72840-Platelia Toxo IgG.pdf - BIO-RAD

PLATELIA TOXO IgG 7284096 TESTSQUANTITATIVE DETERMINATION OF IgG ANTIBODIESTO TOXOPLASMA GONDII IN HUMAN SERUM ORPLASMA BY ENZYME IMMUNOASSAY

1. INTENDED USEPlatelia Toxo IgG is an indirect ELISA immunoassay for quantitativedetermination of IgG antibodies to Toxoplasma gondii in human serum orplasma.2. CLINICAL VALUET. gondii is a protozoan causing infection in numerous species of mammalsand birds. Toxoplasmosis, frequent in humans and animals, are more typicallysilent. The prevalence of this infection in the population, established usingserological tests, may differ depending upon the country of origin and the age.Toxoplasmosis during pregnancy has been implicated in serious congenitalabnormalities (in particular, impaired brain functions) and sometimes stillbirth.Demonstration of Toxo IgG antibody in women prior to conception providesassurance of fetal protection from possible toxoplasmosis during pregnancy.Predisposition to severe toxoplasmosis infection is common in persons knownto have Acquired Immune Deficiency Syndrome (AIDS), or who are otherwiseimmunocompromised. These infections are mainly due to reactivation ofT. gondii cysts present prior to the HIV infection.Specific diagnosis of T. gondii infection can be complicated and isolation ofthe parasite is rare. Serologic confirmation of T. gondii antibody is indicative ofexposure to the parasite and has become widely accepted as a means todetermine immune status and susceptibility to infection. Screening of severalisotypes allows either the dating of the T. gondii and the implementation ofappropriate therapy in case of recent infection or the proposal of prophylacticrecommendations: hygiene-diet guidelines in pregnant women, chemoprophylaxyin immunocompromised population.3. PRINCIPLEPlatelia Toxo IgG is a test for detection and titration of IgG antibodies toToxoplasma gondii in human serum or plasma using an indirect ELISAimmuno-enzymatic method.T. gondii antigen is used for coating the microplate. A monoclonal antibodylabeled with peroxydase which is specific for human gamma chains (anti-IgG)is used as the conjugate. The test uses the following steps:• Step 1Patients samples and calibrators are diluted 1/21 and then distributed in thewells of the microplate. During this incubation of one hour at 37°C, IgGantibodies to T. gondii present in the sample bind to the T. gondii antigencoated on microplate wells. After incubation, unbound non specific antibodiesand other serum proteins are removed by washings.2

• Step 2The conjugate (peroxydase labeled monoclonal antibody specific for humangamma chains) is added to the microplate wells. During this incubation of onehour at 37°C, the labeled antibody binds to the serum IgG captured by theT. gondii antigen. The unbound conjugate is removed by washings at the endof the incubation.• Step 3The presence of immune-complexes (T. gondii antigen, IgG antibodies toT. gondii, anti-IgG conjugate) is demonstrated by the addition in each well ofan enzymatic development solution.• Step 4After incubation at room temperature (+18-30°C), the enzymatic reaction isstopped by addition of 1N sulfuric acid solution. The optical density readingobtained with a spectrophotometer set at 450/620 nm is proportional to theamount of IgG antibodies to T. gondii present in the sample and is convertedinto IU/ml using a standard curve calibrated against WHO InternationalStandard TOX-M.4. PRODUCT INFORMATIONSupplied quantities of reagents have been calculated to allow 96 tests. Allreagents are exclusively for in vitro diagnostic use.Label Nature of reagents PresentationR1 Microplate Microplate: (Ready-to-use):12 strips with 8 breakable wells, coated withinactivated T. gondii antigen1R2ConcentratedWashingSolution (20x)Concentrated Washing Solution (20x):TRIS-NaCl buffer (pH 7.4), 2% Tween ® 20Preservative : < 1.5% ProClin 300R3 Calibrator 0 Calibrator 0:Negative human serum for IgG antibodies toT. gondii, and negative for HBs antigen,anti-HIV1, anti- HIV2 and anti-HCVPreservative : < 1.5% ProClin 300R4a Calibrator 6 Calibrator 6 IU/ml:Human serum reactive for IgG antibodies toT. gondii, and negative for HBs antigen,anti-HIV1, anti- HIV2 and anti-HCVPreservative : < 1.5% ProClin 3001 x 70 mL1 x 0.75 mL1 x 0.75 mL3

Label Nature of reagents PresentationR4b Calibrator 60 Calibrator 60 IU/ml:1 x 0.75 mLHuman serum reactive for IgG antibodies toT. gondii, and negative for HBs antigen,anti-HIV1, anti- HIV2 and anti-HCVPreservative : < 1.5% ProClin 300R4c Calibrator 240 Calibrator 240 IU/ml:1 x 0.75 mLHuman serum reactive for IgG antibodies toT. gondii, and negative for HBs antigen,anti-HIV1, anti- HIV2 and anti-HCVPreservative : < 1.5% ProClin 300R6 Conjugate Conjugate (51x):1 x 0.7 mL(51x) Murine monoclonal antibody to human gammachainscoupled to horseradish peroxydasePreservative : < 1.5% ProClin 300R7 Diluent Diluent for samples and conjugate (Readyto-use):Tris-NaCl (pH 7,7), glycerol,0.1% Tween ® 20, phenol redPreservative : < 1.5% ProClin 3001 x 100 mLR9ChromogenTMBChromogen (Ready-to-use):3.3’.5.5’ tetramethylbenzidine (< 0.1%), H 2O 2(

REMARK: It is not permissible to use Diluent (R7) from lots other thanprovided in the kit. It is also not permissible to use the Diluent (R7)provided with Platelia Toxo IgM kits (Ref. 72841).REMARK: In addition, the Washing Solution (R2, label identification: 20xcolored green) can be mixed with the 2 other washing solutions included invarious Bio-Rad reagent kits (R2, label identifications: 10x colored blue or10x colored orange) when properly reconstituted, provided only onemixture is used within a given test run.• Before use, wait for 30 minutes to allow reagents to reach room temperature(+18-30°C).• Carefully reconstitute or dilute the reagents avoiding any contamination.• Do not carry out the test in the presence of reactive vapors (acid, alkaline,aldehyde vapors) or dust that could alter the enzyme activity of theconjugate.• Use glassware thoroughly washed and rinsed with deionized water or,preferably disposable material.• Washing the microplate is a critical step in the procedure: follow therecommended number of washings cycles and make sure that all wells arecompletely filled and then completely emptied. Incorrect washings may leadto inaccurate results.• Do not allow the microplate to dry between the end of the washingsoperation and the reagent distribution.• Never use the same container to distribute the conjugate and thedevelopment solution.• The enzymatic reaction is very sensitive to metal or metal ions.Consequently, do not allow any metal element to come into contact with thevarious solutions containing the conjugate or the chromogen.• Chromogen solution (R9) should be colorless. The appearance of a bluecolor indicates that the reagent cannot be used and must be replaced.• Use a new pipette tip for each sample.• Check the pipettes and other equipments for accuracy and correctoperations.HEALTH AND SAFETY INSTRUCTIONSHuman origin material used in the preparation of reagents has been tested andfound non-reactive for hepatitis B surface antigen (HBs Ag), antibodies forhepatitis C virus (anti-HCV), and to human immunodeficiency virus (anti-HIV1and anti-HIV2). Because no method can absolutely guarantee the absence ofinfectious agents, handle reagents of human origin and patient samples aspotentially capable of transmitting infectious diseases:5

• Any material, including washings solutions, that comes directly in contactwith samples and reagents containing materials of human origin should beconsidered capable of transmitting infectious diseases.• Wear disposable gloves when handling samples and reagents.• Do not pipette by mouth.• Avoid spilling samples or solutions containing samples. Spills must berinsed with bleach diluted to 10 %. In the event of a spill with an acid, itmust be first neutralized with sodium bicarbonate, and then cleaned withbleach diluted to 10% and dried with adsorbent paper. The material usedfor cleaning must be discarded in a contaminated residue container.• Patient samples, reagents containing human origin material, as well ascontaminated material and products should be discarded afterdecontamination only:- either by immersion in bleach at the final concentration of 5 % of sodiumhypochloride during 30 minutes,- or by autoclaving at 121°C for 2 hours at the minimum.CAUTION: Do not introduce solutions containing sodium hypochloride intothe autoclave• Avoid any contact of reagents, including those considered as notdangerous, with skin and mucosa.• Chemical and biological residues must be handled and disposed off inaccordance with Good Laboratories Practices.• All reagents in the kit are exclusively for in vitro diagnostic use.Caution: Some of the reagents contain ProClin 300 < 1.5%R43: May cause sensitisation by skin contactS28-37: After contact with skin, wash immediately with plenty ofXi - Irritant water and soap. Wear suitable gloves6. SAMPLES1. Serum and plasma (EDTA, heparin or citrate) are the recommended sampletypes.2. Observe the following recommendations for handling, processing andstorage of blood samples:• Collect all blood samples observing routine precaution for venipuncture.• For serum, allow samples to clot completely before centrifugation.• Keep tubes stoppered at all times.• After centrifugation, separate the serum or plasma from the clot or redcells in a tightly stoppered storage tube.• The specimens can be stored at +2-8°C if test is performed within7 days.6

• If test will not be completed within 7 days, or for shipment, freeze thesamples at -20°C or colder.• Do not use samples that have been thawed more than 5 times.Previously frozen specimens should be thoroughly mixed (Vortex) afterthawing prior to testing.3. Samples containing 90 g/l of albumin or 100 mg/l of unconjugated bilirubin,lipemic samples containing the equivalent of 36 g/l of triolein (triglyceride),and hemolysed samples containing up to 10 g/l of hemoglobin do not affectthe results.4. Do not heat the samples.7. ASSAY PROCEDURE7.1 Materials required but not provided• Vortex mixer.• Microplate reader equipped with 450 nm and 620 nm filters (*).• Microplate incubator thermostatically set at 37±1°C (*).• Automatic, semi-automatic or manual microplate washer (*).• Sterile distilled or deionized water.• Disposable gloves.• Goggles or safety glasses.• Adsorbent paper.• Automatic or semi-automatic, adjustable or preset, pipettes or multipipettes,to measure and dispense 10 µl to 1000 µl, and 1 ml, 2 ml and10 ml.• Graduated cylinders of 25 ml, 50 ml, 100 ml and 1000 ml capacity.• Sodium hypochloride (bleach) and sodium bicarbonate.• Container for biohazard waste.• Disposable tubes.(*) Consult our technical department for detailed information about therecommended equipment.7.2 Reagents reconstitution• R1: Allow 30 minutes at room temperature (+18-30°C) before opening thebag. Take out the carrier tray, return unused strips in the bag immediatelyand check the presence of desiccant. Carefully reseal the bag and store it at+2-8°C.• R2: Dilute 1/20 the washing solution R2 in distilled water: for example 50 mlof R2 and 950 ml of distilled water to get the ready-to-use washing solution.Prepare 350 ml of diluted washing solution for one plate of 12 strips ifwashing manually.7

• R3, R4a, R4b, R4c: Dilute 1/21 in Diluent (R7) (example: 300 µl of R7+ 15 µL of Calibrator).• R6+R7: Conjugate (R6) is concentrated 51x and must be homogenizedbefore use. Dilute 1/51 in Diluent (R7). For one plate, dilute 0.5 ml ofConjugate (R6) in 25 ml of Diluent (R7). Divide these volumes by 10 to obtainthe volume needed for one strip.7.3 Storage and validity of opened and / or reconstituted reagentsThe kit must be stored at +2-8°C. When the kit is stored at +2-8°C beforeopening, each component can be used until the expiration date indicated onthe outer label of the kit.• R1: Once opened, the strips remain stable for up to 8 weeks if stored at+2-8°C in the same carefully closed bag (check the presence of desiccant).• R2: Once diluted, the Washing Solution can be kept for 2 weeks at +2-30°C.Once opened, the concentrated Washing Solution stored at +2-30°C, inabsence of contamination, is stable until the expiration date indicated onthe label.• R3, R4a, R4b, R4c, R6, R7: Once opened and without any contamination,the reagents stored at +2-8°C are stable for up to 8 weeks.• R6+R7: Once diluted, the conjugate working solution is stable for 8 hours atroom temperature (+18-30°C) or 2 weeks at +2-8°C.• R9: Once opened and without any contamination, the reagent stored at+2-8°C is stable for up to 8 weeks.• R10: Once opened and without any contamination, the reagent stored at+2-8°C is stable until the expiration date indicated on the label.7.4 ProcedureStrictly follow the assay procedure and Good Laboratory Practices.Before use, allow reagents to reach room temperature (+18-30°C).The use of breakable wells requires a special attention during handling.Use all calibrators with each run to validate the assay results.1. Carefully establish the distribution and identification plan for calibrators andpatients samples.2. Prepare the diluted Washing Solution (R2) [Refer to Section 7.2].3. Take the carrier tray and the strips (R1) out of the protective pouch [Refer toSection 7.2].4. In individually identified tubes, dilute Calibrators R3, R4a, R4b, R4c andpatients samples (S1, S2…) in Diluent (R7) to give a 1/21 dilution: 300 µl ofDiluent (R7) and 15 µl of sample [Refer to Section 7.2]. Vortex dilutedsamples.5. Strictly following the indicated sequence below, distribute in each well with200µl of diluted calibrators and patient samples:8

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12A R3 S5 S13B R4a S6C R4b S7D R4c S8E S1 S9F S2 S10G S3 S11H S4 S126. Cover the microplate with an adhesive plate sealer, then press firmly ontothe plate to ensure a tight seal. Incubate the microplate immediately in athermostat controlled water bath or in a dry incubator for 1 hour ± 5 minutesat 37°C ± 1°C.7. Before the end of the first incubation period, prepare the conjugate workingsolution (R6+R7) [Refer to Section 7.2].8. At the end of the first incubation period, remove the adhesive plate sealer.Aspirate the content of all wells into a container for biohazard waste(containing sodium hypochloride). Wash microplate 4 times with 350 µl ofthe Washing Solution (R2). Invert the microplate and gently tap onadsorbent paper to remove remaining liquid.9. Distribute immediately 200 µl of the conjugate working solution (R6+R7) inall wells. The solution must be shaken gently before use.10. Cover the microplate with an adhesive plate sealer, then press firmly ontothe plate to ensure a tight seal. Incubate the microplate immediately in athermostat controlled water bath or in a dry incubator for 1 hour ± 5 minutesat 37°C ± 1°C.11. At the end of the second incubation period, remove the adhesive platesealer. Aspirate the content of all wells into a container for biohazard waste(containing sodium hypochloride). Wash microplate 4 times with 350 µl ofthe Washing Solution (R2). Invert the microplate and gently tap onadsorbent paper to remove remaining liquid.12. Quickly distribute into each well and away from light 200 µl of Chromogensolution (R9). Allow the reaction to develop in the dark for 30 ± 5 minutesat room temperature (+18-30°C). Do no use adhesive plate sealer duringthis incubation.13. Stop the enzymatic reaction by adding 100 µl of Stopping Solution (R10) ineach well. Use the same sequence and rate of distribution as for thedevelopment solution.9

14. Carefully wipe the plate bottom. Read the optical density at 450/620 nmusing a plate reader within 30 minutes after stopping the reaction. The stripsmust always be kept away from light before reading.15. Before reporting results, check for agreement between the reading and thedistribution plan of plate and samples.8. INTERPRETATION OF RESULTS8.1 Establishing the standard curveThe presence and quantity of IgG antibodies to T. gondii in the test sample isdetermined by comparing the optical density (OD) of the test sample to astandard range. The Platelia Toxo IgG assay is standardized to WHOInternational Standard TOX-M. However, certain discrepancies of titres may beobserved for the same serum when it is tested by different serologicaltechniques.This discrepancy is due to the fact that the T. gondii used in these varioustechniques contain variable proportions of the soluble membrane antigen.Draw the standard curve [OD = function (IU/ml)] by plotting OD readings ofcalibrators R3, R4a, R4b, R4c on the vertical (Y) axis, then by plotting theirrespective concentration in IU/ml on the horizontal (X) axis. For each testedsample, calculate the anti-T. gondii IgG antibody titer by determining from thedrawn standard curve the corresponding concentration to the measured OD.NB: If the OD reading of a test sample diluted 1/21 is > OD R4c, this testsample should be diluted 1/210 in R7 diluent and re-run in the assay. Therelated IU/ml values must then be multiplied by a factor of 10.8.2 Quality ControlInclude all calibrators for each microplate and for each run, and analyze theobtained results. For validation of the assay, the following criteria must be met:• Optical density values:OD R4a ≥ 0.200OD R4b ≥ 0.400• Optical density ratios:OD R4a / OD R3 ≥ 5.00OD R4b / OD R4a ≥ 2.20OD R4c / OD R4b ≥ 1.15If those quality control criteria are not met, the test run should be repeated.10

8.3 Interpretation of resultsAnti-T. gondiiantibodies titer ResultInterpretation(International Units/ml)Titer < 6 IU/ml Negative A negative or equivocal result is indicative ofabsence of acquired immunity, but cannot6 IU/ml ≤ Titer< 9 IU/mlEquivocalexclude a recent infection. If a recent infectionof the patient is suspected, a second sampleshould be run about two weeks later.Titer ≥ 9 IU/ml Positive A positive result is usually indicative of a pastinfection.However, a recent infection cannotbe excluded, especially if anti-T. gondii IgMantibodies are present.A higher variation of titers can be observed above concentrations of 200 IU/ml.8.4 Trouble Shooting GuideNon validated or non repeatable reactions are often caused by:• Inadequate microplate washings.• Contamination of negative samples by serum or plasma with a highantibody titer.• Contamination of the development solution by chemical oxidizing agents(bleach, metal ions...).• Contamination of the Stopping Solution.9. PERFORMANCESPerformances of Platelia Toxo IgG were evaluated at 2 sites using a total of1310 samples from pregnant women and blood donors. On one site, acomparative study was performed using Platelia Toxo IgG TMB (72741) in amanual assay. At the second site, the performance of Platelia Toxo IgG wasevaluated against Platelia Toxo IgG TMB (72741) used on an automated EIAmicroplate analyser. Additionally, performance of Platelia Toxo IgG wasevaluated on 47 cord blood samples.9.1 PrevalencePrevalence of anti-Toxoplasma gondii IgG antibodies using Platelia Toxo IgGwas estimated on a panel of 538 samples mainly from pregnant womenmonitored during their pregnancy and from around Paris (France). 128 sampleswere positive for anti-toxoplasma IgG antibodies. Prevalence measured withPlatelia Toxo IgG assay is established at 23.8% (128/538).11

9.2 Comparative study (Site 1)The performance of Platelia Toxo IgG was evaluated using a panel of 745samples grouped as follows:• 606 sera from blood donors• 139 sera from pregnant womenResults were compared with those obtained using Platelia Toxo IgG TMB(72741) used as a reference.PlateliaToxo IgG(72840)Platelia Toxo IgG TMB (72741)Negative Doubtful* Positive TotalNegative 365 0 0 365Doubtful* 0 2 0 2Positive 0 0 378 378Total 365 2 378 745• Global agreement: 743/743 100.0% [IC 95% = 99.5% - 100.0%]• Relative specificity: 365/365 100.0% [IC 95% = 99.0% - 100.0%]• Relative sensitivity: 378/378 100.0% [IC 95% = 99.0% - 100.0%]*Doubtful samples were not included for sensitivity, specificity and agreement calculations.[IC95%] = 95% confidence interval9.3 Performances (Site 2)A prospective study was performed on 538 samples mainly from pregnantwomen monitored during their pregnancy and tested in the routine of thelaboratory. These samples were tested in parallel with Platelia Toxo IgG andPlatelia Toxo IgG TMB (72741) assays. Moreover, all the samples fromunknown patients in the laboratory database and having a titer below100 UI/ml were controlled by a second method:• Sensitive Agglutination (Laboratory antigen: T. gondii, RH strain) for serawith titer > 10 IU/ml.• Indirect Immuno-fluorescence (Laboratory antigen: T. gondii, RH strain) forsera with titer between 3 and 10 IU/ml.Results were compared with those obtained using Platelia Toxo IgG TMB(72741) used as a reference.PlateliaToxo IgG(72840)Platelia Toxo IgG TMB (72741)Negative Doubtful* Positive TotalNegative 406 1 0 407Doubtful* 3 0 0 3Positive 7 10 111 128Total 416 11 111 53812

