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Trabajo práctico“Producción de proteínasrecombinantes en Pichia pastoris”Procesos Biotecnológicos II - 2013Pablo Ravasi

ResumenEs uno de los sistemas más utilizado para la expresión deproteínas recombinantes• Fácil manipulación genética• Alta velocidad de crecimiento• No requiere medios complejos (como las células animales)• Tiene la capacidad de crecer hasta elevadas densidades celulares• Muy buenos rendimientos en la expresión de proteínas (desde miligramos agramos por litro)• Capacidad de realizar modificaciones post traduccionales eucariotas(glicosilaciones, formación de puentes di sulfuro)• Secreta pocas proteínas nativas (purificación de proteínas de interés esrelativamente sencilla)

Microorganismo metilotrofoEs capaz de utilizar metanol como única fuente de carbonopara generar biomasa en condiciones aerobias.• El metabolismo del metanol ocurre en los peroxisomas (se libera H2O2)• La transformación de metanol se lleva a cabo por una única enzima llamadaAlcohol oxidasa (AOX)• Alcohol oxidasa transforma metanol en formaldehido y H2O2• El formaldehido es asimilado para formar parte de componentes celulares• Hay dos genes que codifican para la enzima alcohol oxidasa, AOX1 y AOX2(AOX1 fuerte, AOX2 débil)

Metabolismo del metanol

Expresión de proteínas desde el promotor AOX1“Your favourite gene”

Expresión de proteínas desde el promotor AOX1

Expresión de proteínas desde el promotor AOX1

Expresión de proteínas desde el promotor AOX1Ventajas:• Es un promotor fuerte• Inducible a bajas concentraciones de metanol• La transcripción está altamente reguladaDesventajas:• Monitorear la concentración de metanol durante elprocesos suele ser complicado• El metanol es inflamable y tóxico• No es deseable almacenar y manipular grandes cantidades

Estrategia de fermentación del TPStandard Methanol-Limited Fed Batch (MLFB)1. Crecimiento en Batch con glycerol como fuente de carbono2. Fase de Fed-batch con glicerol (Derrepresión AOX)3. Fase de transición (acostumbramiento al metanol)4. Fase de Fed-batch con metanol

Standard Methanol-Limited Fed Batch (MLFB)

Standard Methanol-Limited Fed Batch (MLFB)

Standard Methanol-Limited Fed Batch (MLFB)Medio de cultivo(INVITROGEN)

Standard Methanol-Limited Fed Batch (MLFB)Condiciones

Aspectos generales• En algunos casos el rendimiento alcanzado en una fermentación es 10 veces elobtenido en experimentos en frascos• 1 unidad de OD600=0,27g Peso seco= 1g WCW/L Peso• Velocidad máxima de crecimiento en glicerol mmax-gly=0,177 h -1• Rendimiento en glicerol Yx/gly = 0,69 gPS/g gly• mmax-meth= aprox 0,07 h -1 (puede variar dependiendo de cuanto afecte la expresión dela proteína recombinante el metabolismo del metanol)• Rendimiento en metanol Yx/meth = 0,32 gPS/g meth

Posibles soluciones• Se agrega casaminoácidos o peptonas que compiten con la proteasa y aumentan laestabilidad del producto deseado• Se agrega inhibidor de proteasas (PMSF)• Como Pichia pastoris es capaz de crecer en un rango de pH de 3-7, otra posibilidades disminuir el pH a un valor donde la proteasa no es activaLa proteína de interés puede no ser estable a otros pHs

Posibles soluciones• Disminuir la temperatura durante la inducción disminuye la lisis celular y elplegamiento de la proteína recombinanteSe alarga los tiempos del proceso (el cual ya es bastante)• Disminuir la velocidad de crecimiento en la fase de inducción (0,02 < m < 0,07),disminuyendo la concentración de metanol• Cepas mutantes en proteasas no son tan vigorosas como las WT, muestranmenores velocidades de crecimiento y menor viabilidad

Cepas P. pastorisP. pastoris tiene dos promotores responsables del metabolismo del metanolAOX1 (fuerte) y AOX2 (débil)(alcohol oxidasas)Cepa X33 Fenotipo mut + (methanol utilization plus), metaboliza metanol desdesus dos promotoresEn fermentaciones consume en promedio el 70% del volumen de cultivo de metanol

Actividades en el TP• Características y manejo del fermentador• Densidad óptica a 600nm (monitorear el crecimiento)• Concentración de glicerol durante fase de Fed Batch• Actividad enzimática en el sobrenadante