Aplicaciones biotecnológicas en el mejoramiento genético de ...
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Proyecto BID-PI-C-2001-1-A-071“<strong>Aplicaciones</strong> biotecnológicas <strong>en</strong> <strong>el</strong> mejorami<strong>en</strong>to g<strong>en</strong>ético <strong>de</strong> especies <strong>de</strong> Rhodophialachil<strong>en</strong>asINFORME TECNICO Y DE GESTION FINALEJECUTOR:Universidad Austral <strong>de</strong> Chile - Universidad <strong>de</strong> TalcaNOMBRE DEL PROYECTO:“<strong>Aplicaciones</strong> biotecnológicas <strong>en</strong> <strong>el</strong> mejorami<strong>en</strong>tog<strong>en</strong>ético <strong>de</strong> especies <strong>de</strong> Rhodophiala chil<strong>en</strong>as”.CODIGO:BID-PI-C-2001-1-A-071Nº INFORME: FINALPERIODO: <strong>de</strong>s<strong>de</strong>: 16 <strong>de</strong> <strong>en</strong>ero 2006 hasta: 29 <strong>de</strong> abril 2008NOMBRE Y FIRMA COORDINADOR PROYECTO:Peter Seemann F.USO INTERNO FIAFECHA RECEPCIONInforme Técnico y <strong>de</strong> Gestión Final 1
Proyecto BID-PI-C-2001-1-A-071“<strong>Aplicaciones</strong> biotecnológicas <strong>en</strong> <strong>el</strong> mejorami<strong>en</strong>to g<strong>en</strong>ético <strong>de</strong> especies <strong>de</strong> Rhodophialachil<strong>en</strong>asI. Activida<strong>de</strong>s <strong>de</strong>sarrolladas <strong>en</strong> la Universidad Austral <strong>de</strong> Chile1. Resum<strong>en</strong> Ejecutivo.Este informe correspon<strong>de</strong> a la ext<strong>en</strong>sión d<strong>el</strong> proyecto “<strong>Aplicaciones</strong> biotecnológicas <strong>en</strong> <strong>el</strong>mejorami<strong>en</strong>to g<strong>en</strong>ético <strong>de</strong> especies <strong>de</strong> Rhodophiala chil<strong>en</strong>as”. El proyecto tuvo como objetivoc<strong>en</strong>tral la multiplicación int<strong>en</strong>siva <strong>de</strong> los g<strong>en</strong>otipos <strong>de</strong> interés, junto con <strong>de</strong>sarrollar un método<strong>de</strong> crecimi<strong>en</strong>to rápido <strong>de</strong> bulbos que permitiera la visualización <strong>de</strong> la flor mejorada. Durante esaprimera etapa se advirtieron problemas principalm<strong>en</strong>te <strong>de</strong>rivados a la l<strong>en</strong>ta capacidad <strong>de</strong>multiplicación in vitro lo que dificultaba la obt<strong>en</strong>ción <strong>de</strong> líneas clonales y la propagación <strong>de</strong> losg<strong>en</strong>otipos <strong>de</strong> interés. A esto se sumaron otros problemas dados por la dificultad d<strong>el</strong> cultivo <strong>en</strong>inverna<strong>de</strong>ro y <strong>el</strong> ext<strong>en</strong>so período (3 a 5 años) que estas especies tardan <strong>en</strong> florecer. Por otrolado existía una falta <strong>de</strong> conocimi<strong>en</strong>to g<strong>en</strong>eral <strong>de</strong> las especies.En virtud <strong>de</strong> lo anterior, se <strong>de</strong>cidió proponer una ext<strong>en</strong>sión focalizándose a s<strong>el</strong>eccionar ymultiplicar g<strong>en</strong>otipos superiores, sin dar tanto énfasis a la obt<strong>en</strong>ción <strong>de</strong> poliploidía. En esteperíodo los esfuerzos estuvieron puestos <strong>en</strong> la obt<strong>en</strong>ción <strong>de</strong> g<strong>en</strong>otipos <strong>de</strong> mejor capacidad <strong>de</strong>multiplicación, la realización <strong>de</strong> estudios moleculares para clarificar las r<strong>el</strong>aciones filog<strong>en</strong>éticos<strong>de</strong> especies e híbridos, la optimización <strong>de</strong> los protocolos <strong>de</strong> cultivo in vitro utilizando <strong>en</strong> unaprimera etapa <strong>el</strong> sistema <strong>de</strong> inmersión temporal, <strong>de</strong>terminar las condiciones <strong>de</strong> manejo para<strong>en</strong>gorda <strong>de</strong> bulbos y postcosecha, y formar un banco g<strong>en</strong>ético <strong>de</strong> las especies <strong>de</strong> Rhodophialadisponible.La colección <strong>de</strong> germoplasma <strong>de</strong> Rhodophiala se <strong>en</strong>cu<strong>en</strong>tra in vivo tanto <strong>en</strong> <strong>el</strong> inverna<strong>de</strong>ro d<strong>el</strong>a Universidad <strong>de</strong> Talca, como <strong>en</strong> <strong>el</strong> <strong>de</strong> la