• Global agreement: 517/524 98.7% [IC 95% = 97.3% - 99.5%]• Relative specificity: 406/413 98.3% [IC 95% = 96.5% - 99.3%]• Relative sensitivity : 111/111 100.0% [IC 95% = 96.8% - 100.0%]*Doubtful samples were not included for sensitivity, specificity and agreement calculations.[IC95%] = 95% confidence intervalThe 7 discrepant positive samples with Platelia Toxo IgG assay were allconfirmed positive with the complementary methods used by the laboratory(Sensitive Agglutination, Indirect Immuno-fluorescence)In addition, 9 seroconversion panels including 3 samples each were alsotested with Platelia Toxo IgG (72840) and Platelia Toxo IgG TMB (72741)assays. For each panel, the first sample was negative for both anti-Toxoplasmagondii IgG and IgM antibodies.In 8 of the 9 seroconversion panels, both assays gave similar results. In onepanel, the 2nd seroconversion serum was found positive with Platelia ToxoIgG assay, but doubtful with Platelia Toxo IgG TMB assay.9.4 Performances on cord blood samples47 cord blood samples were tested using the protocol described in Section 7.4(sample dilution 1:21):• 22 samples from confirmed congenital toxoplasmosis• 18 samples from maternal toxoplasmosis past-infection• 7 samples with no infectionSamples from congenital and past-infections were all positive using PlateliaToxo IgG (72840), with all past-infections samples being negative withPlatelia Toxo IgM assay (72841). The 7 non infected samples were confirmednegative.Platelia Toxo IgG (72840) Platelia Toxo IgM (72841)Positive Doubtful Negative Positive Doubtful NegativeCongenitaltoxoplasmosis(n=22)Maternal pastinfection(n=18)22 0 0 18 2 218 0 0 0 0 18Negative (n=7) 0 0 7 0 0 713

9.5 Cross ReactivityA panel of 197 samples including 159 positive samples for Rubella, CMV, EBV,HSV, VZV, mumps, measles and HIV, and 38 positive samples for rheumatoidfactor, auto-antibodies and heterophile antibodies were tested with PlateliaToxo IgG (72840) and Platelia Toxo IgG TMB (72741).141 samples were found negative, 55 samples were found positive and 1sample was found doubtful with Platelia Toxo IgG assay. All the positivesamples were also found positive with Platelia Toxo IgG TMB assay.9.6 Precision• Within-run precision (repeatability):In order to evaluate intra-assay repeatability, one negative and three positivesamples were tested 32 times during the same run. The concentration (IU/ml)was determined for each sample. Mean of concentrations (IU/ml), StandardDeviation (SD) and Coefficient of Variation (%CV) for each specimen are listedin the table below:Within-run precision (repeatability)N=32• Between-run precision (reproducibility):In order to evaluate inter-assay reproducibility, the four samples (one negativeand three positives) were tested in duplicate in two runs per day over a 20 dayperiod. The concentration (IU/ml) was determined for each sample. Mean ofconcentrations (IU/ml), Standard Deviation (SD) and Coefficient of Variation(%CV) for each specimen are listed in the table below:Between-run precision (reproducibility)N=80NegativeSampleNegativeSampleLow PositivesampleLow PositivesamplePositivesampleConcentration (IU/ml)PositivesampleConcentration (IU/ml)High PositiveSampleMean 0.15 16.0 39.8 167.5SD 0.01 2.3 2.7 23.1% CV 7.2% 14.4% 6.9% 13.8%High PositiveSampleMean 0.15 15.2 41.7 166.5SD 0.05 2.4 4.2 21.0% CV 32.6% 15.5% 10.1% 12.6%14

9.7 Accuracy and linearityIn order to evaluate the accuracy of calibration, several dilutions of the WHOInternational Standard TOX-M were tested. Results obtained demonstrate thatPlatelia TOXO IgG assay is accurately calibrated against the WHOInternational Standard TOX-M for values up to 30 IU/ml. Above 30 IU/ml,obtained results are under-estimated about 25 to 50%.Using serial dilutions on 5 positive samples, assay range of Platelia Toxo IgGwas established between 7 and 200 UI/ml.10. LIMITATIONS OF THE PROCEDUREDiagnosis of T. gondii infection can only be established on the basis of acombination of clinical and biological data. The result of a single test oftitration of anti-T. gondii IgG antibodies does not constitute sufficient proof forthe diagnosis of a recent infection by Toxoplasma gondii.• Diagnosis of a recent infection can only be made with complete patientinformation including clinical and biological data (significant increase of anti-T. gondii IgG antibodies on 2 patient sera drawn at 3 weeks interval andtested in the same run, presence of anti-T. gondii IgM at a significant level,demonstration of low anti-T. gondii IgG avidity).• Presence of anti-T. gondii IgM antibodies does not constitute a sufficientproof to confirm a recent infection because IgM can persist several monthsor even years after infection. When IgM are detected, a quantitativedetermination of anti-T. gondii IgG antibodies should be performed, as wellas a follow-up of the evolution of anti-T. gondii antibodies at least on asecond serum sampled three weeks later.• If a sample is tested too early during a recent primo-infection, anti-T. gondiiIgM antibodies could be not yet present. If a suspicion exists, a secondsample should be drawn about 3 weeks later on which IgM testing will beperformed again.11. QUALITY CONTROL OF THE MANUFACTURERAll manufactured reagents are prepared according to our Quality System,starting from reception of raw material to commercialization of the finalproduct. Each lot is submitted to quality control assessments and is releasedto the market only after conforming to pre-defined acceptance criteria. Therecords related to production and controls of each single lot are kept withinBio-Rad.12. REFERENCES1. ANDERSON S.E. and REMINGTON J.S. : The diagnosis of toxoplasmosis.Southern Med. J. 1975; 68, 1433-1443.2. DECOSTER A., DARCY F., CARON A., VINATIER D., HOUZE DE L’AULNOISD., VITTU G., NIEL G., HEYER F., LECOLIER B., DELCROIX M., MONNIER15

16J.C., DUHAMEL M. and CAPRON A. : Anti-P30 IgA antibodies as prenatalmarkers of congenital Toxoplasma infection. 1992; 87, 310-315.3. JENUM P.A., STRAY-PEDERSEN B., MELBY K.K., KAPPERUD G.,WHITELAW A., ESKILD A. and ENG J. : Incidence of Toxoplasma gondiiinfection in 35 940 pregnant women in Norway and pregnancy outcome forinfected women. J. Clin.Microbiol. 1998; 36, 2900-2906.4. JENUM P.A. and STRAY-PEDERSEN B. : Development of specificimmunoglobulins G, M, and A following Toxo-plasma gondii infection inpregnant women in Norway and pregnancy outcome for infected women. J.Clin. Microbiol. 1998; 36, 2907-2913.5. JENUM P.A., STRAY-PEDERSEN B. and GUNDERSEN A.G. : ImprovedDiagnosis of primary Toxoplasma gondii infection in early pregnancy bydetermination of anti-Toxoplasma immunoglobulin G avidity. J. Clin.Microbiol. 1997 ; 35, 1972-1977.6. LECOLIER B. and PUCHEU : Usefulness of IgG avidity analysis for thediagnosis of toxoplasmosis. Path. Biol. 1993; 42, 2 155-158.7. REMINGTON J.S. and DESMONTS G. : Toxoplasmosis in infectious diseaseof the fetus and newborn infant. JS Remington and JO Klein, eds. WBSaunders Co., Philadelphia 1976; 191-332.8. SULHANIAN A., NUGUES C., GARIN J.F., PELLOUX H., LONGUET P.,SLIZEWICZ B. and DEROUIN F. : Serodiagnosis of toxoplasmosis inpatients with acquired or reactivating toxoplasmosis and analysis of thespecific IgA antibody response by ELISA, agglutination and immunoblotting.Immunol.Infect. Dis. 1993; 3, 63-69.9. WILSON M., REMINGTON J.S., CLAVET C., VARNEY G., PRESS C., WARED. and the FDA TOXOPLASMOSIS AD HOC WORKING group : Evaluationof six commercial kits for detection of human immunoglobulin M. antibodiesto Toxoplasma gondii. J. Clin. Microbiol. 1997; 35, 3112-3115.10. WONG S.Y. and REMINGTON J.S. : Biology of Toxoplasma gondii. AIDS1993; 7, 299-316.

PLATELIA TOXO IgG 7284096 TESTSDETERMINATION QUANTITATIVE DES ANTICORPSIgG ANTI-TOXOPLASMA GONDII DANS LE SERUMOU LE PLASMA HUMAIN PAR METHODEIMMUNOENZYMATIQUE

1. DOMAINE D’UTILISATIONPlatelia Toxo IgG est un test immunoenzymatique de type ELISA indirectpour la détermination quantitative des anticorps IgG dirigés contre leToxoplasma gondii dans le sérum ou le plasma humain.2. INTERET CLINIQUET. gondii est un protozoaire capable d’infecter de nombreuses espèces demammifères et d’oiseaux. Ces infections, courantes chez l’homme et lesanimaux, se déroulent le plus souvent de façon inapparente sur le planclinique. La prévalence de cette infection dans la population, détectée par laprésence d’anticorps spécifiques dans le sérum est variable en fonction de larégion et de l’âge.Cette infection peut, dans le cas d’une primo-infection de la mère au cours dela grossesse, être la cause de graves séquelles pour le foetus (en particulierune altération des fonctions cérébrales) ou même d’avortement. Une immunitémême ancienne de la mère, démontrée par la présence d’anticorps IgG dès ledébut de la grossesse, protège le fœtus de l’infection par ce parasite.La deuxième population sensible à cette infection est représentée par lespatients immuno-déprimés dont les malades atteints de SIDA. Ces infectionssont dues, presque exclusivement, à une infection à partir d’un foyerparasitaire (kyste) quiescent du patient, préexistant à l’infection par le virus HIV.Le diagnostic de certitude de l’infection toxoplasmique est apporté par la miseen évidence du parasite, mais sa recherche par examen direct est difficile pourne pas dire aléatoire. La sérologie représente la base du diagnostic et du suivide la toxoplasmose. La mise en évidence d’anticorps spécifiques permetd’affirmer une contamination par T. gondii ; l’étude combinée des anticorpsappartenant à différents isotypes permet généralement de dater l’infection etd’orienter la thérapeutique en cas d’infection récente, ou de proposer desmesures prophylactiques adaptées au risque de survenue d’unetoxoplasmose : mesures hygiéno-diététiques chez les femmes enceintesdépourvues d’anticorps, chimioprophylaxie chez les sujets immunodéprimésséropositifs pour T. gondii.3. PRINCIPEPlatelia Toxo IgG est un test permettant la détection et le titrage desanticorps IgG anti-T. gondii dans le sérum ou le plasma humain par uneméthode immunoenzymatique sur phase solide dite technique «ELISAindirect».L’antigène T. gondii est utilisé pour sensibiliser la microplaque. Un anticorpsmonoclonal marqué à la peroxydase et spécifiquement dirigé contre leschaînes gamma humaines (anti-IgG) est utilisé comme conjugué. La mise enœuvre du test comprend les étapes suivantes :18

• Etape 1Les échantillons à étudier ainsi que les calibrateurs sont dilués au 1/21 puisdéposés dans les cupules de la microplaque. Durant cette incubation de1 heure à 37°C, les IgG anti-T. gondii présentes dans l’échantillon se lient àl’antigène T. gondii fixé sur les cupules de la microplaque. Les IgG nonspécifiques du T. gondii et les autres protéines sériques sont éliminées par leslavages pratiqués à la fin de l’incubation.• Etape 2Le conjugué (anticorps monoclonal spécifique des chaînes gamma humaineset marqué à la peroxydase) est déposé dans toutes les cupules de lamicroplaque. Durant cette incubation de 1 heure à 37°C, l’anticorps marqué selie aux IgG sériques ayant réagi avec l’antigène T. gondii. Le conjugué non liéest éliminé par les lavages pratiqués à la fin de l’incubation.• Etape 3La présence des complexes (Ag T. gondii, IgG anti-T. gondii, conjugué anti-IgG) éventuellement formés est révélée par l’addition dans chaque cupuled’une solution de révélation enzymatique.• Etape 4Après incubation à température ambiante (+18-30°C), la réactionenzymatique est stoppée par addition d’une solution d’acide sulfurique1N. La densité optique lue à 450/620 nm est proportionnelle à la quantitéd’IgG anti-T. gondii présente dans l’échantillon testé. La densité optiqueest convertie en UI/ml à l’aide d’une gamme standard de référencecalibrée selon le Standard International OMS TOX-M.4. COMPOSITION DE LA TROUSSEEtiquetage Nature des réactifs PrésentationR1 Microplate Microplaque : (prêt à l’emploi):12 barrettes de 8 cupules à puits sécablessensibilisées avec l’antigène T. gondii inactivé1R2ConcentratedWashingSolution (20x)Solution de lavage (20x):Tampon TRIS-NaCl (pH 7,4), 2% Tween ® 20.Conservateur : < 1,5% ProClin 300R3 Calibrator 0 Calibrateur 0:Sérum humain négatif en IgG anti-T. gondii, enantigène HBs et en anticorps anti-HIV1, anti-HIV2 et anti-HCVConservateur : < 1,5% ProClin 3001 x 70 mL1 x 0,75 mL19

Etiquetage Nature des réactifs PrésentationR4a Calibrator 6 Calibrateur 6 UI/ml :1 x 0,75 mLSérum humain réactif pour les IgGanti-T. gondii, et négatif en antigène HBs eten anticorps anti-HIV1, anti-HIV2 et anti-HCVConservateur : < 1,5% ProClin 300R4b Calibrator 60 Calibrateur 60 UI/ml :1 x 0,75 mLSérum humain réactif pour les IgGanti-T. gondii, et négatif en antigène HBs eten anticorps anti-HIV1, anti-HIV2 et anti-HCVConservateur : < 1,5% ProClin 300R4c Calibrator 240 Calibrateur 240 UI/ml:1 x 0,75 mLSérum humain réactif pour les IgGanti-T. gondii, et négatif en antigène HBs eten anticorps anti-HIV1, anti-HIV2 et anti-HCVConservateur : < 1,5% ProClin 300R6 Conjugate Conjugué (51x):1 x 0,7 mL(51x) Anticorps monoclonal de souris anti-chaînesgamma humaines couplé à la peroxydaseConservateur : < 1,5% ProClin 300R7 Diluent Diluant pour échantillons et conjugué (prêt àl’emploi): Tris-NaCl (pH 7,7), glycérol,0,1% de Tween ® 20, rouge de phénolConservateur : < 1,5% ProClin 3001 x 100 mLR9ChromogenTMBChromogène (prêt à l’emploi):3,3’,5,5’ tétraméthylbenzidine (< 0,1%),H 2 O 2 (

REMARQUE : Il est possible d’utiliser d’autres lots de Solution de Lavage (R2identifié 20x en vert), de Chromogène (R9 identifié TMB en turquoise) et deSolution d’Arrêt (R10 identifié 1N en rouge) que ceux fournis avec la trousse,sous réserve d’utiliser des réactifs strictement équivalents d’un seul et mêmelot au cours d’une même série..REMARQUE : Il n’est pas possible d’utiliser de Diluant (R7) provenantd’autres lots que celui fourni avec le coffret, de même qu’il n’est paspossible d’utiliser le Diluent (R7) fourni avec les coffrets Platelia ToxoIgM (Réf. 72841).REMARQUE : De plus, la Solution de Lavage (R2 identifié 20x en vert) peut êtremélangée avec l’une des deux autres Solutions de Lavage inclues dans lesdifférents kits réactifs Bio-Rad (R2 identifié 10x en bleu ou 10x en orange) etcorrectement reconstituées, à condition qu’un seul mélange soit utilisé aucours d’une même série.• Avant utilisation, attendre 30 minutes que les réactifs s’équilibrent à latempérature ambiante (+18-30°C).• Reconstituer ou diluer soigneusement les réactifs en évitant toutecontamination.• Ne pas réaliser le test en présence de vapeurs réactives (acides, alcalines,aldéhydes) ou de poussières qui pourraient altérer l’activité enzymatique duconjugué.• Utiliser de préférence du matériel à usage unique. A défaut, utiliser uneverrerie parfaitement lavée et rincée à l’eau distillée.• Le lavage des cupules est une étape essentielle de la manipulation :respecter le nombre de cycles de lavages prescrit, et s’assurer que toutesles cupules sont complètement remplies, puis complètement vidées. Unmauvais lavage peut entraîner des résultats incorrects.• Ne pas laisser la microplaque sécher entre la fin des lavages et ladistribution des réactifs.• Ne jamais utiliser le même récipient pour distribuer le conjugué et la solutionde révélation.• La réaction enzymatique est très sensible à tous métaux ou ionsmétalliques. Par conséquent, aucun élément métallique ne doit entrer encontact avec les différentes solutions contenant le conjugué ou lechromogène.• Le Chromogène (R9) doit être incolore. L’apparition d’une coloration bleueindique que le réactif est inutilisable et doit être remplacé.• Utiliser un cône de distribution neuf pour chaque échantillon.• Vérifier l’exactitude des pipettes et le bon fonctionnement des appareilsutilisés.21

CONSIGNES D’HYGIENE ET DE SECURITELes composants d’origine humaine utilisés dans la préparation des réactifs ontété testés et trouvés non réactifs pour l’antigène de surface de l’hépatite B (AgHBs), les anticorps dirigés contre le virus de l’hépatite C (anti-VHC) et lesanticorps dirigés contre les virus de l’immunodéficience humaine (anti-VIH1 etanti-VIH2). Du fait qu’aucune méthode ne peut garantir de façon absoluel'absence d’agents infectieux, considérer les réactifs d’origine humaine ainsique tous les échantillons de patients comme potentiellement infectieux et lesmanipuler avec les précautions d'usage :• Considérer le matériel directement en contact avec les échantillons et lesréactifs d’origine humaine ainsi que les solutions de lavage comme desproduits contaminés.• Porter des gants à usage unique lors de la manipulation des réactifs et deséchantillons.• Ne pas pipeter à la bouche.• Eviter les éclaboussures d’échantillons ou de solutions les contenant.Nettoyer les surfaces souillées avec de l’eau de javel diluée à 10 %. Si leliquide contaminant est un acide, neutraliser au préalable les surfacessouillées avec du bicarbonate de soude, puis nettoyer à l’aide d’eau de javelet sécher avec du papier absorbant. Le matériel utilisé pour le nettoyagedevra être jeté dans un conteneur spécial pour déchets contaminés.• Eliminer les échantillons, les réactifs d’origine humaine ainsi que le matérielet les produits contaminés après décontamination :- soit par immersion dans de l’eau de javel à la concentration finale de 5 %d’hypochlorite de sodium pendant 30 minutes.- soit par autoclavage à 121°C pendant 2 heures minimum.ATTENTION : ne pas introduire dans l’autoclave des solutions contenantde l’hypochlorite de sodium• Eviter tout contact des réactifs, y compris ceux considérés comme nondangereux, avec la peau et les muqueuses.• La manipulation et l’élimination des déchets chimiques et biologiquesdoivent être faites selon les Bonnes Pratiques de Laboratoire.• Tous les réactifs de la trousse sont destinés au seul usage diagnostic invitro.Attention : certains réactifs contiennent du ProClin 300 < 1,5%R43 : Peut entraîner une sensibilisation par contact avec la peauS28-37 : Après contact avec la peau, se laver immédiatement etXi - Irritant abondamment avec de l’eau et du savon. Porter des gants appropriés6. ECHANTILLONS1. Les tests sont effectués sur des échantillons de sérum ou de plasmarecueilli sur anticoagulant de type EDTA, héparine ou citrate.22

2. Respecter les consignes suivantes pour le prélèvement, le traitement et laconservation de ces échantillons de sang :• Prélever un échantillon de sang selon les pratiques en usage.• Pour les sérums, laisser le caillot se former complètement avantcentrifugation.• Conserver les tubes fermés.• Après centrifugation, extraire le sérum ou le plasma et le conserver entube fermé.• Les échantillons seront conservés à +2-8°C si le test est effectué dansles 7 jours.• Si le test n’est pas effectué dans les 7 jours, ou pour tout envoi, leséchantillons seront congelés à -20°C (ou plus froid).• Il est recommandé de ne pas procéder à plus de 5 cycles de congélation /décongélation. Les échantillons devront être soigneusementhomogénéisés (Vortex) après décongélation et avant la réalisation dutest.3. Les résultats ne sont pas affectés par les échantillons contenant 90 g/ld’albumine ou 100 mg/l de bilirubine non conjuguée, les échantillonslipémiques contenant l’équivalent de 36 g/l de trioléïne (triglycéride) ou leséchantillons hémolysés contenant 10 g/l d’hémoglobine.4. Ne pas chauffer les échantillons.7. MODE OPERATOIRE7.1 Matériel nécessaire non fourni• Agitateur type Vortex.• Appareil de lecture pour microplaques équipé de filtres 450/620 nm (*).• Incubateur de microplaques pouvant être thermostaté à 37°C ± 1°C (*).• Système de lavage automatique, semi-automatique ou manuel pourmicroplaques (*).• Eau distillée ou désionisée stérile.• Gants à usage unique.• Lunettes de protection.• Papier absorbant.• Pipettes ou multipipettes, automatiques ou semi- automatiques, réglablesou fixes, pouvant mesurer et délivrer 10 µl à 1000 µl, 1 ml, 2 ml et 10 ml.• Eprouvettes graduées de 25 ml, 50 ml, 100 ml et 1000 ml.• Hypochlorite de sodium (eau de javel) et bicarbonate de sodium.• Conteneur de déchets contaminés.• Tubes à usage unique(*) Nous consulter pour une information précise concernant les appareilsvalidés par nos services techniques.23

