Espectroscopia de Fluorescencia 2 - Departamento de Química ...

Espectroscopía de emisiónmolecular - AplicacionesRelacion experimental entre lafluorescencia y la concentraciónφ f = Q = fotones emitidos / fotones absorbidos = I f / I absI abs = I inc·(1 - T) = I inc·(1 - 10 -A ) = 1 - 10 -εlcI f = φ f ·I abs = φ f ·(1 - 10 -εlc )si εlc → 0 ;(1 - 10 -εlc ) → 2.303 εlcY por lo tanto, I f = 2.303 φ f I inc εlcla aproximacion se cumple al 5% si A < 0.051

Métodos de análisisDirectos: para cuantificar un analito ya fluorescenteIndirectos:a) por formacion de complejos fluorescentes entre elanalito y una molecula auxiliar.b) por reaccion química que forma un compuestofluorescente.c) por disminucion de la fluorescencia (quenching) debidoa la presencia del analito.Metodos directos:Los iones de lantánidos y actinidos suelen mostrar fluorescencia.P.ej. Ce, Pr, Nd, U, etc.Ce (III) λ ex = 260nm, λ em = 350 nm.U(VI) λ ex = 520nm, λ em = 620 nm.Algunas moleculas de interes biomédico presentanfluorescencia. P. ej. Riboflavina (vitamina B12), NADH,FAD/FADH 2 , clorofila, aminoacidos aromáticos, porfina, etc2

Metodos indirectos:a) iones inorgánicos por formacion de complejos fluorescentesCa 2+ dependent fluorescenceemission spectra of fluo-3Familia del Calcium GreenEDTA3

Determinación de calcio• Calceina (λ ex = 450 nm, λ em = 520 nm).• fura-2, indo-1, fluo-3, fluo-4, Calcium Green-1.• -Ondas de concentración de Ca 2+ en ovocitos, asociados con lameiosis.Function and characteristics of repetitive calcium wavesassociated with meiosis, Alex McDougall and Christian Sardet,Current Biology 1995, 5:318-328Metodos indirectos:b) moléculas orgánicas por reacción químicaλ ex= 390 nm, λ em= 475 nm- aminas- aminoácidos- proteínasλ ex= 340 nm, λ em= 455 nm(Y en combinacioncon HPLC)4

Metodos indirectos:b2) actividad enzimáticaMetodos indirectos:c) por quenching de fluorescenciaComplejo de Zr-alizarinaexcitation 470 nm (azul)emision 520 nm (verde)Sensibilidad al F - 0.001 ug/mlInterferentes: Be, CO, Cr, Cu, Fe,Ni, Th, etc.Cu 2+ Bathocuporine 6x10 -3 ppmFe 3+ Rhodamine B 2x10 -3 ppmNi 2+ Na(PAN) 6x10 -5 ppmPb 2+ Eosin 1x10 -1 ppmF - Alizarina 1x10 -3 ppm5

Quenching estaticoLa emision decae con la concentración de quencher.Sistemas de mediciónsensores6

Sanguchitos de cubreobjetos rellenos con una solución 10 mM de [Ru(bpy) 3 ]Cl 2 , sumergidoen agua dentro de una capsula de Petri.Las fotos se toman a traves de un filtro anaranjado que deja pasar solamente lafluorescencia, se divide pixel a pixel por la iluminacion de excitacion correspondiente a cadapunto, se usa la curva de calibracion de Temperatura vs. fluorescencia y se muestran en falsocolor con ImageJ, despues de aplicar un filtro gaussian de 5 pixeles.(a) Durante el calentamiento se ve un gradiente de temperatura de 1 grado aprox.(b) Placa sin calentamiento, termalizada, se ven variaciones maximas de 0.18 ºC8

Optodos en el mar NegroVer el video de las variaciones en el tiempo en:http://www.mpi-bremen.de/Binaries/Binary14293/black_sea_fluctuations.gif9

Espectroscopía de emisiónmolecular - Conclusiones- la espectroscopía de fluorescencia presenta muy alta sensibilidadanalítica.- es posible aumentar la selectividad de la técnica mediantemétodos adecuados.- los equipos tradicionalmente fueron caros, pero su costo estábajando muy rapidamente.- es posible hacer medidas de buena calidad con instrumental decampo basado en equipos de uso masivo (cámaras, celulares, etc)- la microscopía de fluorescencia permite no sólo la detecciónsino la medición de parámetros químicos y físicos con altasensibilidad y robustez.10