el</strong>tampón <strong>de</strong> muestra (100µL <strong>de</strong> <strong>la</strong> fracción y 300µL <strong>de</strong>l tampón) y previocalentamiento durante 2 min a 80°C. Se adiciona por cada pozo entre 15-20µL <strong>de</strong><strong>la</strong> mezc<strong>la</strong> calentada e igual volumen en un pocillo <strong>de</strong>l marcador molecu<strong>la</strong>rRaibow TM , aplicando una corriente constante <strong>de</strong> 100 mA durante 1h.Western BlotEquilibrar los pap<strong>el</strong>es <strong>de</strong> filtro, membrana <strong>de</strong> nitroc<strong>el</strong>ulosa y g<strong>el</strong> <strong>de</strong> poliacri<strong>la</strong>mida15 min antes en tampón <strong>de</strong> transferencia.1. Colocar en <strong>el</strong> equipo <strong>de</strong> transferencia en este or<strong>de</strong>n:a) 8 pap<strong>el</strong>es <strong>de</strong> filtrob) membrana <strong>de</strong> nitroc<strong>el</strong>ulosac) g<strong>el</strong> <strong>de</strong> poliacri<strong>la</strong>mida corridod) 8 pap<strong>el</strong>es <strong>de</strong> filtro.2. Aplicar corriente constante <strong>de</strong> 85 mA por g<strong>el</strong> durante 1h.3. Colocar <strong>la</strong> membrana en solución Rojo Ponceau S durante 15 min.4. Retirar <strong>la</strong> solución y <strong>la</strong>var <strong>la</strong> membrana con H 2O <strong>de</strong>sti<strong>la</strong>da hasta vizualizarbandas <strong>de</strong> proteínas (una vez que se verifique <strong>la</strong> eficiencia <strong>de</strong> <strong>la</strong>transferencia se sigue <strong>la</strong>vando con H 2 O <strong>de</strong>sti<strong>la</strong>da hasta que <strong>de</strong>saparezca <strong>de</strong><strong>la</strong> membrana <strong>la</strong> coloración rojiza).5. Colocar <strong>la</strong> membrana en solución bloqueadora durante 1h en agitación atemperatura ambiente (TA).
846. Retirar solución bloquedora e incubar con los sueros (dilución <strong>de</strong> trabajo apartir <strong>de</strong> 1/50 con PBS-T 20-leche) y como controles un líquido ascíticohiperinmune <strong>de</strong> ratón (control positivo) diluído 1/100 y un suero humanonegativo a <strong>de</strong>ngue diluído 1/50 durante 1h en agitación a TA.7. Lavado <strong>de</strong> <strong>la</strong> membrana con PBS-T 20.Un <strong>la</strong>vado rápido y 3 <strong>la</strong>vados <strong>de</strong> 10 min.en agitación a TA.8. Incubar membrana con conjugado humano (anti Ig humana-peroxidasa,Amersham) y conjugado anti-ratón (anti Ig ratón –peroxidasa, Amersham)diluídos 1/2000 y 1/1000 con PBS-T 20 -leche, respectivamente segúncorresponda, durante 1h en agitación a TA.9. Lavado <strong>de</strong> <strong>la</strong> membrana simi<strong>la</strong>r al anterior.10. Adicionar sustrato <strong>para</strong> rev<strong>el</strong>ar e incubar durante 5 min. en agitación a TA.11. Detener <strong>la</strong> reacción con H 2O <strong>de</strong>sti<strong>la</strong>da.Referencias1. Towbin H, Stach<strong>el</strong>in T, Gordon J. Electrophoretic transfer of proteins frompolyacri<strong>la</strong>mi<strong>de</strong> g<strong>el</strong>s to nitroc<strong>el</strong>lulose sheets: procedure and some applications.Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1979, 76: 4350-4354.2. Laemmli UK. Cleavage of structure proteins during the assembly of head ofbacteriophage T4. Nature 1970; 227: 680-685.3. Valdés K, Alvarez M, Pupo M, Vázquez S, Rodriguez R, Guzmán MG. HumanDengue antibodies against structural and nonstructural proteins. Clinica<strong>la</strong>nd Diagnostic Laboratory Immunology, 2000; 7(5): 856-57