7.2 Reconstitution des réactifs• R1: Laisser revenir 30 minutes à température ambiante (+18-30°C) avantouverture du sachet. Sortir le cadre et replacer immédiatement les barrettesnon utilisées dans le sachet en vérifiant la présence du dessicant. Refermersoigneusement le sachet et le replacer à +2-8°C.• R2: Diluer au 1/20 la solution R2 avec de l’eau distillée : 50 ml de R2 dans950 ml d’eau distillée. On obtient ainsi la solution prête à l’emploi. Prévoir350 ml de solution de lavage diluée pour une plaque entière de 12 barrettesen lavage manuel.• R3, R4a, R4b, R4c : Diluer au 1/21 avec le Diluant (R7) (exemple : 300 µl deR7 + 15 µL de Calibrateur).• R6+R7: Le Conjugué R6 est présenté sous forme liquide concentré 51 fois.Homogénéiser avant utilisation. Diluer au 1/51 avec le Diluant (R7). Pour uneplaque complète, diluer extemporanément 0,5 ml de Conjugué (R6) dans25 ml de Diluant (R7). Diviser les volumes par 10 pour une barrette.7.3 Conservation et validité des réactifs ouverts et/ou reconstituésLa trousse doit être conservée à +2-8°C. Chaque élément de la trousseconservée avant ouverture à +2-8°C peut être utilisé jusqu’à la date depéremption indiquée sur le coffret.• R1: Après ouverture, les barrettes conservées dans le sachet correctementrefermé sont stables pendant 8 semaines à +2-8°C (vérifier la présence dudessicant).• R2: Après dilution, la Solution de Lavage se conserve 2 semaines à+2-30°C. Après ouverture et en l’absence de contamination, la Solution deLavage concentrée peut être conservée à +2-30°C jusqu’à la date indiquéesur l’étiquette.• R3, R4a, R4b, R4c, R6, R7: Après ouverture et en l’absence decontamination, les réactifs conservés à +2-8°C sont stables pendant8 semaines.• R6+R7: Après dilution, la solution de travail du conjugué est stable 8 heuresà température ambiante (+18-30°C) ou 2 semaines à +2-8°C.• R9: Après ouverture et en l’absence de contamination, le réactif conservé à+2-8°C est stable pendant 8 semaines.• R10: Après ouverture et en l’absence de contamination, le réactif conservéà +2-8°C est stable jusqu’à la date d’expiration indiquée sur l’étiquette.7.4 Mode opératoireSuivre strictement le protocole proposé et appliquer les Bonnes Pratiques deLaboratoire.Avant utilisation, laisser tous les réactifs revenir à température ambiante(+18-30°C).24

L’utilisation de puits sécables requiert une attention particulière lors de lamanipulation.Utiliser tous les calibrateurs à chaque mise en œuvre du dosage pour valider laqualité du test.1. Etablir soigneusement le plan de distribution et d’identification descalibrateurs et des échantillons de patients.2. Préparer la Solution de Lavage diluée (R2) [Se référer au chapitre 7.2].3. Sortir le cadre support et les barrettes (R1) de l’emballage protecteur[Se référer au chapitre 7.2].4. Dans des tubes identifiés individuellement, diluer les calibrateurs R3, R4a,R4b, R4c et les échantillons de patient à tester au 1/21 dans le Diluant (R7),soit 300 µl de Diluant (R7) puis 15 µl d’échantillon [Se référer au chapitre 7.2].Bien homogénéiser (Vortex).5. Distribuer dans chaque cupule 200µl des calibrateurs et des échantillonsdilués selon le schéma suivant :1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12A R3 S5 S13B R4a S6C R4b S7D R4c S8E S1 S9F S2 S10G S3 S11H S4 S126. Couvrir la microplaque d’un film adhésif en appuyant bien sur toute lasurface pour assurer l’étanchéité. Puis incuber immédiatement lamicroplaque au bain-marie thermostaté ou dans un incubateur sec demicroplaques pendant 1 heure ± 5 minutes à 37°C ± 1°C.7. Avant la fin de la première incubation, préparer la solution de travail duconjugué (R6+R7) [Se référer au chapitre 7.2].8. A la fin de la première incubation, retirer le film adhésif, aspirer le contenu detoutes les cupules dans un conteneur pour déchets contaminés (contenantde l’hypochlorite de sodium) et procéder à 4 lavages avec 350 µl de laSolution de Lavage (R2). Sécher les barrettes par retournement sur unefeuille de papier absorbant et taper légèrement afin d’éliminer la totalité dela Solution de Lavage.9. Distribuer immédiatement 200 µl de la solution de travail du conjugué(R6+R7) dans toutes les cupules. Agiter délicatement cette solution avantl’emploi.25

10. Couvrir la microplaque d’un film adhésif neuf en appuyant bien sur toute lasurface pour assurer l’étanchéité. Incuber la microplaque au bain-mariethermostaté ou dans un incubateur sec de microplaques pendant 1 heure± 5 minutes à 37°C ± 1°C.11. A la fin de la deuxième incubation, retirer le film adhésif, aspirer le contenude toutes les cupules dans un conteneur pour déchets contaminés(contenant de l’hypochlorite de sodium) et procéder à 4 lavages avec 350 µlde la Solution de Lavage (R2). Sécher les barrettes par retournement surune feuille de papier absorbant et taper légèrement afin d’éliminer la totalitéde la Solution de Lavage.12. Distribuer rapidement, et à l'abri de la lumière vive, 200 µl du Chromogène(R9) dans toutes les cupules. Laisser la réaction se développer àl’obscurité pendant 30 ± 5 minutes à température ambiante (+18-30°C).Lors de cette incubation, ne pas utiliser de film adhésif.13. Arrêter la réaction enzymatique en ajoutant 100 µl de la Solution d’Arrêt(R10) dans chaque cupule. Adopter la même séquence et le même rythmede distribution que pour la solution de révélation.14. Essuyer soigneusement le dessous des plaques. Lire la densité optique à450/620 nm à l’aide d’un lecteur de plaques dans les 30 minutes qui suiventl’arrêt de la réaction. Les barrettes doivent toujours être conservées à l’abride la lumière avant la lecture.15. S'assurer, avant la transcription des résultats, de la concordance entre lalecture et le plan de distribution des plaques et des échantillons.8. INTERPRETATION DES RESULTATS8.1 Etablissement de la courbe d’étalonnageLa présence et la quantité d’anticorps de classe IgG dirigés contre T. gondiidans l’échantillon testé sont déterminées en comparant la densité optique del’échantillon à une gamme étalon (DO = fonction UI/ml). Le dosage PlateliaToxo IgG est standardisé par rapport au WHO International Standard TOX-M.Bien que les calibrateurs utilisés dans cette trousse soient étalonnés vis-à-visdu sérum O.M.S., certaines discordances de titre pour un même échantillonpeuvent s'observer lorsqu’il est testé par différentes techniques sérologiques.Cette discordance est due au fait que les antigènes toxoplasmiques utilisésdans ces différentes techniques ont des proportions variables d’antigènesmembra-naires et solubles.Tracer la courbe d’étalonnage [DO = fonction (UI/ml)] en reportant sur l’axevertical (axe des Y) les DO des calibrateurs R3, R4a, R4b et R4c puis enreportant sur l’axe horizontal (axe des X) leur concentration respective enUI/ml. Pour chaque échantillon testé, calculer le titre en anticorps IgG anti-T. gondii en déterminant à partir de la courbe d’étalonnage ainsi tracée laconcentration correspondante à la DO mesurée.26

NB : si la densité optique obtenue pour un échantillon dilué au 1/21è estsupérieure à la densité optique de R4c de la gamme étalon, cet échantillondoit être dilué au 1/210è dans le diluant R7 et être retesté; pour calculer letitre de ce sérum dilué au 1/210è, multiplier par 10 les UI/ml obtenues surl’axe de X.8.2 Validation de l'essaiAnalyser les résultats de DO obtenus avec les calibrateurs sur chaquemicroplaque et pour chaque série. Pour valider la manipulation, les critèressuivants doivent être respectés :• Valeurs des densités optiques :DO R4a ≥ 0,200DO R4b ≥ 0,400• Rapports des densités optiques :DO R4a / DO R3 ≥ 5,00DO R4b / DO R4a ≥ 2,20DO R4c / DO R4b ≥ 1,15Si ces critères ne sont pas respectés, recommencer la manipulation.8.3 Interprétation des résultatsTitre en anticorps IgGanti-T. gondii(Unités Internationales/ml)Titre < 6 UI/ml6 UI/ml ≤ Titer< 9 UI/mlRésultatInterprétationNégatif Un résultat négatif ou douteux indique l’absenced’immunité acquise mais ne permet pasd’exclure une infection récente. Si uneDouteux contamination du patient est suspectée, unsecond prélèvement doit être analysé environdeux semaines plus tard.Titre ≥ 9 UI/ml Positif Un résultat positif est le plus souvent le témoind’une infection ancienne. Cependant, uneinfection récente ne peut être exclue, notammenten présence d’anticorps IgM anti-T. gondii.Une plus forte variation des titres peut être observée au delà d’uneconcentration de 200 UI/ml.8.4 Expertise des causes d’erreurL’origine des réactions non validées ou non reproductibles est souvent enrelation avec les causes suivantes :• Lavage insuffisant des microplaques.• Contamination des échantillons négatifs par un sérum ou un plasmacontenant un titre élevé d’anticorps.27

• Contamination ponctuelle de la solution de révélation par des agentschimiques oxydants (eau de javel, ions métalliques...).• Contamination ponctuelle de la Solution d’Arrêt.9. PERFORMANCESLes performances du kit Platelia TOXO IgG ont été évaluées sur 2 sites surun total de 1310 échantillons provenant de femmes enceintes et de donneursde sang. Sur un site, une étude de concordance a été réalisée vis-à-vis du testPlatelia Toxo IgG TMB (72741) utilisé en manuel. Sur le deuxième site, lesperformances ont été évaluées par rapport au test Platelia Toxo IgG TMB(72741) adapté sur analyseur automatisé de microplaques. De plus, lesperformances du kit Platelia Toxo IgG ont été évaluées sur 47 échantillonsde sang de cordon.9.1 PrévalenceLa prévalence des IgG anti-Toxoplasma gondii mesurée à l’aide du testPlatelia Toxo IgG a été estimée sur un panel de 538 échantillons provenantessentiellement de femmes enceintes suivies pendant leur grossesse et issuesde la région parisienne (France). 128 échantillons se sont révélés positifs pourla présence d’anticorps IgG anti-toxoplasmose. La prévalence mesurée àl’aide du kit Platelia Toxo IgG s’établit donc à 23.8% (128/538).9.2 Etude de concordance (Site 1)Les performances du kit Platelia Toxo IgG ont été déterminées sur un panelde 745 échantillons se répartissant comme suit :• 606 sérums issus de donneurs de sang• 139 sérums issus de femmes enceintesLes résultats ont été comparés à ceux obtenus à l’aide du test Platelia ToxoIgG TMB (72741) pris comme référence.PlateliaToxo IgG(72840)Platelia Toxo IgG TMB (72741)Négatif Douteux* Positif TotalNégatif 365 0 0 365Douteux* 0 2 0 2Positif 0 0 378 378Total 365 2 378 745• Concordance globale : 743/743 100,0% [IC 95% = 99,5% - 100,0%]• Spécificité relative : 365/365 100,0% [IC 95% = 99,0% - 100,0%]• Sensibilité relative : 378/378 100,0% [IC 95% = 99,0% - 100,0%]* les échantillons douteux ont été exclus des calculs de sensibilité, de spécificité et de concordance[IC95%] = Intervalle de confiance à 95%28

9.3 Performances (Site 2)Une étude prospective a été réalisée sur 538 échantillons provenantessentiellement de femmes enceintes et testés dans le cadre de la routine dulaboratoire. Ces échantillons ont été testés en parallèle avec le test PlateliaToxo IgG et avec le test Platelia Toxo IgG TMB (72741). De plus, tous leséchantillons de patients inconnus dans la base de donnée du laboratoire etdont le titre est inférieur à 100 UI/ml sont contrôlés par une seconde technique :• Agglutination sensibilisée (antigène du laboratoire : T. gondii, souche RH)pour les sérums dont le titres est > 10 UI/ml.• Immunofluorescence Indirecte (antigène du laboratoire : T. gondii, soucheRH) pour les sérums dont le titre est compris entre 3 et 10 UI /ml.Les résultats ont été comparés à ceux obtenus à l’aide du test Platelia ToxoIgG TMB (72741) pris comme référence.PlateliaToxo IgG(72840)Platelia Toxo IgG TMB (72741)Négatif Douteux* Positif TotalNégatif 406 1 0 407Douteux* 3 0 0 3Positif 7 10 111 128Total 416 11 111 538• Concordance globale : 517/524 98,7% [IC 95% = 97,3% - 99,5%]• Spécificité relative : 406/413 98,3% [IC 95% = 96,5% - 99,3%]• Sensibilité relative : 111/111 100,0% [IC 95% = 96,8% - 100,0%]* les échantillons douteux ont été exclus des calculs de sensibilité, de spécificité et de concordance[IC95%] = Intervalle de confiance à 95%Les 7 échantillons positifs discordants avec la trousse Platelia Toxo IgG onttous été confirmés positifs avec les techniques complémentaires utilisées aulaboratoire (Agglutination sensibilisée, Immunofluorescence Indirecte).Par ailleurs, 9 profils de séroconversions comportant chacun 3 échantillons ontégalement été testés avec les tests Platelia Toxo IgG (72840) et PlateliaToxo IgG TMB (72741). Pour chaque profil, le premier échantillon était négatifen anticorps anti-Toxoplasmosa gondii IgG et IgM.Les 2 tests ont donné des résultats comparables pour 8 des 9 profils deséroconversion. Pour l’un des profils, le 2ème sérum de séroconversion s’estavéré positif avec le test Platelia Toxo IgG et douteux avec le test PlateliaToxo IgG TMB.29

9.4 Performances sur échantillon de sang de cordon47 échantillons de sang de cordon ont été testés à l’aide du protocole décritau paragraphe 7.4 (dilution échantillon au 1/21) :• 22 échantillons issus de toxoplasmoses congénitales confirmées• 18 échantillons issus d’infections maternelles anciennes• 7 échantillons sans infection.Tous les échantillons d’infections congénitales ou anciennes ont été trouvéspositifs avec la trousse Platelia Toxo IgG (72840), et parmi eux, tous leséchantillons d’infections anciennes étaient négatifs avec la trousse PlateliaToxo IgM (72841). Les 7 échantillons sans infection ont été confirmés négatifs.Platelia Toxo IgG (72840) Platelia Toxo IgM (72841)Positif Douteux Négatif Positif Douteux NégatifToxoplasmosecongénitale(n=22)Infection maternelleancienne (n=18)Absence d’infection(n=7)22 0 0 18 2 218 0 0 0 0 180 0 7 0 0 7309.5 Réactivité croiséeUn panel de 197 échantillons comprenant 159 échantillons positifs pour lesmarqueurs Rubéole, CMV, EBV, HSV, VZV, oreillons, rougeole et HIV, et38 échantillons positifs en facteurs rhumatoïdes, auto-anticorps et anticorpshétérophiles ont été testés à l’aide des test Platelia Toxo IgG (72840) etPlatelia Toxo IgG TMB (72741).141 échantillons ont été trouvés négatifs avec le test Platelia Toxo IgG,55 échantillons se sont révélés positifs et 1 échantillon a été trouvé douteux.Tous les échantillons positifs ont également été trouvés positifs avec le testPlatelia Toxo IgG TMB.9.6 Précision• Précision intra-essai (répétabilité) :Afin d'évaluer la répétabilité intra-essai, un échantillon négatif et troiséchantillons positifs ont été testés à 32 reprises dans une même série. Laconcentration (UI/ml) a été déterminée pour chaque échantillon. La moyennedes concentrations (UI/ml), la déviation standard (DS) et le coefficient devariation (%CV) pour chaque échantillon sont donnés dans le tableau suivant.

Précision intra-essai (répétabilité)N=32EchantillonnégatifEchantillonpositif faibleTitre (UI/ml)Echantillonpositif moyenEchantillonpositif fortMoyenne 0,15 16,0 39,8 167,5DS 0,01 2,3 2,7 23,1% CV 7,2% 14,4% 6,9% 13,8%• Précision inter-essai (reproductibilité) :Afin d'évaluer la reproductibilité inter-essai, les quatre échantillons (un négatifet trois positifs) ont chacun été testés en duplicate, dans deux séries par jour,sur une période totale de 20 jours. La concentration (UI/ml) a été déterminéepour chaque échantillon. La moyenne des concentrations (UI/ml), la déviationstandard (DS) et le coefficient de variation (%CV) pour chaque échantillon sontdonnés dans le tableau suivant.Précision inter-essai (reproductibilité)N=80EchantillonnégatifEchantillonpositif faibleTitre (UI/ml)Echantillonpositif moyenEchantillonpositif fortMoyenne 0,15 15,2 41,7 166,5DS 0,05 2,4 4,2 21,0% CV 32,6% 15,5% 10,1% 12,6%9.7 Exactitude et linéaritéPour démontrer l’exactitude de la calibration plusieurs dilutions du StandardInternational OMS TOX-M ont été testées. Les résultats montrent que le testPlatelia Toxo IgG est parfaitement calibré au Standard International OMSTOX-M pour des valeurs allant jusqu’à 30 UI/ml. Au delà, les valeurs trouvéessont sous-estimées d’un facteur allant de 25 à 50%.Le domaine de linéarité du dosage Platelia Toxo IgG a été établi entre 7 et200 UI/ml à partir d’études de dilutions réalisées sur 5 échantillons positifs.10. LIMITES D’UTILISATIONLe diagnostic d’infection par le virus T. gondii ne peut être définitivement établique sur un ensemble de données cliniques et biologiques. Le résultat d’unseul test de titrage des anticorps IgG anti-T. gondii ne constitue pas en soi unepreuve suffisante pour poser le diagnostic d’infection récente par le virusT. gondii.31

• Seul un ensemble de données cliniques et biologiques (augmentationsignificative du titre des IgG anti-T. gondii entre 2 sérums issus d’un mêmepatient prélevés à 3 semaines d’intervalle et testés au cours d’un seuldosage, présence d’IgM anti-T. gondii à un taux significatif et mise enévidence d’une avidité faible des IgG anti-T. gondii permet le diagnosticd’une infection récente par le parasite.• La seule présence d’IgM anti-T. gondii ne permet pas de conclure à uneinfection récente évolutive en raison d’une possible persistance des IgMplusieurs mois, voire plusieurs années, après l’infection. Lorsque des IgMsont détectés, une détermination quantitative du titre en anticorps IgG anti-T. gondii devra être réalisée, de même qu’un suivi de l’évolution de laréponse en anticorps anti-T. gondii du patient sur au moins un deuxièmeprélèvement réalisé 3 semaines plus tard.• Si le prélèvement est effectué trop précocement lors d’une primo-infectiondébutante, les anticorps IgM anti-T. gondii peuvent ne pas être encoreprésents. En cas de doute, un second prélèvement doit être effectué3 semaines plus tard sur lequel la recherche des IgM sera répétée.11. CONTROLE QUALITE DU FABRICANTTous les produits fabriqués et commercialisés par la société Bio-Rad sontplacés sous un système d’assurance qualité de la réception des matièrespremières jusqu’à la commercialisation des produits finis. Chaque lot deproduit fini fait l’objet d’un contrôle de qualité et n’est commercialisé que s’ilest conforme aux critères d’acceptation. La documentation relative à laproduction et au contrôle de chaque lot est conservée par le fabricant.12. REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUESVoir version anglaise.32

PLATELIA TOXO IgG 7284096 PRUEBASDETECCIÓN CUANTITATIVA DE ANTICUERPOS IgGANTI-TOXOPLASMA GONDII EN SUERO O PLASMAHUMANO POR MÉTODO INMUNOENZIMÁTICO

1. CAMPO DE APLICACIÓNPlatelia Toxo IgG es una prueba inmunoenzimática de tipo ELISA indirectopara la detección cuantitativa de anticuerpos IgG anti-T. gondii en suero oplasma humano.2. INTERÉS CLÍNICOT. gondii es un protozoario capaz de infectar a numerosas especies demamíferos y pájaros. Estas infecciones, habituales en el hombre y en losanimales, se desarrollan generalmente de forma inapreciable desde el puntode vista clínico. La prevalencia de esta infección en la población, detectadapor la presencia de anticuerpos específicos en el suero, varía en función de laregión y de la edad.En caso de una primoinfección de la madre durante el embarazo, estainfección puede provocar graves secuelas en el feto (en especial, unaalteración de las funciones cerebrales) o un aborto. La inmunidad antigua de lamadre, demostrada mediante la presencia de anticuerpos IgG al inicio delembarazo, protege al feto de la infección por este parásito.La segunda población sensible a esta infección está representada porlospacientes inmunodeprimidos, como los enfermos afectados de SIDA. Estasinfecciones se deben, casi exclusivamente, a una infección a partir de un focoparasitario (quiste) quiescente del paciente, cuya existencia es previa a lainfección por el virus HIV.El diagnóstico de la infección toxoplásmica se confirma con la demostraciónde la presencia del parásito, pero su búsqueda mediante el examen directo esdifícil, por no decir aleatorio. La serología representa la base del diagnóstico ydel seguimiento de la toxoplasmosis. La presencia de anticuerpos específicospermite confirmar una contaminación por T. gondii; el estudio combinado delos anticuerpos pertenecientes a diferentes isotipos permite, generalmente,fechar la infección y orientar la terapéutica en caso de infección reciente, oestablecer medidas profilácticas adecuadas al riesgo de aparición de unatoxoplasmosis: medidas higiénico-dietéticas en mujeres embarazadas que nopresenten anticuerpos, quimiofilaxia en los sujetos inmunodeprimidosseropositivos para T. gondii.3. PRINCIPIOPlatelia Toxo IgG es una prueba que permite la detección cuantitativa de losanticuerpos IgG anti-T. gondii en suero o plasma humano mediante un métodoinmunoenzimático de fase sólida, conocido como "ELISA indirecto".Se utilizan antígenos de T. gondii inactivados para sensibilizar la microplaca.Se utiliza como conjugado un anticuerpo monoclonal marcado con peroxidasay específicamente dirigido contra las cadenas gamma humanas (anti-IgG). Laaplicación de la prueba consta de las etapas siguientes:34

• Etapa 1Las muestras a estudiar y los controles se diluyen en proporción 1/21 y sedepositan en los pocillos de la microplaca. Durante la incubación de 1 hora a37ºC, las IgG anti-T. gondii presentes en la muestra se unen al antígeno deT. gondii fijado a los pocillos de la microplaca. Las IgG no específicas deT. gondii y el resto de las proteínas séricas son eliminadas mediante lavados alfinal de la incubación.• Etapa 2Se coloca el conjugado (anticuerpo monoclonal específico de las cadenasgamma humanas marcado con la peroxidasa) en todos los pocillos de lamicroplaca. Durante esta incubación de 1 hora a 37ºC, el anticuerpo marcadose une a las IgG séricas que han reaccionado con el antígeno T. gondii. Elconjugado que no se une es eliminado mediante lavados al final de laincubación.• Etapa 3La presencia de los complejos (Ag T. gondii, IgG anti-T. gondii, conjugado anti-IgG) que se forman eventualmente es revelada mediante la adición de unasolución enzimática de revelado en cada pocillo.• Etapa 4Tras incubación a temperatura ambiente (+18-30ºC) la reacción enzimática sedetiene mediante la adición de una solución de ácido sulfúrico 1N. Ladensidad óptica leída a 450/620 nm es proporcional a la cantidad de IgG anti-T. gondii presente en la muestra probada. La densidad óptica es convertida enIU/ml usando una curva standard calibrada según WHO International StandardTOX-M.4. COMPOSICIÓN DEL KITLos reactivos son suministrados en cantidad suficiente para realizar96 determinaciones. Todos los reactivos están destinados para utilizarseúnicamente en el diagnóstico in vitro.Etiquetado Naturaleza de los reactivos PresentaciónR1 Microplate Microplaca : (lista para usar):112 tiras de 8 pocillos separables, sensibilizadascon el antígeno T. gondii inactivadoR2 Concentrated Solución de lavado (20x):1 x 70 mLWashingSolution (20x)TRIS-NaCl (pH 7,4), 2% Tween ® 20.Conservante: < 1,5% ProClin 300R3 Calibrator 0 Calibrador 0:Suero humano negativo a IgG anti-T. gondii,a antígeno HBs y a anticuerpos anti-VIH1,anti-VIH2 y anti-VHCConservante: < 1,5% ProClin 3001 x 0,75 mL35

Etiquetado Naturaleza de los reactivos PresentaciónR4a Calibrator 6 Calibrador 6 UI/ml:1 x 0,75 mLSuero humano reactivo a las IgG anti-T. gondii,y negativo al antígeno HBs y a anticuerpos anti-VIH1, anti-VIH2 y anti-VHCConservante: < 1,5% ProClin 300R4b Calibrator 60 Calibrador 60 UI/ml:1 x 0,75 mLSuero humano reactivo a las IgG anti-T. gondii,y negativo al antígeno HBs y a anticuerpos anti-VIH1, anti-VIH2 y anti-VHCConservante: < 1,5% ProClin 300R4c Calibrator 240 Calibrador 240 UI/ml:1 x 0,75 mLSuero humano reactivo a las IgG anti-T. gondii,y negativo al antígeno HBs y a anticuerpos anti-VIH1, anti-VIH2 y anti-VHCConservante: < 1,5% ProClin 300R6 Conjugate Conjugado (51x):1 x 0,7 mL(51x) Anticuerpo monoclonal de origen múrido anticadenasgamma humanas, acoplado a laperoxidasaConservante: < 1,5% ProClin 300R7 Diluent Diluyente para muestras y conjugado (listopara usar): Tris-NaCl (pH 7,7), glicerol,0,1% de Tween ® 20 y rojo de fenolConservante: < 1,5% ProClin 3001 x 100 mLR9ChromogenTMBCromógeno (listo para usar):3.3’.5.5’ tetrametilbencidina (< 0,1%),H 2 O 2 (

OBSERVACIÓN: Es posible utilizar otros lotes de solución de lavado (R2identificado 20x en color verde), de cromógeno (R9 identificado TMB encolor turquesa) y de solución de parada (R10 identificado 1N en color rojo)que los que se suministran en el kit, a condición de utilizar reactivosestrictamente equivalentes de un mismo y único lote en el transcurso deuna misma serie.OBSERVACIÓN: No es posible usar Diluyente (R7) de otros lotes que nosean los incluidos en el kit, además tampoco es posible utilizar elDiluyente (R7) suministrados con Platelia Toxo IgM kits (Ref. 72841).OBSERVACIÓN: Además, la Solución de Lavado (R2, identificación en laetiqueta: 20X color verde) se puede mezclar con las otras 2 soluciones delavado incluidas en los distintos kits de reactivos de Bio-Rad (R2,identificaciones en la etiqueta : 10X color azul o 10X color naranja) cuandose reconstituyen debidamente, siempre que se use sólo una mezcla encada tanda de pruebas.• Antes de utilizar, esperar 30 minutos a que los reactivos adquieran latemperatura ambiente (+18-30°C).• Reconstituir o diluir minuciosamente los reactivos, evitando cualquiercontaminación.• No realizar el test en presencia de vapores reactivos (ácidos, alcalinos,aldehídos) o de polvos que pudieran alterar la actividad enzimática delconjugado.• Utilizar preferentemente material de un solo uso. En su defecto, utilizarartículos de cristal lavados y enjuagados con agua destilada.• El lavado de las cúpulas de los pocillos es una etapa esencial de lamanipulación: respetar el número de ciclos de lavado prescrito y asegurarsede que todas las cúpulas se rellenan perfectamente y luego se vacían porcompleto. Un mal lavado puede provocar resultados incorrectos.• No dejar secar la microplaca entre el final de los lavados y la distribución delos reactivos.• No utilizar nunca el mismo recipiente para distribuir el conjugado y lasolución reveladora.• La reacción enzimática es muy sensible a todos los metales o ionesmetálicos. Por consiguiente, ningún elemento metálico debe entrar encontacto con las diferentes soluciones que contienen el conjugado o elcromógeno.• El cromógeno (R9) debe ser incoloro. La aparición de un color azul indicaque el reactivo no es utilizable y debe reemplazarse.• Utilizar un cono de distribución nuevo para cada muestra.• Comprobar la exactitud de las pipetas y el correcto funcionamiento de losaparatos utilizados.37

INSTRUCCIONES DE HIGIENE Y SEGURIDADLos componentes de origen humano que se utilizan en la preparación de losreactivos se han sometido a tests y han resultado no reactivos para elantígeno de superficie de la hepatitis B (Ag HBs), los anticuerpos dirigidoscontra el virus de la hepatitis C (anti-VHC) y los anticuerpos dirigidos contralos virus de la inmunodeficiencia humana (anti-VIH1 y anti-VIH2).Dado que ningún método es capaz de garantizar de manera absoluta laausencia de agentes infecciosos, ha que considerar los reactivos de origenhumano y las muestras de los pacientes como potencialmente infecciosos ymanipularlos con las precauciones habituales:• Considerar el material que está directamente en contacto con las muestrasy los reactivos de origen humano así como las soluciones de lavado, comoproductos contaminados.• Utilizar guantes de un solo uso para manipular reactivos y muestras.• No pipetear con la boca.• Evitar las salpicaduras de muestras o de soluciones que las contengan.Limpiar las superficies manchadas con lejía diluida al 10%. Si el líquidocontaminante es un ácido, neutralizar previamente con bicarbonato sódicolas superficies manchadas y a continuación limpiar con lejía y secar conpapel absorbente. El material utilizado para la limpieza deberá desecharseen un contenedor especial para desechos contaminados.• Eliminar las muestras, los reactivos de origen humano y el material y losproductos contaminados después de su descontaminación:- ya sea mediante inmersión en lejía a una concentración final de 5% dehipoclorito de sodio durante 30 minutos.- o bien mediante autoclave a 121ºC durante al menos 2 horas.CUIDADO: no introducir en el autoclave soluciones que contenganhipoclorito de sodio.• Evitar todo contacto de los reactivos, incluidos los considerados como nopeligrosos, con la piel y las mucosas.• La manipulación y la eliminación de desechos químicos y biológicos debenhacerse siguiendo las Buenas Prácticas de Laboratorio.• Todos los reactivos del kit están destinados a un solo uso diagnóstico in vitro.Cuidado: ciertos reactivos contienen ProClin 300 < 1.5%R43: Puede provocar una sensibilización por contacto con la piel.S28-37: Después del contacto con la piel, lavarse de inmediato yXi - Irritante abundantemente con agua y jabón. Utilizar guantes adecuados.6. MUESTRAS1. Las pruebas se realizan sobre muestras de suero o de plasma recogidosobre anticoagulante de tipo EDTA, heparina o citrato.38

2. Respetar las instrucciones siguientes para la extracción, el tratamiento y laconservación de las muestras de sangre:• Extraer una muestra de sangre siguiendo las prácticas en uso.• Para los sueros, dejar que se forme el coágulo totalmente antes decentrifugar.• Conservar los tubos cerrados.• Después de la centrifugación, extraer el suero o el plasma y conservarloen tubo cerrado.• Si la prueba se realiza en el plazo de 7 días, las muestras se conservarána +2-8°C.• Si la prueba no se realiza en el plazo de 7 días, o para cualquier envío, lasmuestras se congelarán a -20°C (o más frío).• Se recomienda no proceder a más de 3 ciclos de congelación/ descongelación.Las muestras deberán homogeneizarse minuciosamente(vórtex) después de descongelar y antes de realizar la prueba.3. Los resultados no se ven afectados por muestras que contengan 90 g/l dealbúmina o 100 mg/l de bilirrubina no conjugada, las muestras lipémicasque contengan el equivalente de 36 g/l de trioleína (triglicérido) o muestrashemolizadas que contengan 10 g/l de hemoglobina.4. No calentar las muestras.7. MODO DE ACTUACIÓN7.1 Material necesario no suministrado• Agitador tipo vórtex.• Lector de microplacas equipado con filtros 450/620 nm (*).• Incubador de microplacas que admite termostato a 37±1°C (*).• Sistema de lavado automático, semiautomático o manual para microplacas (*).• Agua destilada o desionizada estéril.• Guantes de un solo uso.• Gafas de protección.• Papel absorbente.• Pipetas o multipipetas, automáticas o semiautomáticas, ajustables o fijas,que pueden medir de 10 µl a 1.000 µl, y 1 ml, 2 ml y 10 ml.• Probetas graduadas de 25 ml, 50 ml, 100 ml y 1.000 ml.• Hipoclorito de sodio (lejía) y bicarbonato de sodio.• Contenedor de desechos contaminados.• Tubos de un solo uso.(*) Para obtener una información más detallada sobre los aparatos validadospor nuestros servicios técnicos, consúltennos.39

7.2 Reconstitución de los reactivos• R1: Esperar 30 minutos a que adquiera la temperatura ambiente (+18-30°C)antes de abrir la bolsa. Sacar el soporte y volver a poner inmediatamente enla bolsa las tiras no utilizadas, comprobando que esté presente el secante.Volver a cerrar minuciosamente la bolsa y poner de nuevo a +2-8°C.• R2: Diluir a 1/20 la solución R2 con agua destilada: 50 ml de R2 en 950 mlde agua destilada. Se obtiene de este modo la solución lista para usar.Tener previstos 350 ml de solución de lavado diluida para una placa enterade 12 tiras en modo de lavado manual.• R3, R4a, R4b, R4c: Diluir a 1/21 en el diluyente (R7) (ejemplo: 15 µL R3 +300µL R7)• R6+R7: El conjugado R6 se presenta en forma líquida concentrado51 veces. Homogeneizar antes de usar. Diluir a 1/51 en el diluyente (R7).Para una placa completa diluir en el momento en que se necesite 0,5 ml deconjugado (R6) en 25 ml de diluyente (R7). Dividir los volúmenes por10 para una tira.7.3 Conservación y validez de los reactivos abiertos y/o reconstituidosEl kit debe conservarse a +2-8°C. Cada elemento del kit conservado a +2-8°Cantes de la apertura puede utilizarse hasta la fecha de caducidad indicada enel envase.• R1: Después de abrir, las tiras conservadas correctamente de nuevo en labolsa cerrada permanecen estables durante 8 semanas a +2-8°C(comprobar que esté presente el secante).• R2: Después de la dilución, la solución de lavado se conserva 2 semanas a+2-30°C. Después de abrir y si no hay presencia de contaminación, lasolución de lavado concentrada puede conservarse a +2-30°C hasta lafecha indicada en la etiqueta.• R3, R4a, R4b, R4c, R6, R7: Después de abrir y si no hay presencia decontaminación, los reactivos conservados a +2-8°C son estables durante8 semanas .• R6+R7: Después de diluir, la solución de trabajo del conjugado es estable8 horas a temperatura ambiente (+18-30°C) o 2 semanas a +2-8°C.• R9: Después de abrir y si no hay presencia de contaminación, el reactivoconservado a +2-8°C es estable durante 8 semanas.• R10: Después de abrir y si no hay presencia de contaminación, el reactivoconservado a +2-8°C es estable hasta la fecha de caducidad indicada en laetiqueta.7.4 Modo de actuaciónSeguir al pie de la letra el protocolo propuesto y aplicar las Buenas Prácticasde Laboratorio.40

Antes de usar, esperar a que todos los reactivos se pongan a temperaturaambiente (+18-30°C).El uso de pocillos frágiles requiere especial cuidado durante la manipulación.Utilizar todos los calibradores en cada dosificación para validar la calidad de laprueba.1. Establecer cuidadosamente el plan de distribución y de identificación de loscalibradores y de las muestras de pacientes.2. Preparar la solución de lavado diluida (R2) [Consultar el Capítulo 7.2].3. Sacar el soporte y las tiras (R1) del envase protector [Consultar el Capítulo7.2].4. Disolver los calibradores R4a, R4b, R4c y las muestras de pacientes asometer a prueba (S1, S2, etc.) a 1/21 en el diluyente (R7), es decir 15 µL demuestra y 300µL de diluyente (R7) [Consultar el Capítulo 7.2]. Homogeneizarcorrectamente (vórtex).5. Distribuir en cada cúpula 200 µl de los calibradores y de las muestrasdiluidas según el esquema siguiente:1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12A R3 S5 S13B R4a S6C R4b S7D R4c S8E S1 S9F S2 S10G S3 S11H S4 S126. Cubrir la microplaca con una película adhesiva apoyando bien sobre toda lasuperficie para garantizar la estanqueidad, a continuación incubarinmediatamente la microplaca al baño maría con termostato o en unaincubadora seca de microplacas durante 1 hora ± 5 minutos a 37°C ± 1°C.7. Antes de que finalice la primera incubación, preparar la solución de trabajodel conjugado (R6+R7) [Consultar el Capítulo 7.2].8. Al final de la primera incubación, retirar el film adhesivo, aspirar el contenidode todos los pocillos en un contenido para desechos contaminados (quecontienen hipoclorito de sodio) y proceder a 4 lavados con 350 µl de lasolución de lavado (R2). Secar las tiras empapándolas en una hoja de papelabsorbente y golpear ligeramente para eliminar la totalidad de la soluciónde lavado.41

9. Distribuir inmediatamente 200 µl de la solución de trabajo del conjugado(R6+R7) en todas los pocillos. Agitar delicadamente esta solución antes deusarla.10. Tapar la microplaca de un film adhesivo apoyando bien sobre toda lasuperficie para garantizar la estanqueidad. Incubar la microplaca al bañomaría con termostato o en una incubadora seca de microplacas durante1 hora ± 5 minutos a 37°C ± 1°C.11. Al final de la primera incubación, retirar el film adhesivo, aspirar el contenidode todas las cúpulas en un contenido para desechos contaminados (quecontienen hipoclorito de sodio) y proceder a 4 lavados con 350 µl de lasolución de lavado (R2). Secar las tiras empapándolas en una hoja de papelabsorbente y golpear ligeramente para eliminar la totalidad de la soluciónde lavado.12. Distribuir rápidamente, y al abrigo de la luz fuerte, 200 µl del cromógeno(R9) en todos los pocillos. Dejar la reacción desarrollarse en la oscuridaddurante 30 ± 5 minutos a temperatura ambiente (+18-30°C). Durante estaincubación, no utilizar el film adhesivo.13. Detener la reacción enzimática añadiendo 100 µl de la solución de parada(R10) en cada cúpula. Adoptar la misma secuencia y el mismo ritmo dedistribución que para la solución de revelado.14. Secar minuciosamente la parte de abajo de las placas. Leer la densidadóptica a 450/620 nm con ayuda de un lector de placas en los 30 minutosque siguen a la parada de la reacción. Las tiras deben conservarse siempreal abrigo de la luz antes de la lectura.15. Asegurarse, antes de la transcripción de los resultados, de la concordanciaentre la lectura y el plan de distribución de las placas y de las muestras.8. CÁLCULO E INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS428.1 Establecimiento de la curva estándarLa presencia y la cantidad de anticuerpos de clase IgG dirigidos contraT. gondii en la muestra ensayada se determinan comparando la densidadóptica de la muestra con una escala de calibrado. Los sueros estándares R4a,R4b, R4c se calibran respecto al patrón WHO International Standard TOX-M.Aunque los sueros estándares utilizados en este kit estén calibrados respectoal suero de la O.M.S., pueden observarse ciertas discordancias de título paraun mismo suero cuando se ensaya con diferentes técnicas serológicas. Estadiscor-dancia se debe a que los antígenos toxoplásmicos utilizados en estasdiferentes técnicas tienen proporciones variables de antígenos membranares ysolubles.Trazar la curva estándar [DO = función (UI/ml)] representando las lecturas deDO de los calibradores R3, R4a, R4b, R4c en el eje vertical (Y) y su respectivaconcentración en UI/ml en el eje horizontal (X). Para cada muestra analizada,

calcular el título de anticuerpos IgG anti-T. gondii determinando a partir de lacurva estándar trazada la concentración correspondiente a la DO medida.NOTA : si la densidad óptica obtenida para una muestra diluida a 1/21 es superiora la densidad óptica de R4c de la escala patrón, esa muestra debe diluirse a1/210 en el diluyente R7 y volverse a ensayar; para calcular el título de ese suerodiluido a 1/210, multiplicar por 10 las UI/ml obtenidas en el eje de las X.8.2 Validación del ensayoAnalizar los resultados de DO obtenidos con los calibradores en cadamicroplaca y para cada serie. Para validar la manipulación, hay que respetarlos criterios siguientes:• Valores de las densidades ópticas:DO R4a ≥ 0,200DO R4b ≥ 0,400• Informes de las densidades ópticas:DO R4a / DO R3 ≥ 5,00DO R4b / DO R4a ≥ 2,20DO R4c / DO R4b ≥ 1,15Si estos criterios no se cumplen, volver a empezar la manipulación.8.3 Interpretación de los resultadosTítulo de anticuerposanti-T. gondii ResultadoInterpretación(Unidades internacionales/ml)Título < 6 UI/ml Negativo Un resultado negativo o equívoco indica laausencia de inmunidad adquirida, pero nopuede descartarse una infección reciente. Si6 UI/ml ≤ Título< 9 UI/mlEquívocose sospecha que el paciente está infectado,debería analizarse una segunda muestra unasdos semanas más tarde.Título ≥ 9 UI/ml Positivo Un resultado positivo suele significar que seha pasado una infección. No obstante, nopuede descartarse una infección reciente,especialmente si existen anticuerpos IgManti-T. gondii.Puede observarse una variación elevada de los títulos en concentracionessuperiores a las 200 UI/ml.8.4 Posibles causas de errorEl origen de las reacciones no validadas o no reproducibles guarda a menudoen relación con las causas siguientes:• Lavado insuficiente de las microplacas.43

• Contaminación de las muestras negativas por un suero o un plasma quecontenga un título elevado de anticuerpos.• Contaminación puntual de la solución de revelado por agentes químicosoxidantes (lejía, iones metálicos, etc.).• Contaminación puntual de la solución de parada.9. RESULTADOSLos resultados de Platelia Toxo IgG fueron evaluados en 2 centros sobre untotal de 1310 muestras de mujeres embarazadas y donantes de sangre. Sobreun centro, se realizó un estudio de concordancia frente a la prueba PlateliaToxo IgG TMB (72741) de forma manual; sobre el segundo centro, losresultados se evaluaron con relación a la prueba Platelia Toxo IgG TMB(72741) usando un analizador automático de microplaca. Adicionalmente, seevaluaron los resultados del kit Platelia Toxo IgG sobre 47 muestras desangre de cordón.9.1 PrevalenciaLa prevalencia de anticuerpos IgG anti-Toxoplasma gondii con Platelia ToxoIgG se calculó sobre un panel de 538 muestras procedentes esencialmente demujeres embarazadas monitorizadas durante su embarazo y de la zona deParis (Francia). 128 muestras eran positivas en anticuerpos IgG anti-Toxoplasma. La prevalencia medida con el ensayo Platelia Toxo IgG estáestablecida en el 23,8 % (128/538).9.2 Estudio comparativo (centro 1)Las especificaciones del kit Platelia Toxo IgG se calculó sobre un panel de745 muestras dividas como sigue:• 606 sueros de donantes de sangre• 139 sueros de mujeres embarazadasLos resultados fueron evaluados frente a la prueba Platelia Toxo IgG TMB(72741) tomado como referencia.PlateliaToxo IgG(72840)Platelia Toxo IgG TMB (72741)Negativo Equívoco* Positivo TotalNegativo 365 0 0 365Equívoco* 0 2 0 2Positivo 0 0 378 378Total 365 2 378 745• Concordancia global : 743/743 100,0% [IC 95% = 99,5% - 100,0%]• Especificidad relativa : 365/365 100,0% [IC 95% = 99,0% - 100,0%]• Sensibilidad relativa : 378/378 100,0% [IC 95% = 99,0% - 100,0%]44* Los resultados equívocos no fueron incluidos para el cálculo de la sensibilidad, de la especificidady de la concordancia global[IC95%] = Intervalo de confianza del 95%

9.3 Especificaciones (centro 2)Se realizó un studio prospective sobre 538 muestras principalmente demujeres embarazadas monitorizadas durante su embarazo y analizadas en larutina del laboratorio. Estas muestras fueron analizadas en paralelo conPlatelia Toxo IgG y Platelia Toxo IgG TMB (72741). Por otro lado, todas lasmuestras de pacientes desconocidos de la base de datos del laboratorio quetenían un título por debajo de 100 UI/ml fueron controlados por un segundométodo:• Aglutinación sensible (Antígeno de Laboratorio: T. gondii, cepa RH) parasueros con título superior a > 10 UI/ml.• Inmuno-fluorescencia indirecta (Antígeno de laboratorio: T. gondii, cepa RH)para sueros con títulos entre 3 y 10 UI/ml.PlateliaToxo IgG(72840)Platelia Toxo IgG TMB (72741)Negativo Equívoco* Positivo TotalNegativo 406 1 0 407Equívoco* 3 0 0 3Positivo 7 10 111 128Total 416 11 111 538• Concordancia global : 517/524 98,7% [IC 95% = 97,3% - 99,5%]• Especificidad relativa : 406/413 98,3% [IC 95% = 96,5% - 99,3%]• Sensibilidad relativa : 111/111 100,0% [IC 95% = 96,8% - 100,0%]* Los resultados equívocos no fueron incluidos para el cálculo de la sensibilidad, de la especificidady de la concordancia global[IC95%] = Intervalo de confianza del 95%Las 7 muestras positivas discrepantes con Platelia Toxo IgG fueron todasconfirmadas positivas con métodos complementarios usados en el laboratorio(Aglutinación sensible, inmuno-fluorescencia indirecta)Además, 9 paneles de seroconversión incluyendo 3 muestras que tambiénhabían sido testadas con Platelia Toxo IgG (72840) and Platelia Toxo IgGTMB (72741). Para cada panel la primera muestra fué negativa para ambosanticuerpos IgG e IgM anti-Toxoplasma gondii.En 8 de los 9 paneles de seroconversión, ambos test dieron resultadossimilares. Para uno de los paneles, la seroconversión del 2º suero fue positivecon Platelia Toxo IgG, pero dudoso con Platelia Toxo IgG TMB.9.4 Resultados en muestras de sangre de cordón47 muestras de sangre de cordón se testaron utilizando el protocolo descritoen la sección 7.4 (dilución de muestra 1:21)• 22 muestras con toxoplasmosis congénita confirmada• 18 muestras de madres con toxoplasmosis anterior• 7 muestras sin infección.45

Todas las muestras de infección congénita o infección pasada fueron positivasusando Platelia Toxo IgG (72840), con todas las muestras de infecciónanterior los resultados fueron negativos con Platelia Toxo IgM (72841). Las7 muestras sin infección se confirmaron negativas.Platelia Toxo IgG (72840) Platelia Toxo IgM (72841)Toxoplasmosiscongénita(n=22)Infección anterior(n=18)Ausencia deinfección (n=7)Positivo Equívoco Negativo Positivo Equívoco Negativo22 0 0 18 2 218 0 0 0 0 180 0 7 0 0 79.5 Reactividad cruzadaSe analizó un panel de 197 muestras, incluidas 159 muestras positivas enrubéola, CMV, EBV, HSV, VZV, paperas, sarampión y VIH, y 38 muestraspositivas en factor reumatoide, auto-anticuerpos y anticuerpos heterófilos conPlatelia Toxo IgG (728’0) y Platelia Toxo IgG TMB (72741).141 muestras fueron negativas, 55 muestras fueron positivas y 1 fue dudosacon Platelia Toxo IgG. Todas las muestras positivas también lo fueron conPlatelia Toxo IgG TMB.9.6 Precisión• Precisión intra-análisis (repetibilidad):Con el fin de evaluar la repetibilidad intra-análisis, una muestra negativa y tresmuestras positivas han sido testadas en 32 ocasiones, en una misma serie. Sedeterminó la concentración (UI/ml) para cada muestra. En la siguiente tabla semuestran la media de concentraciones (UI/ml), la desviación estándar (DS) y elcoeficiente de variación (%CV) para cada una de las cuatro muestras:Precisión intra-análisis (repetibilidad)N=32MuestraNegativaMuestrapositiva débilMuestrapositivaConcentración (UI/ml)Muestrapositiva fuerteMedia 0.15 16.0 39.8 167.5DS 0.01 2.3 2.7 23.1% CV 7.2% 14.4% 6.9% 13.8%46

• Precisión inter- análisis (reproducibilidad) :Con el fin de evaluar la reproducibilidad inter-análisis, las cuatro muestras (unanegativa y tres positivas) se han evaluado cada una en duplicado, en dosseries al día, durante un periodo total de 20 días. Se determinó laconcentración (UI/ml) para cada muestra. En la siguiente tabla se muestran lamedia de concentraciones (UI/ml), la desviación estándar (DS) y el coeficientede variación (%CV) para cada una de las cuatro muestras:Precisión inter-análisis (reproducibilidad)N=80MuestraNegativaMuestrapositiva débilMuestrapositivaConcentración (IU/ml)Muestrapositiva fuerteMedia 0.15 15.2 41.7 166.5DS 0.05 2.4 4.2 21.0% CV 32.6% 15.5% 10.1% 12.6%9.7 Exactitud y linealidadEn orden a evaluar la exactitud de la calibración se testaron varias dilucionesde los WHO International Standard TOX-M. Los resultados obtenidosdemostraron que Platelia TOXO IgG está calibrada según la WHOInternational Standard TOX-M para valores superiores a 30 IU/ml. Por encimade 30 IU/ml, los resultados obtenidos son bajo estimados sobre un 25 a 50%.Usando diluciones seriadas sobre 5 muestras positivas, el rango de ensayo dePlatelia Toxo IgG se estableció entre 7 y 200 UI/ml.10. LÍMITES DE USOEl diagnóstico de infección por T. gondii no puede establecersedefinitivamente más que en un conjunto de datos clínicos y biológicos. Elresultado de un único test de investigación de los anticuerpos IgG anti-T. gondii no constituye en sí una prueba suficiente para un diagnóstico deinfección por T. gondii.• El diagnóstico de una infección reciente sólo puede realizarse coninformación completa sobre el paciente que incluya datos clínicos ybiológicos (aumento significativo de anticuerpos IgG anti-T. gondii en2 sueros del paciente extraídos con un intervalo de 3 semanas y analizadosa la vez, presencia de IgM anti-T. gondii en un nivel significativo,demostración de baja avidez de los IgG anti-T. gondii).• La presencia de anticuerpos IgM anti-T. gondii no constituye pruebasuficiente para confirmar una infección reciente, ya que los IgM puedenpermanecer varios meses o incluso años tras la infección.47

Cuando se detectan IgM, debería realizarse una determinación cuantitativade los anticuerpos IgG anti-T. gondii, así como un seguimiento de laevolución de los anticuerpos anti-T. gondii en al menos un segundo sueroextraído tres semanas más tarde.• Si se analiza una muestra demasiado temprano durante una primoinfecciónreciente, es posible que los anticuerpos IgM anti-T. gondii no estén aúnpresentes. Si existen sospechas, debería extraerse y analizarse unasegunda muestra unas 3 semanas más tarde.11. CONTROL DE CALIDAD DEL FABRICANTETodos los productos fabricados y comercializados por la sociedad Bio-Radestán bajo un sistema de garantía de la calidad desde la recepción de lasmaterias primas hasta la comercialización de los productos acabados. Cadalote de producto acabado es objeto de un control de calidad y sólo secomercializa si cumple con los criterios de aceptación. La documentaciónrelativa a la producción y al control de cada lote queda en manos delfabricante.12. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICASVer la versión Inglesa.48

PLATELIA TOXO IgG 7284096 TESTSQUANTITATIVER NACHWEIS VON IgG-ANTIKÖRPERNGEGEN TOXOPLASMA GONDII IN HUMANSERUMODER PLASMA MITTELS ENZYMIMMUNOASSAY

1. VERWENDUNGSZWECKPlatelia Toxo IgG ist ein indirekter ELISA-Immunoassay zum quantitativenNachweis von IgG-Antikörpern gegen T. gondii in Humanserum oder –plasma.2. KLINISCHE BEDEUTUNGT. gondii ist ein Protozoon, das zahlreiche Säugetier- und Vogelarten infizierenkann. Diese Infektionen treten sehr häufig beim Menschen und bei Tieren aufund verlaufen oft klinisch ganz symptomlos. Die Prävalenz dieser Infektion inder Population wird durch das Vorhandensein spezifischer Antikörper imHumanserum nachgewiesen und variiert je nach Gegend und Alter.Im Falle einer Primärinfektion bei schwangeren Frauen kann diese Infektionschwere Folgen für den Fötus (insbesondere zerebrale Funktionsstörungen)oder sogar Fehlgeburten verursachen. Eine durch den Nachweis vonIgGAntikörpern zu Beginn der Schwangerschaft festgestellte auch langezurückliegende Immunität der Mutter schützt den Fötus vor der Infektion durchdiesen Parasiten.Die zweite durch diese Infektion gefährdete Gruppe sind immunsupprimiertePatienten, insbesondere AIDS-Patienten. Diese Infektionen sind fastausschließlich auf eine aus einem ruhenden parasitären Herd (Zyste)reaktivierte Infektion, die vor der HIV-Infektion bestand, zurückzuführen. Einesichere Diagnose der Toxoplasmose-Infektion wird durch den Parasitennachweiserbracht, aber seine Bestimmung durch eine direkte Untersuchungist schwierig, wenn nicht sogar ungewiss. Die Serologie stellt die Grundlage fürDiagnostik und Follow-up der Toxoplasmose dar.Durch den Nachweis spezifischer Antikörper kann eine Infektion mit T. gondiibestätigt werden. Die gleichzeitige Untersuchung einer Probe auf verschiedeneAntikörper ermöglicht es generell, den Infektionszeitpunktfestzulegen und ggf.bei neueren Infektionen das therapeutische Vorgehen zu bestimmen bzw. auchdem Erscheinungsrisiko einer Toxoplasmose angemessene Vorbeugungsmaßnahmenzu empfehlen: hygienisch-diätetische Maßnahmen bei seronegativenschwangeren Frauen, Chemoprophylaxe bei immunsupprimierten, T. gondiiseropositivenPatienten.50

3. PRINZIPPlatelia Toxo IgG ist ein quantitativer Test zum Nachweis von IgG-Antikörpern gegen T. gondii in Humanserum und –plasma mittels einerindirekten immunenzymatischen ELISA-Methode.Zur Beschichtung der Mikrotiterplatte werden inaktivierte T. gondii-Antigeneverwendet. Als Konjugat wird ein monoklonaler Antikörper verwendet, der mitPeroxidase spezifisch gegen humane Gammaketten (anti-IgG) markiert ist. DerTest erfolgt in folgenden Schritten:• Schritt 1Patientenproben und Kalibratoren werden im Verhältnis 1:21 verdünnt undanschließend in die Vertiefungen der Mikrotiterplatte gegeben. Während der1-stündigen Inkubationsphase bei 37°C binden die in der Probe vorhandenenIgG-Antikörper gegen T. gondii an das in den Vertiefungen der Mikrotiterplattevorhandene T. gondii-Antigen. Nach der Inkubation werden ungebundeneunspezifische Antikörper und weitere Serumproteine durch Waschgängeentfernt.• Schritt 2Das Konjugat (mit Peroxidase markierter, monoklonaler Antikörper spezifischfür humane Gammaketten) wird den Vertiefungen der Mikrotiterplattezugesetzt. Während dieser 1-stündigen Inkubation bei 37°C bindet dermarkierte monoklonale Antikörper an das durch das T. gondii-Antigengebundene Serum-IgG. Das ungebundene Konjugat wird am Ende derInkubation durch Waschgänge entfernt.• Schritt 3Durch Zugabe von enzymatischer Entwicklungslösung in jede Vertiefung wirddas Vorliegen von Immunkomplexen (T. gondii-Antigen, IgG-Antikörper gegenT. gondii, Anti-IgG-Konjugat) sichtbar gemacht.• Schritt 4Nach einer Inkubationsphase bei Raumtemperatur (+18-30°C) wird dieEnzymreaktion durch Zugabe von 1N Schwefelsäurelösung gestoppt. DieExtinktion wird durch Ablesen mittels Spektrophotometer bei 450/620 nmproportional zur Menge an in der Probe vorhandenen IgG-Antikörpern gegenT. gondii ermittelt. Mit Hilfe einer Standardkurve kalibriert gegen WHOInternational Standard TOX-M kann die OD in IU/ml umgerechnet werden.51

4. PRODUKTINFORMATIONENDie mitgelieferten Reagenzien reichen aus für 96 Tests. Alle Reagenzien sindausschließlich für die in-vitro-Diagnostik bestimmt.Etikett Art der Reagenzien Darreichungs-formR1 Microplate Mikrotiterplatte : (gebrauchsfertig):12 Streifen mit 8 abknickbaren Vertiefungen,beschichtet mit inaktivertem T. gondii-Antigen1R2ConcentratedWashingSolution (20x)Konzentrierte Waschlösung (20x):TRIS-NaCl-Puffer (pH 7,4), 2% Tween ® 20Konservierungsmittel: < 1,5% ProClin 300R3 Calibrator 0 Kalibrator 0:Humanserum, negativ für IgG-Antikörper gegenT. gondii und negativ für HBs-Antigen, HIV1-,HIV2- und HCV-AntikörperKonservierungsmittel: < 1,5% ProClin 300R4a Calibrator 6 Kalibrator 6 IE/ml:Humanserum, reaktiv für IgG-Antikörper gegenT. gondii und negativ für HBs-Antigen, HIV1-,HIV2- und HCV-AntikörperKonservierungsmittel: < 1,5% ProClin 300R4b Calibrator 60 Kalibrator 60 IE/ml:Humanserum, reaktiv für IgG-Antikörper gegenT. gondii und negativ für HBs-Antigen, HIV1-,HIV2- und HCV-AntikörperKonservierungsmittel: < 1,5% ProClin 300R4c Calibrator 240 Kalibrator 240 IE/ml:Humanserum, reaktiv für IgG-Antikörper gegenT. gondii und negativ für HBs-Antigen, HIV1-,HIV2- und HCV-AntikörperKonservierungsmittel: < 1,5% ProClin 300R6Conjugate(51x)Konjugat (51x):Monoklonaler Mausantikörper gegen humaneGammaketten, gebunden an Meerrettich-Peroxidase.Konservierungsmittel: < 1,5% ProClin 300R7 Diluent Verdünnungsmittel für Proben und Konjugat(gebrauchsfertig): Tris-NaCl (pH 7,7),Glyzerin, 0,1% Tween ® 20 und Phenolrot.Konservierungsmittel: < 1,5% ProClin 3001 x 70 mL1 x 0,75 mL1 x 0,75 mL1 x 0,75 mL1 x 0,75 mL1 x 0,7 mL1 x 100 mL52

R9Etikett Art der Reagenzien Darreichungs-formChromogen Chromogen (gebrauchsfertig):1 x 28 mLTMB 3.3’.5.5’ Tetramethylbenzidin (< 0,1%),H 2 O 2 (

• Das Waschen der Mikrotiterplatte ist ein wesentlicher Arbeitsgang: Dievorgeschriebene Zahl der Waschzyklen ist unbedingt einzuhalten. Weiterhinist darauf zu achten, dass alle Vertiefungen vollständig gefüllt und danachwieder vollständig geleert werden. Nicht korrekt durchgeführte Waschgängekönnen zu fehlerhaften Ergebnissen führen.• Die Mikrotiterplatte zwischen dem Ende der Waschgänge und demPipettieren der Reagenzien nicht austrocknen lassen.• Zum Pipettieren des Konjugats und der Entwicklungslösung nie dasselbeGefäß verwenden.• Die enzymatische Reaktion weist gegenüber Metallen oder Metallionen einehohe Sensitivität auf. Folglich dürfen die verschiedenen Konjugat- undChromogenlösungen nicht mit Metallen in Berührung kommen.• Die Chromogenlösung (R9) sollte farblos sein. Ist eine Blaufärbung sichtbar,darf das Reagenz nicht verwendet und muss ersetzt werden.• Für jede neue Probe die Pipettenspitze wechseln.• Pipetten und Geräte auf Genauigkeit und korrekte Funktion prüfen.HYGIENE- UND SICHERHEITSVORSCHRIFTENDas Humanmaterial zur Vorbereitung der Reagenzien wurde getestet und alsnicht reaktiv für Hepatitis-B-Oberflächenantigen (HBs Ag), Antikörper gegendas Hepatitis-C-Virus (Anti-HCV) und gegen die humane Immundefizienz-Virus(anti-HIV1 und anti-HIV2) befunden. Da keine Testmethode eine potentielleInfektionsgefahr mit absoluter Sicherheit ausschließen kann, müssen alleReagenzien, die Humanmaterial enthalten, und Patientenproben als potentiellinfektiös behandelt werden.• Alle Materialien einschließlich der Waschlösung, die mit Proben undReagenzien, die Humanmaterial enthalten, in Berührung kommen, solltenals potentiell infektiös betrachtet werden.• Beim Umgang mit Reagenzien und Proben Einweghandschuhe tragen.• Nicht mit dem Mund pipettieren.• Probenspritzer bzw. Spritzer probenhaltiger Lösungen vermeiden. Spritzermüssen mit 10%iger Natriumhypochloritlösung behandelt werden. Ist dieverunreinigende Lösung eine Säure, die Oberflächen zunächst mitNatriumbircarbonat neutralisieren, dann mit 10%iger Natriumhypo -chloritlösung reinigen und mit Papiertüchern abtrocknen. Das zum Reinigenverwendete Material ist in einen Behälter für Sondermüll zu geben.• Die Patientenproben und Reagenzien humanen Ursprungs sowiekontaminierte Materialien und Produkte dürfen nur nach einer Dekonta -minierung entsorgt werden:- entweder durch Eintauchen in Natriumhypochloritlösung mit einerNatriumhypochlorit-Endkonzentration von 5% für die Dauer von30 Minuten54

- oder durch Autoklavieren bei 121°C über mindestens 2 Stunden.VORSICHT: Natriumhypochlorit-haltige Lösungen nicht in den Autoklavenstellen.• Kontakt der Reagenzien, auch der als nicht gefährlich eingestuftenReagenzien, mit Haut und Schleimhäuten vermeiden.• Chemikalien und biologische Proben müssen gemäß den GLP-Richtlinienverwendet und entsorgt werden.• Alle Reagenzien des Kits sind ausschließlich für die in vitro-Diagnostikbestimmt.Vorsicht: Einige Reagenzien enthalten < 1,5% ProClin 300.R43: Sensibilisierung durch Hautkontakt möglich.S28-37: Bei Berührung mit der Haut sofort mit viel Wasser undXi - Reizend Seife abwaschen. Geeignete Schutzhandschuhe tragen.6. ENTNAHME, VORBEREITUNG UND LAGERUNG DERPROBEN1. Als Probenmaterial wird Serum oder Plasma (Heparin, EDTA und Citrat)empfohlen.2. Folgende Empfehlungen für die Handhabung, Vorbereitung und Lagerungder Blutproben beachten:• Alle Blutproben unter Beachtung der üblichen Vorsichtsmaßnahmen fürVenenpunktion entnehmen.• Serumproben vor dem Zentrifugieren vollständig gerinnen lassen.• Probenröhrchen stets verschlossen halten.• Nach dem Zentrifugieren Serum oder Plasma vom Blutkuchen bzw. denErythrozyten trennen und in einem fest verschlossenen Röhrchenaufbewahren.• Die Proben können bei +2-8°C aufbewahrt werden, sofern sie innerhalbvon 7 Tagen getestet werden.• Wird der Test nicht innerhalb von 7 Tagen durchgeführt oder bei Versandder Proben, die Proben bei mind. -20°C einfrieren.• Keine Proben verwenden, die mehr als dreimal eingefroren und wiederaufgetaut wurden. Zuvor tiefgefrorene Proben sollten nach dem Auftauenund vor der Analyse gründlich gemischt werden (Vortex).3. Proben mit einer Albuminkonzentration bis 90 g/l oder einer Konzentrationan ungebundenem Bilirubin bis 100 mg/l, lipämische Proben mit einerentsprechenden Triolein-(Triglyzerid-)-Konzentration bis 36 g/l und hämolytischeProben mit einer Hämoglobinkonzentration bis 10 g/l beeinträchtigendas Testergebnis nicht.4. Proben nicht erhitzen.55

7. TESTVERFAHREN7.1 Zusätzlich benötigtes material• Rührgerät Typ Vortex.• Mikrotiterplatten-Lesegerät, mit 450 nm- und 620 nm-Filtern ausgestattet (*).• Inkubator für Mikrotiterplatten mit Temperaturregelung, auf 37°C ± 1°Ceinstellbar (*).• Automatisches, halbautomatisches oder manuelles Mikrotiterplatten-Waschsystem (*).• Steriles destilliertes oder entionisiertes Wasser.• Einweghandschuhe.• Schutzbrille.• Saugfähige Papiertücher• Automatische oder halbautomatische Pipetten oder Multipipetten,einstellbar oder voreingestellt, zum Abmessen und Verteilen von 10 µl bis1000 µl und 1, 2 und 10 ml.• Zylinder mit Maßeinteilung für 25 ml, 50 ml, 100 ml und 1000 ml.• Natriumhypochloritlösung (Natronbleichlauge) und Natriumbicarbonat.• Behälter für infektiösen Abfall.• Einwegröhrchen.(*) Wenden Sie sich an unseren Kundendienst für detaillierte Informationen zuden empfohlenen Materialien.7.2 Rekonstitution der Reagenzien• R1: Vor dem Öffnen den Beutel 30 Minuten lang bei Raumtemperatur(+18-30°C) aufbewahren. Den Halterahmen und die benötigte Anzahl anStreifen entnehmen und die unbenutzten Streifen unverzüglich wieder in denBeutel stecken. Überprüfen Sie, ob Trockenmittel im Beutel vorhanden ist.Den Beutel wieder sorgfältig verschließen und bei +2-8°C lagern.• R2: Die Waschlösung R2 im Verhältnis 1:20 mit destilliertem Wasserverdünnen: Um die gebrauchsfertige Waschlösung herzustellen, zumBeispiel 50 ml R2 mit 950 ml destilliertem Wasser verdünnen. Wenn manuellgewaschen wird, 350 ml verdünnte Waschlösung für eine Platte mit 12Streifen vorbereiten.• R3, R4a, R4b, R4c: Im Verhältnis 1:21 mit Verdünnungsmittel R7 verdünnen(Beispiel: 15 µL R3 + 30µL R7).• R6+R7: Das Konjugat (R6) ist 51fach konzentriert und muss vor derVerwendung homogenisiert werden. Im Verhältnis 1:51 mit Verdün -nungsmittel R7 verdünnen. Für eine Mikrotiterplatte 0,5 ml Konjugat (R6) in25 ml Verdünnungsmittel (R7) verdünnen. Diese Volumina durch 10 teilen,um das für einen Streifen benötigte Volumen zu erhalten.56

7.3 Lagerung und Haltbarkeit geöffneter bzw. rekonstituierterReagenzienDas Kit bei +2-8°C lagern. Bei dieser Lagertemperatur können alleKitkomponenten bis zu dem auf der Packung angegebenen Verfallsdatumverwendet werden.• R1: Nach dem Öffnen sind die Streifen 8 Stunden haltbar, sofern sie in demsorgfältig wieder verschlossenen Originalbeutel bei +2-8°C aufbewahrtwerden (überprüfen Sie, ob Trockenmittel enthalten ist).• R2: Nach der Verdünnung kann die Waschlösung bei +2-30°C 2 Wochenlang aufbewahrt werden. Die konzentrierte Waschlösung kann bei +2-30°Cohne Kontamination bis zu dem auf dem Etikett angegebenen Verfallsdatumaufbewahrt werden.• R3, R4a, R4b, R4c, R6, R7: Nach dem Öffnen sind die bei +2-8°Cgelagerten Reagenzien ohne Kontamination bis zu 8 Stunden haltbar.• R6+R7: Nach dem Verdünnen ist die Konjugatarbeitslösung beiRaumtemperatur (+18-30°C) 8 Stunden bzw. bei +2-8°C 2 Wochen haltbar.• R9: Nach dem Öffnen ist das bei +2-8°C gelagerte Reagenz ohneKontamination bis zu zwei Monate haltbar.• R10: Nach dem Öffnen ist das bei +2-8°C gelagerte Reagenz ohneKontamination bis zu dem auf dem Etikett angegebenen Verfallsdatumhaltbar.7.4 TestdurchführungDie vorliegende Beschreibung und die GLP-Richtlinien sind strikt zu befolgen.Die Reagenzien vor der Verwendung auf Raumtemperatur (+18-30°C) bringen.Die Verwendung von abknickbaren Vertiefungen erfordert während derHandhabung besondere Aufmerksamkeit.Zur Validierung der Testergebnisse sollten alle Kalibratoren in jedem Testansatzmitgeführt werden.1. Probenverteilung und Identifikationsplan für Kalibratoren und Patienten -proben sorgfältig festlegen.2. Die verdünnte Waschlösung (R2) vorbereiten (siehe Abschnitt 7.2).3. Den Halterahmen und die Streifen (R1) aus der Schutzhülle nehmen (sieheAbschnitt 7.2).4. Die Kalibratoren R3, R4a, R4b, R4c und die Patientenproben (S1, S2...) inVerdünnungsmittel (R7) zu einem 1:21Verhältnis verdünnen: 15 µl Probe und300 µL Verdünnungsmittel (R7)(siehe Abschnitt 7.2). Die verdünnten Probenauf dem Vortex mischen.5. Die nachfolgend angegebene Reihenfolge unbedingt einhalten. In jedeVertiefung 200 µl verdünnte Kalibratoren und Patientenproben geben:57

581 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12A R3 S5 S13B R4a S6C R4b S7D R4c S8E S1 S9F S2 S10G S3 S11H S4 S126. Die Mikrotiterplatte mit Folie abdecken und fest auf die Platte drücken,damit sie dicht versiegelt ist. Die Mikrotiterplatte in einem Wasserbad mitTemperaturregelung oder in einem Mikrotiterplatten-Inkubator bei37°C ± 1°C eine Stunde ± 5 Minuten inkubieren.7. Vor Ende der ersten Inkubation, die Konjugatarbeitslösung (R6+R7)herstellen (siehe Abschnitt 7.2).8. Nach Beendigung der ersten Inkubationsphase die Klebefolie entfernen.Den Inhalt aller Vertiefungen in einen Behälter für infektiöse Abfälle (mitNatriumhypochlorit) absaugen. Die Mikrotiterplatte viermal mit 350 µlWaschlösung (R2) waschen. Die Mikrotiterplatte umdrehen und vorsichtigmit Papiertüchern abtupfen, um die restliche Flüssigkeit zu entfernen.9. 200 µl der Konjugatarbeitslösung (R6 + R7) rasch in alle Vertiefungen geben.Vor der Verwendung muss die Lösung vorsichtig geschüttelt werden.10. Die Mikrotiterplatte mit Folie abdecken und fest auf die Platte drücken,damit sie dicht versiegelt ist. Die Mikrotiterplatte in einem Wasserbad mitTemperaturregelung oder in einem Mikrotiterplatten-Inkubator bei37°C ± 1°C eine Stunde ± 5 Minuten inkubieren.11. Nach Beendigung der zweiten Inkubationsphase die Klebefolie entfernen.Den Inhalt aller Vertiefungen in einen Behälter für infektiöse Abfälle (mitNatriumhypochlorit) absaugen. Die Mikrotiterplatte viermal mit 350 µlWaschlösung (R2) waschen. Die Mikrotiterplatte umdrehen und vorsichtigmit Papiertüchern abtupfen, um die restliche Flüssigkeit zu entfernen.12. 200 µl Chromogenlösung (R9) schnell und unter Lichtausschluss in alleVertiefungen pipettieren. Für die Entwicklung der Reaktion die Plattelichtgeschützt bei Raumtemperatur (+18-30°C) 30 ± 5 Minuten stehenlassen. Während dieser Inkubation keine Folie verwenden.13. Die enzymatische Reaktion durch Zugabe von 100 µl Stopplösung (R10) injede Vertiefung stoppen. In der gleichen Reihenfolge und im gleichenZeitrahmen wie die Entwicklungslösung verteilen.14. Den Boden der Platte sorgfältig abwischen. Innerhalb von 30 Minuten nachStoppen der Reaktion die Extinktion mit einem Plattenleser bei 450/620 nmablesen. Die Streifen müssen vor dem Ablesen stets lichtgeschütztaufbewahrt werden.

15. Vor dem Weiterleiten alle Ergebnisse hinsichtlich der Übereinstimmungzwischen den Werten sowie gegen die Platten- und Probenverteilungüberprüfen.8. BERECHNUNG UND AUSWERTUNG DER ERGEBNISSE8.1 Erstellung der StandardkurveVorkommen und Menge der gegen T. gondii gerichteten Antikörper der IgG-Klasse in der untersuchten Probe werden bestimmt, indem die Extinktion derProbe mit den Werten einer Eichkurve verglichen wird. Die Kontrollseren R4a,R4b, R4c sind gegen den WHO-Standard (TOXS M) kalibriert. Obgleich die indiesem Testkit enthaltenen Kontrollseren gegen den WHOStandard kalibriertwurden, können gewisse Titerabweichungen für dasselbe Serum beobachtetwerden, wenn es mit verschiedenen serologischen Nachweisverfahrengetestet wird. Solche Abweichungen sind darauf zurückzuführen, dass die beiden verschiedenen Techniken verwendeten TOXOPLASMA-Antigeneunterschiedliche Membran- und lösliche Antigenanteile enthaltenDie Standardkurve [OD = Funktion (IE/ml)] erstellen, indem die OD-Messwerteder Kalibratoren R3, R4a, R4b, R4c auf der vertikalen (Y) Achse und ihreentsprechende Konzentration in IE/ml auf der horizontalen (X) Achseaufgetragen werden. Für jede getestete Probe wird der Titer der IgGAntikörpergegen T. gondii ermittelt, indem zu ihrer jeweils gemessenen OD in dererstellten Standardkurve die entsprechende Konzentration festgestellt wird.NB: Die IE/ml einer Probe können nur dann berechnet werden, wenn diefür die 1:21 oder 1:210 verdünnte Probe ermittelte Extinktion zwischen denDE-Werten für R4a und R4c der Eichkurve liegt. Bei Kontrollseren, die auf1:210 verdünnt wurden, sind die auf der Xachse erhaltenen Werte mit 10zu multiplizieren.8.2 QualitätskontrolleFür jede Mikrotiterplatte und jede Testreihe alle Kalibratoren mitführen und dieermittelten Ergebnisse analysieren. Für die Validierung des Tests müssenfolgende Kriterien erfüllt werden:• Extinktionswerte:OD R4a ≥ 0,200OD R4b ≥ 0,400• Extinktionsverhältnisse:OD R4a / OD R3 ≥ 5,00OD R4b / OD R4a ≥ 2,20OD R4c / OD R4b ≥ 1,15Werden diese Qualitätskontrollkriterien nicht erfüllt, muss die Messreihewiederholt werden.59

8.3 Auswertung der ErgebnisseAnti-T. gondii-Antikörpertiter ResultatAuswertung(International Einheiten/ml)Titer < 6 IE/ml Negativ Ein negatives oder nicht eindeutiges Ereignisdeutet auf Nichtvorhandensein einer6 IE/ml ≤ Titer< 9 IE/mlNichteindeutigerworbenen Immunität hin, kann aber einekürzliche Infektion nicht ausschließen. Wenneine Kontaminierung des Patienten vermutetwird, sollte etwa zwei Wochen später einezweite Probe getestet werden.Titer ≥ 9 IE/ml Positiv Ein positives Resultat ist in der Regelsignifikant für eine zurückliegende Infektion.Eine kürzliche Infektion kann aber nichtausgeschlossen werden, vor allem, wennAnti-T. gondii-IgM-Antikörper vorhanden sind.Bei Konzentrationen über 200 IE/ml kann eine höhere Variation der Titer zubeobachten sein.8.4 FehlerursachenNicht validierte oder nicht reproduzierbare Reaktionen haben häufig folgendeUrsachen:• unzureichendes Waschen der Mikrotiterplatte,• Verunreinigung der negativen Proben durch Serum oder Plasma mit hohemAntikörpertiter,• Verunreinigung der Entwicklungslösung durch chemische Oxidationsmittel(Natronbleichlauge, Metallionen...),• Verunreinigung der Stopplösung.9. LEISTUNGSMERKMALEDie Leistung des Platelia Toxo IgG wurde an 2 Standorten mit insgesamt1310 Proben von Schwangeren und Blutspendern ermittelt. In einem Laborwurde die Übereinstimmung der Ergebnisse im Vergleich mit dem Platelia ToxoIgG TMB (Art.Nr. 72741) bei manueller Abarbeitung der Assays überprüft. Indem zweiten Labor wurden diese beiden Teste nach automatisierterAbarbeitung miteinander verglichen. Zusätzlich wurden dieLeistungsmerkmale des Platelia Toxo IgG Assays mit 47 Blutproben ausNabelschnur ermittelt.60

9.1 PrävalenzDie Prävalenz von anti- Toxoplasma gondii -IgG-Antikörpern wurde mitPlatelia Toxo IgG an einem Panel von 538 Proben von Schwangerschaftsverläufenaus dem Raum Paris (Frankreich) bestimmt. 128 Proben warenanti-Toxoplasma-IgG-Antikörper positiv. Die mit dem Platelia Toxo IgG-Assay gemessene Prävalenz lag demnach bei 23,8% (128/538).9.2 Vergleichende Studien (Labor 1)Die Leistung des Platelia Toxo IgG wurde mit einem Panel aus 745 Probenermittelt. Folgende Proben wurden untersucht:• 606 Seren von Blutspendern• 139 Seren von SchwangerenDie Resultate wurden mit den Ergebnissen des als Referenz verwendetenPlatelia Toxo IgG TMB (72741) verglichen.PlateliaToxo IgG(72840)Platelia Toxo IgG TMB (72741)Negativ Fraglich* Positiv GesamtNegativ 365 0 0 365Fraglich* 0 2 0 2Positiv 0 0 378 378Gesamt 365 2 378 745• Allgemeine Übereinstimmung:743/743 100,0% [KI95% = 99,5% - 100,0%]• Relative Spezifität: 365/365 100,0% [KI95% = 99,0% - 100,0%]• Relative Sensitivität: 378/378 100,0% [KI95% = 99,0% - 100,0%]* Fragliche Proben wurden bei der berechnung der Sensitivität und. Spezifität bzw. Der Übereinstimmungnicht[KI 95%] = 95% Konfidenzintervall9.3 Leistung (Labor 2)Es wurde eine prospektive Studie mit 538 Seren durchgeführt, dieüberwiegend von Schwangeren, bzw. aus Schwangerschaftsverlaufsuntersuchungenstammten. Die Proben wurden sowohl im Platelia Toxo IgG alsauch im Platelia Toxo IgG TMB (72741) Test bestimmt. Darüber hinauswurden alle Proben unbekannter Patienten aus der Serothek des Labors, dieeinen Ak-Titer von < 100 IE/ml aufwiesen, mit einer zweiten Methodeüberprüft:• Sensitiver Agglutinationstest (Laborantigen: T. gondii, RH Stamm) für Serenmit einem Titer von > 10 IE/ml.• Indirekte Immunfluoreszenz (Laborantigen: T. gondii, RH Stamm) für Serenmit einem Titer zwischen 3 und 10 IE/ml.61

Die Ergebnisse wurden mit denen aus dem Platelia Toxo IgG TMB (72741)Test, als Referenztest verglichen.PlateliaToxo IgG(72840)Platelia Toxo IgG TMB (72741)Negativ Fraglich* Positiv GesamtNegativ 406 1 0 407Fraglich* 3 0 0 3Positiv 7 10 111 128Gesamt 416 11 111 538• Allgemeine Übereinstimmung:517/524 98,7% [KI95% = 97,3% - 99,5%]• Relative Spezifität: 406/413 98,3% [KI95% = 96,5% - 99,3%]• Relative Sensitivität: 111/111 100,0% [KI95% = 96,8% - 100,0%]* Fragliche Proben wurden bei der berechnung der Sensitivität und. Spezifität bzw. Der Übereinstimmungnicht[KI 95%] = 95% KonfidenzintervallAlle 7 Seren mit einem abweichenden positiven Ergebniss im Platelia ToxoIgG Test konnten sowohl im Agglutinationstest, als auch imImmunfluoreszenztest als positiv bestätigt werden.Zusätzlich wurden 9 Serokonversionspanels mit jeweils drei Proben sowohl imPlatelia Toxo IgG (72840) als auch im Platelia Toxo IgG TMB (72741)untersucht. Bei jedem Panel war jeweils das erste Serum anti- Toxoplasmagondii IgG und IgM Antikörper negativ.Bei 8 der 9 Serokonversionspanels, zeigten beide Teste vergleichbareErgebnisse. Bei einem der Panels war das 2. Serokonversionsserum positiv imPlatelia Toxo IgG Test und fraglich im Platelia Toxo IgG TMB Test.9.4 Leistungsmerkmale mit NabelschnurblutAlle 47 Blutproben wurden nach dem in Abschnitt 7.4. (Probenverdünnung1:21) beschriebenen Protokoll abgearbeitet:• 22 Blutproben mit bestätigter kongenitaler Toxoplasmose• 18 Proben von Müttern mit durchlaufener Toxoplasmose• 7 negative Blutproben ohne InfektionAlle Proben mit kongenitaler und abgeschlossener Toxoplasmoseinfektionwurden mit dem Platelia Toxo IgG Assay (72840) als positiv erkannt. AlleProben mit durchlaufener Toxoplasmose waren mit Platelia Toxo IgM Assay(72841) negativ. Die nicht infizierten Proben wurden als negativ bestätigt.62

Platelia Toxo IgG (72840) Platelia Toxo IgM (72841)Positiv Fraglich Negativ Positiv Fraglich NegativKongenitaleToxoplasmose(n=22)DurchlaufeneToxoplasmose (n=18)22 0 0 18 2 218 0 0 0 0 18Negativ (n=7) 0 0 7 0 0 79.5 KreuzreaktivitätEin Panel von 197 Proben, darunter 159 Rubella, CMV, EBV, HSV, VZV,Mumps, Masern oder HIV - positive Proben sowie 38 Rheumafaktor-,Autoantikörper- heterophile Antikörper - positive Proben, wurde mit PlateliaToxo IgG (72840) und Platelia Toxo IgG TMB (72741) untersucht.141 der Proben waren negativ, 55 Proben wurden als positiv und 1 Serum alsfraglich mit Platelia Toxo IgG getestet. Alle positiven Proben waren auch imPlatelia Toxo IgG TMB Test positiv getestet worden.9.6 Präzision• Intraassay-Präzision (Reproduzierbarkeit):Zur Bestimmung der Intraassay-Reproduzierbarkeit wurden 1 negative und3 positive Proben 32mal in einer Messreihe getestet. Für jede Probe wurde dieKonzentration (IE/ml). Die Tabelle unten gibt den Mittelwert der Konzentration(IE/ml), die Standardabweichung (SD), den Variationskoeffizienten (%VK) fürjedes der vier Präparate an:Intraassay-Präzision (Reproduzierbarkeit)N=32NegativeProbeSchwachpositive ProbePositiveProbeKonzentration (IE/ml)Stark positiveProbeMittelwert 0,15 16,0 39,8 167,5SD 0,01 2,3 2,7 23,1VK% 7,2% 14,4% 6,9% 13,8%63

• Interassay-Präzision (Reproduzierbarkeit):Zur Bestimmung der Interassay-Reproduzierbarkeit wurde jede der 4 Proben(1 negative und 3 positive Proben) in Doppelbestimmung in zwei Messreihenpro Tag über einen Zeitraum von 20 Tagen getestet. Für jede Probe wurde dieKonzentration (IE/ml).Die Tabelle unten gibt den Mittelwert der Konzentration (IE/ml), dieStandardabweichung (SD), den Variationskoeffizienten (%VK) für jedes der vierPräparate an:Interassay-Präzision (Reproduzierbarkeit)N=80NegativeProbeSchwachpositive ProbePositiveProbeKonzentration (IE/ml)Stark positiveProbeMittelwert 0,15 15,2 41,7 166,5SD 0,05 2,4 4,2 21,0VK% 32,6% 15,5% 10,1% 12,6%9.7 Präzision und LinearitätZur Bestimmung der Präzision der Kalibration, wurden verschiedeneVerdünnungen des WHO International Standard TOX-M getestet. Die erzieltenErgebnisse zeigen, dass der Platelia TOXO IgG Assay im Messbereich bis30 IE/ml sehr präzise auf den WHO International Standard TOX-M abgestimmtist. Werte > 30 IE/ml, wurden ca. 25-50% niedriger gemessen.Mit seriellen Verdünnungsreihen von 5 positiven Seren wurde der Messbereichvon Platelia Toxo IgG auf einen Bereich von 7 - 200 IE/ml festgelegt.10. GRENZEN DES VERFAHRENSEine Diagnose einer T. gondii-Infektion kann nur in Zusammenhang mitklinischen und biologischen Daten erfolgen. Das Ergebnis eines einzelnenTests zum Nachweis von T. gondii-IgG-Antikörpern genügt nicht für dieDiagnose einer Infektion durch T. gondii.• Eine kürzlich erfolgte Infektion kann nur auf der Basis vollständigerPatienteninformationen diagnostiziert werden, einschließlich klinischer undbiologischer Daten (signifikante Erhöhung von anti-T.gondii-IgG-Antikörpernin 2 Patientenseren, die im Abstand von 3 Wochen abgenommen und imselben Lauf getestet werden, Vorhandensein von anti-T. gondii-IgM mitsignifikantem Titer, Nachweis einer niedrigen Anti-T. gondii IgG-Avidität).• Das Vorhandensein von anti-T. gondii-IgM-Antikörpern ist keinausreichender Beweis zur Bestätigung einer kürzlich erfolgten Infektion, daIgM mehrere Monate oder sogar Jahre nach der Infektion persistierenkönnen.64

Werden IgM nachgewiesen, empfiehlt sich eine quantitative Ermittlung derAnti-T. gondii-IgG-Antikörper sowie eine Nachbestimmung der Entwicklungvon anti-T. gondii-IgM-Antikörpern mit mindestens einer zweitenSerumprobe, die drei Wochen später entnommen wird.• Wird eine Probe zu früh während einer kürzlich erfolgten Primärinfektiongetestet, sind möglicherweise noch keine anti-T. gondii-IgM-Antikörpervorhanden. Liegt ein entsprechender Verdacht vor, ist 3 Wochen später einezweite Probe zu entnehmen, mit der die Testung auf IgM-Antikörperwiederholt wird.11. QUALITÄTSKONTROLLE DES HERSTELLERSAlle von der Firma Bio-Rad hergestellten Reagenzien unterliegen einemQualitätssicherungssystem vom Rohstoffeingang bis zur Vermarktung derFertigprodukte. Jede Fertigproduktcharge wird einer Qualitätskontrolleunterzogen und nur dann verkauft, wenn sie den Freigabekriterien entspricht.Die Unterlagen bezüglich Herstellung und Kontrolle der einzelnen Chargenwerden bei Bio-Rad aufbewahrt.12. LITERATURSiehe Englische Version.65

PLATELIA TOXO IgG 7284096 TESTDETERMINAZIONE QUANTITATIVA DEGLI ANTICORPIIgG ANTI-TOXOPLASMA GONDII NEL SIERO O NELPLASMA UMANO MEDIANTE DOSAGGIOIMMUNOENZIMATICO

1. USO PREVISTOPlatelia Toxo IgG è un immunodosaggio ELISA indiretto per ladeterminazione quantitativa degli anticorpi IgG anti-T. gondii nel siero o nelplasma umano.2. INTERESSE CLINICOT. gondii è un protozoo in grado di infettare numerose specie d mammiferi euccelli. Questa infezione comune nell'uomo e negli animali, spesso non dàmanifestazioni dal punto di vista clinico. La prevalenza dell'infezione nellapopolazione, rilevata dalla presenza di anticorpi specifici nel siero varia infunzione della zona geografica e dell'età. L'infezione può, nel caso di infezioneprimaria della madre durante la gravidanza, essere causa di gravi conseguenzeper il feto (in particolare un'alterazione delle funzioni cerebrali) o di aborto.Un'immunità pregressa della madre, dimostrata dalla presenza di anticorpi IgGfin dall'inizio della gravidanza, protegge il feto dall'infezione da parte delparassita.Una popolazione sensibile a questo tipo di infezione è costituita dai pazientiimmunodepressi, quali i malati affetti da AIDS. In tal caso essa è dovuta, quasiesclusivamente, lla riattivazione di un focolaio parassitario (ciste) quiescentenel paziente e preesistente all'infezione da virus HIV. La diagnosi certa diinfezione da toxoplasma si ottiene attraverso l'evidenziazione del parassita,tuttavia l’isolamento risulta difficile e raro. La sierologia rappresenta la basedella diagnosi e dello screening della toxoplasmosi. La rilevazione di anticorpispecifici è indice di esposizione a da T. gondii; lo studio combinato di anticorpiappartenenti a diversi isotopi consente generalmente di datare l'infezione eorientare la terapia in caso di infezione recente, oppure di proporre misureprofilattiche idonee al rischio di insorgenza di una toxoplasmosi: misureigienicodietetiche, per le donne in gravidanza non immuni, chemioprofilassi peri soggetti immunodepressi sieropositivi per il T. gondii.3. PRINCIPIOPlatelia Toxo IgG è un test quantitativo per la determinazione degli anticorpiIgG anti-T. gondii nel siero o nel plasma umano mediante un metodo immunoenzimaticoELISA indiretto.Gli antigeni inattivati di T. gondii vengono utilizzati per sensibilizzare lamicropiastra. Come coniugato viene utilizzato un anticorpo monoclonalemarcato con perossidasi specifico per le catene gamma umane (anti-IgG). Iltest prevede le seguenti fasi:• Fase 1I campioni dei pazienti e i calibratori vengono diluiti in rapporto 1/21, quindidistribuiti nei pozzetti della micropiastra. Durante questa incubazione di un'oraa 37°C, gli anticorpi IgG anti-T. gondii presenti nel campione si legano68

all'antigene T. gondii adeso ai pozzetti della micropiastra. Gli anticorpi nonspecifici non legati e altre proteine seriche vengono eliminati dai lavaggisuccessivi all'incubazione.• Fase 2Il coniugato anticorpo monoclonale marcato con perossidasi specifico per lecatene gamma umane viene aggiunto nei pozzetti della micropiastra. Durantequesta incubazione di un'ora a 37°C, l'anticorpo monoclonale marcato si legaal siero IgG catturato dall'antigene T. gondii. Il coniugato non legato vieneeliminato dai lavaggi successivi all'incubazione.• Fase 3La presenza di immunocomplessi (Antigene T. gondii, anticorpi IgG anti-T. gondii, coniugato anti-IgG) viene dimostrata attraverso l'aggiunta di unasoluzione di sviluppo enzimatica in ogni pozzetto.• Fase 4Al termine del periodo di incubazione a temperatura ambiente (+18-30°C), lareazione enzimatica viene bloccata attraverso l'aggiunta di una soluzione diacido solforico 1N. La lettura della densità ottica ottenuta con unospettrofotometro impostato su 450/620 nm è proporzionale alla quantità dianticorpi IgG anti-T. gondii presenti nel campione. I valori di densità ottica sonoconvertiti in IU/ml utilizzando una curva standard calibrato contro WHOInternational Standard TOX-M.4. INFORMAZIONI SUL PRODOTTOLe quantità di reagenti fornite sono state calcolate per consentire l'esecuzionedi 96 test. Tutti i reagenti sono destinati esclusivamente all’uso diagnostico invitro.Marcatura Natura dei reagenti PresentazioneR1 Microplate Micropiastra : (Pronta per l'uso):12 strip con 8 pozzetti divisibili, sensibilizzaticon antigene T. gondii inattivato1R2ConcentratedWashingSolution (20x)Soluzione di lavaggio concentrata (20x):Tampone TRIS-NaCl (pH 7,4), 2% Tween ® 20Conservante: < 1,5% ProClin 300R3 Calibrator 0 Calibratore 0:Siero umano negativo per anticorpi IgG anti-T. gondii e negativo per antigene HBs, anti-HIV1, anti- HIV2 e anti-HCVConservante: < 1,5% ProClin 3001 x 70 mL1 x 0,75 mL69

Marcatura Natura dei reagenti PresentazioneR4a Calibrator 6 Calibratore 6 UI/ml:1 x 0,75 mLSiero umano reattivo per anticorpi IgG anti-T. gondii e negativo per antigene HBs, anti-HIV1, anti- HIV2 e anti-HCVConservante: < 1,5% ProClin 300R4b Calibrator 60 Calibratore 60 UI/ml:1 x 0,75 mLSiero umano reattivo per anticorpi IgG anti-T. gondii e negativo per antigene HBs, anti-HIV1, anti- HIV2 e anti-HCVConservante: < 1,5% ProClin 300R4c Calibrator 240 Calibratore 240 UI/ml:1 x 0,75 mLSiero umano reattivo per anticorpi IgG anti-T. gondii e negativo per antigene HBs, anti-HIV1, anti- HIV2 e anti-HCVConservante: < 1,5% ProClin 300R6 Conjugate Coniugato (51x):1 x 0,7 mL(51x) Anticorpo monoclonale di origine murina anticatenegamma umane unito a perossidasi dirafanoConservante: < 1,5% ProClin 300R7 Diluent Diluente per campioni e coniugato (Prontoper l'uso): Tris-NaCl (pH 7,7), glicerolo,0,1% Tween ® 20 e rosso fenoloConservante: < 1,5% ProClin 3001 x 100 mLPer informazioni sulle condizioni di conservazione e sulla data di scadenza,consultare le indicazioni riportate sulla confezione.5. AVVERTENZE E PRECAUZIONIL'affidabilità dei risultati dipende dalla corretta implementazione delle buoneprassi di laboratorio riportate di seguito:• Non utilizzare reagenti scaduti.• Non mischiare, né combinare reagenti provenienti da lotti diversi in unastessa seduta analitica70R9R10ChromogenTMBStoppingSolutionCromogeno (Pronto per l'uso):1 x 28 mL3.3’.5.5’ tetrametilbenzidina (< 0,1%),H 2 O 2 (

OSSERVAZIONE: per la soluzione di lavaggio (R2, identificativo etichetta:20x color verde), il Cromogeno (R9, identificativo etichetta: TMB colorturchese) e la soluzione bloccante (R10, identificativo etichetta: 1N colorrosso) è possibile utilizzare lotti diversi da quelli contenuti nel kit, acondizione che i reagenti siano strettamente equivalenti e venga utilizzatoun unico lotto in una stessa seduta analitica.OSSERVAZIONE : Non è possible utilizzare il Diluente (R7) di lotti diversi daquello fornito con il Kit cosi’ come non è possibile utilizzare il Diluente (R7)fornito con il Kit Platelia Toxo IgM (Cod. 72841).OSSERVAZIONE: Inoltre, la Soluzione di Lavaggio (R2, identificazionedell’etichetta : 20X di colore verde ) può essere miscelata con le altre2 soluzioni di lavaggio incluse in vari kit di reattivi Bio-Rad (R2,identificazioni delle etichette : 10x di colore blu o 10x di colore arancione)una volta adeguatamente ricostituite, a condizione che all’interno di unaseduta analitica venga utilizzata solo una miscela.• Prima dell'uso, attendere circa 30 minuti per consentire al reagente diraggiungere la temperatura ambiente (18-30°C).• Ricostituire o diluire con cura i reagenti evitando contaminazioni.• Non eseguire il test in presenza di vapori reattivi (vapori acidi, alcalini e dialdeide) o polvere potenzialmente in grado di alterare l'attività enzimatica delconiugato.• Utilizzare preferibilmente materiale monouso oppure vetreria perfettamentelavata e sciacquata con acqua deionizzata.• Il lavaggio della micropiastra è una fase essenziale della procedura: eseguireil numero di cicli di lavaggio raccomandato e assicurarsi che tutti i pozzetti,una volta riempiti, vengano completamente svuotati. Un lavaggioinadeguato può condurre a risultati inesatti.• Non far asciugare la micropiastra nell'intervallo di tempo compreso fra lafine dell'operazione di lavaggio e la distribuzione del reagente.• Non utilizzare mai lo stesso contenitore per distribuire il coniugato e lasoluzione di sviluppo.• La reazione enzimatica è particolarmente sensibile al metallo o agli ionimetallici. Di conseguenza, evitare che gli elementi di metallo entrino incontatto con le varie soluzioni contenenti il coniugato o il cromogeno.• La soluzione di cromogeno (R9) deve essere incolore. La colorazione bluindica che il reagente non può essere utilizzato, pertanto dovrà esseresostituito.• Utilizzare puntali diversi per ogni campione.• Verificare l'accuratezza delle pipette e il buon funzionamento delle altrestrumentazioni.71

ISTRUZIONI DI SICUREZZA E IGIENEIl materiale di origine umano utilizzato nella preparazione dei reagenti è statoanalizzato e classificato non reattivo per l'antigene di superficie dell'epatite B(HBs Ag), gli anticorpi per il virus dell'epatite C (anti-HCV) e i virus dell'immunodeficienzaumana (anti-HIV1 e anti-HIV2). Dato che nessun metodo puògarantire con assoluta certezza l'assenza di agenti infettivi, manipolare ireagenti di origine umana e i campioni dei pazienti come potenzialmente infetti.• Qualsiasi materiale, comprese le soluzioni di lavaggio, che entri direttamentein contatto con campioni e reagenti contenenti materiali di origine umanadeve essere considerato potenzialmente in grado di trasmettere malattieinfettive.• Indossare guanti monouso durante la manipolazione dei campioni e deireagenti.• Non pipettare con la bocca.• Evitare di rovesciare campioni o soluzioni contenenti campioni. Pulire lesuperfici contaminate con candeggina diluita al 10%. Se il liquidocontaminante è un acido, neutralizzare le superfici con bicarbonato di sodio,quindi pulire con candeggina diluita al 10% e asciugare con cartaassorbente. Il materiale utilizzato per la pulizia deve essere gettato in uncontenitore speciale per rifiuti contaminati.• Dopo la decontaminazione, eliminare i campioni dei pazienti, i reagenticontenenti materiale di origine umana, compreso il materiale e i prodotticontaminati mediante uno dei seguenti metodi:- immersione nella candeggina alla concentrazione finale di 5% diipocloruro di sodio per 30 minuti,- oppure lavaggio in autoclave a 121°C per almeno 2 ore.ATTENZIONE: non introdurre soluzioni contenenti ipocloruro di sodionell'autoclave• Evitare qualsiasi contatto dei reagenti, compresi quelli considerati nonpericolosi, con la pelle e le mucose.• La manipolazione e l'eliminazione dei residui chimici e biologici devonoessere eseguite attenendosi alle buone prassi di laboratorio.• Tutti i reagenti forniti nel kit sono destinati esclusivamente all’usodiagnostico in vitro.Attenzione: alcuni reagenti contengono ProClin 300 < 1,5%R43: Può provocare sensibilizzazione per contatto con la pelleS28-37: In caso di contatto con la pelle, lavarsi immediatamente eXi - Irritante abbondantemente con acqua e sapone. Indossare guanti adatti72

6. PRELIEVO, PREPARAZIONE E CONSERVAZIONE DEICAMPIONI1. Il siero e il plasma (EDTA, eparina o citrato) sono i tipi di campioneraccomandati.2. Per la manipolazione, l'elaborazione e la conservazione dei campioniematici, attenersi alle seguenti raccomandazioni:• Prelevare tutti i campioni di sangue secondo le precauzioni in uso.• Per il siero, consentire la completa coagulazione dei campioni prima diprocedere alla centrifugazione.• Assicurarsi che le provette siano sempre chiuse.• Dopo la centrifugazione, separare il siero o il plasma dal coagulo o daiglobuli rossi e conservarlo in una provetta chiusa ermeticamente.• È possibile conservare i campioni a una temperatura compresa fra+2 e 8°C a condizione che il test venga eseguito entro 7 giorni.• Se il test non viene eseguito entro 7 giorni, o per motivi di consegna,congelare i campioni a una temperatura di -20°C o inferiore.• Non utilizzare campioni scongelati più di 5 volte. I campioni precedentementecongelati devono essere miscelati bene (Vortex) dopo loscongelamento e prima del test.3. I campioni contenenti 90 g/l di albumina o 100 mg/l di bilirubina nonconiugata, campioni lipemici contenenti l'equivalente di 36 g/l di trioleina(trigliceride) e i campioni sottoposti ad emolisi contenenti fino a 10 g/l diemoglobina non influenzano i risultati.4. Non riscaldare i campioni.7. PROCEDURA7.1 Materiale richiesto, ma non fornito• Agitatore tipo Vortex.• Lettore di micropiastre dotato di filtri 450 nm e 620 nm (*).• Incubatore di micropiastre con regolazione termostatica impostata su37±1°C (*).• Sistema di lavaggio automatico, semi-automatico o manuale permicropiastre (*).• Acqua distillata o deionizzata sterile.• Guanti monouso.• Occhiali di sicurezza o antispruzzo.• Carta assorbente.• Pipette o multipipette automatiche o semi-automatiche, regolabili opreimpostate per misurare e dispensare da 10 µl a 1.000 µl e 1 ml, 2 ml e 10 ml.73

• Cilindri graduati con capacità di 25 ml, 50 ml, 100 ml e 1.000 ml.• Ipocloruro di sodio (candeggina) e bicarbonato di sodio.• Contenitore per rifiuti biologici.• Provette monouso.(*) Per informazioni dettagliate sulla strumentazione raccomandata, consultareil nostro reparto tecnico.7.2 Ricostituzione dei reagenti• R1: Prima di aprire la bustina di plastica, lasciare 30 minuti a temperaturaambiente (18-30°C). Estrarre il vassoio, riporre immediatamente le strip nonutilizzate nella bustina e verificare la presenza di essiccante. Richiudere concura la bustina e conservarla a 2-8°C.• R2: Diluire in rapporto 1/20 la soluzione di lavaggio R2 in acqua distillata: adesempio 50 ml di R2 e 950 ml di acqua distillata per ottenere la soluzione dilavaggio pronta per l'uso. Preparare 350 ml di soluzione di lavaggio diluitaper una piastra da 12 strip in caso di lavaggio manuale.• R3, R4a, R4b, R4c: Diluire in rapporto 1/21 nel Diluente (R7) (esempio:15 µL di R3 + 300 µL di R7).• R6+R7: Il coniugato (R6) è concentrato 51x e deve essere omogeneizzatoprima dell'uso. Diluire in rapporto 1/51 nel Diluente (R7). Per una piastra,diluire 0,5 ml di Coniugato (R6) in 25 ml di Diluente (R7). Per ottenere ilvolume necessario per una strip, dividere i suddetti volumi per 10.7.3 Conservazione e validità dei reagenti aperti e / o ricostituitiIl kit deve essere conservato a 2-8°C. Se viene conservato a 2-8°C primadell'apertura, ogni componente può essere utilizzato fino alla data di scadenzaindicata sull'etichetta riportata sul kit.• R1: Dopo l'apertura, le strip mantengono la stabilità fino a 8 settimane , seconservate a 2-8°C nella stessa bustina sigillata (verificare la presenza diessiccante).• R2: Dopo la diluizione, la Soluzione di lavaggio può essere conservata per2 settimane a 2-30°C. La Soluzione di lavaggio concentrata conservata a2-30°C, in assenza di contaminazione, mantiene la stabilità fino alla data discadenza indicata sull'etichetta.• R3, R4a, R4b, R4c, R6, R7: Dopo l'apertura e in assenza dicontaminazione, i reagenti conservati a 2-8°C mantengono la stabilità fino a8 settimane .• R6+R7: Dopo la diluizione, la soluzione di lavoro del coniugato mantiene lastabilità per 8 ore a temperatura ambiente (18-30°C) oppure per 2 settimanea 2-8°C.• R9: Dopo l'apertura e in assenza di contaminazione, i reagenti conservati a2-8°C mantengono la stabilità fino a 8 settimane.74

• R10: Dopo l'apertura e in assenza di contaminazione, il reagente conservatoa 2-8°C mantiene la stabilità fino alla data di scadenza indicatasull'etichetta.7.4 ProceduraSeguire attentamente la procedura descritta di seguito e le buone prassi dilaboratorio.Prima dell'uso, consentire al reagente di raggiungere la temperatura ambiente(18-30°C).Se si utilizzano pozzetti divisibili, prestare particolare attenzione durante lamanipolazione.Utilizzare i calibratori in ogni seduta analitica per convalidare i risultati del test.1. Definire accuratamente il piano di distribuzione e di identificazione per icalibratori e i campioni dei pazienti.2. Preparare la Soluzione di lavaggio diluita (R2) [Fare riferimento alla Sezione 7.2].3. Estrarre il vassoio e le strip (R1) dall'involucro protettivo [Fare riferimento allaSezione 7.2].4. Diluire i controlli R3, R4a, R4b, R4c e i campioni dei pazienti (S1, S2…) nelDiluente (R7) per ottenere una diluizione in rapporto 1/21: 15 µl di campionee 300 µ l di Diluente (R7) [Fare riferimento alla Sezione 7.2]. Vortexare icampioni diluiti.5. Distribuire in ogni pozzetto 200 µl di calibratori diluiti e di campioni deipazienti secondo lo schema riportato di seguito:1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12A R3 S5 S13B R4a S6C R4b S7D R4c S8E S1 S9F S2 S10G S3 S11H S4 S126. Ricoprire la micropiastra con la pellicola sigillante adesiva ed esercitarepressione per assicurarne la tenuta. Incubare immediatamente lamicropiastra in un bagnetto termostatato o in un incubatore a secco per1 ora ± 5 minuti a 37°C ± 1°C.7. Prima della fine della prima incubazione, preparare la soluzione di lavoro delconiugato (R6+R7) [Fare riferimento alla Sezione 7.2].75

8. Al termine del primo periodo di incubazione, rimuovere il nastro sigillanteadesivo. Aspirare il contenuto di tutti i pozzetti in un contenitore per rifiutibiologici (contenente ipocloruro di sodio). Lavare la micropiastra 4 volte con350 µl di Soluzione di lavaggio (R2). Capovolgere la micropiastra epicchiettare delicatamente su carta assorbente per rimuovere il liquido ineccesso.9. Distribuire immediatamente 200 µl della soluzione di lavoro del coniugato(R6+R7) in tutti i pozzetti. Agitare leggermente la soluzione prima dell'uso.10. Ricoprire la micropiastra con la pellicola sigillante adesiva ed esercitarepressione per assicurarne la tenuta. Incubare immediatamente lamicropiastra in un bagnetto termostatato o in un incubatore a secco per1 ora ± 5 minuti a 37°C ± 1°C.11. Al termine del secondo periodo di incubazione, rimuovere il nastro sigillanteadesivo. Aspirare il contenuto di tutti i pozzetti in un contenitore per rifiutibiologici (contenente ipocloruro di sodio). Lavare la micropiastra 4 volte con350 µl di Soluzione di lavaggio (R2). Capovolgere la micropiastra epicchiettare delicatamente su carta assorbente per rimuovere il liquido ineccesso.12. Distribuire rapidamente in ogni pozzetto e al riparo dalla luce 200 µl diCromogeno (R9). Far sviluppare la reazione al buio per 30 ± 5 minuti atemperatura ambiente (18-30°C). Non utilizzare nastri sigillanti adesividurante questo periodo di incubazione.13. Bloccare la reazione enzimatica aggiungendo 100 µl di Soluzione bloccante(R10) in ogni pozzetto. Utilizzare la stessa sequenza e lo stesso ritmo didistribuzione utilizzati per la soluzione di sviluppo.14. Asciugare accuratamente il fondo della piastra. Leggere la densità ottica a450/620 nm mediante un lettore nei 30 minuti successivi alla reazione. Nonesporre le strip alla luce prima della lettura.15. Prima della trascrizione dei risultati, verificare la corrispondenza fra la letturae il piano di distribuzione delle piastre e dei campioni.8. CALCOLO E INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI768.1 Determinazione della curva standardLa presenza e il titolo degli anticorpi di classe IgG diretti contro il T. gondii nelcampione testato sono determinate mettendo a confronto la densità ottica delcampione e una curva standard (OD = funzione IU/ml.). I sieri calibratori R4a,R4b, R4c sono calibrati sullo WHO International Standard TOX-M. Sebbene isieri calibratori utilizzati nel presente kit siano calibrati rispetto al sierodell'O.M.S., è possibile rilevare talune discrepanze nella titolazione di unostesso siero qualora questo sia testato mediante tecniche sierologiche diverse.Tale discordanza è dovuta al fatto che gli antigeni toxoplasmici impiegati nellediverse tecniche presentano proporzioni variabili di antigeni di membranasolubili.

Tracciare la curva standard [DO = funzione (UI/ml)] riportando le letture DO deicalibratori R3, R4a, R4b, R4c sull’asse verticale (Y), quindi la rispettivaconcentrazione in UI/ml sull’asse orizzontale (X). Per ogni campione analizzato,calcolare il titolo di anticorpi IgG anti-T. gondii ricavando la concentrazionecorrispondente alla DO misurata dalla curva standard disegnata.NB : se la densità ottica ottenuta per un campione diluito a 1/21 risultasuperiore alla densità ottica di R4c della curva di calibratura, dettocampione deve essere diluito a 1/210 nel diluente R7 e il dosaggio deveessere ripetuto; per calcolare il titolo di detto siero diluito a 1/210,moltiplicare per 10 le IU/ml ottenute sull'asse delle X.8.2 Controllo di qualitàIncludere tutti i calibratori in ogni seduta e analizzare i risultati ottenuti.Per la validazione del test, è necessario che siano soddisfatti i seguenti criteri:• Valori delle densità ottiche:DO R4a ≥ 0,200DO R4b ≥ 0,400• Rapporti delle densità ottiche:DO R4a / DO R3 ≥ 5,00DO R4b / DO R4a ≥ 2,20DO R4c / DO R4b ≥ 1,15Se non vengono rispettati i criteri del controllo di qualità, la seduta analiticadovrà essere ripetuta.8.3 Interpretazione dei risultatiTitolo di anticorpi anti-T. gondii(unità internazionali/ml)Titolo < 6 UI/ml6 UI/ml ≤ Titolo< 9 UI/mlTitolo ≥ 9 UI/mlRisultatoInterpretazioneNegativo Un risultato negativo o equivoco escludel’immunità acquisita, ma non un’infezioneEquivoco recente. In caso di sospetto dicontaminazione, è necessario analizzare unsecondo campione a circa due settimane didistanza.Positivo Un risultato positivo generalmente indicaun’infezione pregressa. Tuttavia, non si puòescludere un’infezione recente, soprattuttoin presenza di anticorpi IgM anti-T. gondii.È possibile osservare una maggiore variazione a concentrazioni superiori a 200UI/ml.8.4 Guida alla risoluzione dei problemiLe reazioni non convalidate o non ripetibili spesso sono causate da:• Lavaggi della micropiastra inadeguati.77

• Contaminazione dei campioni negativi tramite siero o plasma con alto titolodi anticorpi.• Contaminazione della soluzione di sviluppo tramite agenti chimici ossidanti(candeggina, ioni metallici...).• Contaminazione della Soluzione bloccante.9. EFFICACIAL’efficacia del kit Platelia Toxo IgG è stata valutata in 2 siti su un totale di1310 campioni di donne in gravidanza e donatori di sangue. In un centro, èstato effettuato uno studio comparativo utilizzando il Kit Platelia Toxo IgGTMB (72741) con metodica manuale; nell’altro centro, le prestazioni del KitPlatelia Toxo IgG sono state confrontate con il Kit Platelia Toxo IgG TMB(72741) utilizzando un analizzatore automatico di micropiastre. In aggiunta, leprestazioni del Kit Platelia Toxo IgG sono state valutate su 47 campioni disangue da cordone.9.1 PrevalenzaLa prevalenza degli anticorpi IgG anti-Toxoplasma gondii mediante il testPlatelia Toxo IgG è stata determinata su di un pannello di 538 campioni,principalmente di donne in gravidanza, provenienti dalla regione de Parigi(Francia). 128 campioni sono risultati positivi per gli anticorpi IgG antitoxoplasma.La prevalenza determinata mediante il test Platelia Toxo IgG siattesta intorno al 23,8% (128/538).9.2 Studi comparativi (sito 1)Le prestazioni del kit Platelia Toxo IgG sono state determinate su un di unpannello di 745 campioni e ripartiti come segue:• 606 sieri di donatori di sangue• 139 sieri di donne in gravidanzaI risultati sono stati confrontati con quelli ottenuti mediante il kit Platelia ToxoIgG TMB (72741) preso come riferimento.PlateliaToxo IgG(72840)Platelia Toxo IgG TMB (72741)Negativo Equivoco* Positivo TotaleNegativo 365 0 0 365Equivoco* 0 2 0 2Positivo 0 0 378 378Totale 365 2 378 745• Concordanza globale: 743/743 100,0% [IC 95% = 99,5% - 100,0%]• Specificità relativa: 365/365 100,0% [IC 95% = 99,0% - 100,0%]• Sensitività relativa: 378/378 100,0% [IC 95% = 99,0% - 100,0%]78* I campioni con risultato dubbio non sono stati inclusi nel calcolo per la valutazione dellasensibilità, specificità e concordanza.[CI 95%] = intervallo di confidenza 95%.

9.3 Efficacia (sito 2)Uno studio prospettico è stato condotto su 538 campioni principalmente didonne in gravidanza monitorate durante la gravidanza e testati nella routine dilaboratorio. Questi campioni sono stati testati in parallelo con i Kit PlateliaToxo IgG e Platelia Toxo IgG TMB (72741). Tutti i campioni di pazienti nonconosciuti nel databease del laboratorio e con un titolo inferiore a 100 UI/mlsono stati controllati con un secondo metodo.• Sensitive Agglutination (Laboratorio antigene: T. gondii, RH strain) per i siericon titolo > 10 UI/ml.• Immuno-fluorescenza indiretta (Laboratorio antigene: T. gondii, RH strain)per i sieri con titolo tra 3 e 10 UI/ml.I risultati sono stati confrontati con quelli ottenuti mediante il kit Platelia ToxoIgG TMB (72741) preso come riferimento.PlateliaToxo IgG(72840)Platelia Toxo IgG TMB (72741)Negativo Equivoco* Positivo TotaleNegativo 406 1 0 407Equivoco* 3 0 0 3Positivo 7 10 111 128Totale 416 11 111 538• Concordanza globale: 517/524 98,7% [IC 95% = 97,3% - 99,5%]• Specificità relativa: 406/413 98,3% [IC 95% = 96,5% - 99,3%]• Sensitività relativa: 111/111 100,0% [IC 95% = 96,8% - 100,0%]* I campioni con risultato dubbio non sono stati inclusi nel calcolo per la valutazione della sensibilità,specificità e concordanza.[CI 95%] = intervallo di confidenza 95%.I 7 campioni positivi discordanti con il Kit Platelia Toxo IgG sono staticonfermati positivi con i metodi complementari usati nel laboratorio (SensitiveAgglutination, Indirect Immuno-fluorescence)In aggiunta, 9 pannelli di sieroconversione, con tre campioni ciascuno, sonostati testati con i Kit Platelia Toxo IgG (72840) e Platelia Toxo IgG TMB(72741). Per ciascun pannello, il primo campione era negativo per la ricerca dianticorpi anti-Toxoplasma gondii IgG e IgM.In 8 dei 9 pannelli di sieroconversione, entrambi i Kit hanno dato risultati simili.Per un pannello, il 2° siero è stato trovato positivo con il Kit Platelia ToxoIgG, ma dubbio con il Kit Platelia Toxo IgG TMB79

9.4 Prestazioni su campioni di sangue da cordone ombelicale47 campioni di sangue da cordone sono stati testati seguendo il protocollodescritto al paragrafo 7.4 (diluizioner dei campioni 1/21):• 22 campioni da pazienti con toxoplasmosi congenita confermata• 18 campioni da infezione materna pregressa• 7 campioni da pazienti non infetteTutti i campioni da toxoplasmosi congenita e infezione materna pregressasono risultati positivi con il Kit Platelia Toxo IgG (72840), con tutti i campionida infezione materna pregressa negativi con il Kit Platelia Toxo IgM (72841). I7 campioni da pazienti non infette sono stati confermati negativi.Platelia Toxo IgG (72840) Platelia Toxo IgM (72841)Positivo Equivoco NegativoPositivo Equivoco NegativoToxoplasmosicongenita (n=22)Infezione maternapregressa (n=18)Assenza di infezione(n=7)22 0 0 18 2 218 0 0 0 0 180 0 7 0 0 79.5 Reattività crociataUn pannello di 197 campioni costituito da 159 campioni positivi per i markerrosolia, CMV, EBV, HSV, VZV, parotite , morbillo e HIV, e 30 campioni positiviper il fattore reumatoide, auto-anticorpi e anticorpi eterofili è stato testato con iltest Platelia Toxo IgG (72840) e il test Platelia Toxo IgG TMB (72741).141 campioni sono stati trovati negativi, 55 campioni positivi e un campionedubbio con il Kit Platelia Toxo IgG. Tutti i campioni positivi sono stati trovatipositivi anche con il Kit Platelia Toxo IgG TMB.9.6 Precisione• Precisione intra-saggio (ripetibilità):Al fine di valutare la ripetibilità intra-saggio, un campione negativo e trecampioni positivi sono stati analizzati 32 volte durante lo stesso ciclo. Laconcentrazione (UI/ml) è stata determinata per ciascun campione. La tabellariportata di seguito fornisce la media dei concentrazioni (UI/ml), la deviazionestandard (DS) e il coefficiente di variazione (%CV) per ciascuno dei quattrocampioni:80

Precisione intra-saggio (ripetibilità)N=32CampionenegativoCampionedebolmentepositivoCampionepositivoConcentrazione (UI/ml)CampionefortementepositivoMedia 0.15 16.0 39.8 167.5DS 0.01 2.3 2.7 23.1% CV 7.2% 14.4% 6.9% 13.8%• Precisione inter-saggio (riproducibilità):Al fine di valutare la riproducibilità inter-saggio, tutti e quattro i campioni (unonegativo e tre positivi) sono stati analizzati in duplicato in due cicli al giorno perun periodo di oltre 20 giorni. La concentrazione (UI/ml) è stata determinata perciascun campione. La tabella riportata di seguito fornisce la media deiconcentrazioni (UI/ml), la deviazione standard (DS) e il coefficiente di variazione(%CV) per ciascuno dei quattro campioni:Precisione inter-saggio (riproducibilità)N=80CampionenegativoCampionedebolmentepositivoCampionepositivoConcentrazione (UI/ml)CampionefortementepositivoMedia 0.15 15.2 41.7 166.5DS 0.05 2.4 4.2 21.0% CV 32.6% 15.5% 10.1% 12.6%9.7 Accuratezza e LinearitàPer valutare la accuratezza della calibrazione, sono state testate alcunediluizioni del WHO International Standard TOX-M. I risultati ottenuti dimostranoche il Kit Platelia Toxo IgG è perfettamente calibrato contro il WHOInternational Standard TOX-M per valori fino a 30 IU/ml. Al di sopra di 30 IU/ml,i risultati ottenuti sono sono sottostimati di circa il 25-50%.Utilizzando diluizioni seriali di 5 campioni positivi, il range del Kit Platelia ToxoIgG è stato determinato tra 7 and 200 UI/ml.10. LIMITI DELLA PROCEDURALa diagnosi dell'infezione da cytomegalovirus può essere stabilita solamentesulla base di una combinazione di dati clinici e biologici. Il risultato di unsingolo test di ricerca degli anticorpi IgG anti-T. gondii non costituisce unaprova sufficiente per la diagnosi dell'infezione da T. gondii.81

• Solo una combinazione di dati clinici e biologici (significativo aumento deglianticorpi IgG anti-T. gondii in 2 sieri prelevati da uno stesso paziente adistanza di 3 settimane e analizzati in una stessa seduta analitica, presenzadi un livello significativo di IgM anti-T. gondii, determinazione di IgG anti-T.gondii a bassa avidità) può confermare la diagnosi di un’infezione recente.• La sola presenza di anticorpi IgM anti-T. gondii non costituisce una provasufficiente per confermare un’infezione recente poiché gli anticorpi IgMpossono persistere per numerosi mesi o persino per anni dopo l’infezione.In presenza di IgM, è necessario eseguire una determinazione quantitativadegli anticorpi IgG anti-T. gondii, nonché un controllo dell’evoluzione deglianticorpi anti-T. gondii su almeno un secondo campione prelevato tresettimane più tardi.• Se un campione viene analizzato troppo precocemente durante una primoinfezione,gli anticorpi IgM anti-T. gondii potrebbero non essere ancorapresenti. In caso di dubbio, è necessario eseguire un secondo prelievo circa3 settimane più tardi sul quale verrà ripetuta la ricerca degli anticorpi IgM.11. CONTROLLO DI QUALITÀ DEL PRODUTTORETutti i reagenti prodotti sono preparati conformemente al nostro Sistema diqualità dal ricevimento delle materie prime fino alla commercializzazione delprodotto finale. Ogni lotto è sottoposto a un controllo di qualità e può esserecommercializzato solo se conforme ai criteri di accettazione prestabiliti. Ladocumentazione relativa alla produzione e ai controlli di ogni singolo lotto èconservata presso Bio-Rad.12. RIFERIMENTI BIBLIOGRAFICIVedere la versione Inglese.82

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