Universidad Austral <strong>de</strong> Chile, <strong>en</strong> don<strong>de</strong> a<strong>de</strong>más secu<strong>en</strong>ta con una colección <strong>de</strong> g<strong>en</strong>otipos in vitro. Este valioso material g<strong>en</strong>ético se conservarápara futuros proyectos, o trabajos <strong>de</strong> tesis.A pesar d<strong>el</strong> largo período que requier<strong>en</strong> estas especies para florecer, fue posible evaluar lafloración <strong>de</strong> un g<strong>en</strong>otipo poliploi<strong>de</strong> mant<strong>en</strong>ido <strong>en</strong> <strong>el</strong> inverna<strong>de</strong>ro <strong>de</strong> la Universidad Austral <strong>de</strong>Chile. De este g<strong>en</strong>otipo se realizaron evaluaciones morfométricas y d<strong>el</strong> tamaño d<strong>el</strong> pol<strong>en</strong>. En lacolección mant<strong>en</strong>ida <strong>en</strong> la Universidad <strong>de</strong> Talca se realizó la inducción y evaluación d<strong>el</strong>crecimi<strong>en</strong>to <strong>de</strong> los bulbos, tanto <strong>en</strong> plantas diploi<strong>de</strong>s como poliploi<strong>de</strong>s.El trabajo realizado, <strong>de</strong> Cultivo <strong>en</strong> difer<strong>en</strong>tes condiciones ambi<strong>en</strong>tales, sumado al trabajo <strong>en</strong>terr<strong>en</strong>o y laboratorio, ha permitido obt<strong>en</strong>er resultados positivos, los cuales son un aporte alconocimi<strong>en</strong>to <strong>de</strong> estas especies y <strong>en</strong>tregan una base para un futuro manejo productivo <strong>de</strong>estas.Informe Técnico y <strong>de</strong> Gestión Final 2
Proyecto BID-PI-C-2001-1-A-071“<strong>Aplicaciones</strong> biotecnológicas <strong>en</strong> <strong>el</strong> mejorami<strong>en</strong>to g<strong>en</strong>ético <strong>de</strong> especies <strong>de</strong> Rhodophialachil<strong>en</strong>as2. Cumplimi<strong>en</strong>to <strong>de</strong> los objetivos.1. S<strong>el</strong>eccionar g<strong>en</strong>otipos superiores diploi<strong>de</strong>s y poliploi<strong>de</strong>s <strong>en</strong> cuanto a su capacidad <strong>de</strong>multiplicación in vitro.Se cumplió <strong>en</strong> un 50%, ya que solo se s<strong>el</strong>eccionaron g<strong>en</strong>otipos diploi<strong>de</strong>s. El cultivo <strong>de</strong> lasplantas poliploi<strong>de</strong>s fue difícil <strong>de</strong> mant<strong>en</strong>er <strong>de</strong>bido a que van perdi<strong>en</strong>do vigor lo que influye <strong>en</strong> susobreviv<strong>en</strong>cia.2. Aplicar los protocolos <strong>de</strong> multiplicación <strong>de</strong>sarrollados previam<strong>en</strong>te a g<strong>en</strong>otiposs<strong>el</strong>eccionados d<strong>el</strong> germoplasma disponible.Se aplicó <strong>el</strong> protocolo conv<strong>en</strong>cional <strong>en</strong> medio líquido y semisólido a los g<strong>en</strong>otiposs<strong>el</strong>eccionados.3. Mejorar protocolos <strong>de</strong> micropropagación con aplicación <strong>de</strong> difer<strong>en</strong>tes sistemas <strong>de</strong> cultivo yaclimatación in vitro y ex vitro.No se logró aum<strong>en</strong>tar la efici<strong>en</strong>cia <strong>en</strong> <strong>el</strong> cultivo in vitro <strong>de</strong> las difer<strong>en</strong>tes especies, <strong>de</strong>bido a qu<strong>el</strong>a respuesta al Cultivo estaba directam<strong>en</strong>te r<strong>el</strong>acionada con <strong>el</strong> g<strong>en</strong>otipo.4. Solicitar pat<strong>en</strong>te d<strong>el</strong> protocolo <strong>de</strong> multiplicación <strong>de</strong> microbulbillos in vitro <strong>de</strong>sarrollado.No se realizó <strong>de</strong>bido a que no se justifica realizar <strong>el</strong> pat<strong>en</strong>tami<strong>en</strong>to <strong>de</strong> un protocolo que eraespecífico solo para algunos g<strong>en</strong>otipos.5. Realizar estudios morfológicos, citológicos y moleculares <strong>en</strong> torno a clarificar r<strong>el</strong>acionesfilog<strong>en</strong>éticos <strong>en</strong>tre especies e híbridos.Se realizaron <strong>en</strong> la gran mayoría <strong>de</strong> las especies. Se concluyó que existe una reducidavariabilidad <strong>en</strong>tre un grupo <strong>de</strong> especies, <strong>el</strong> que a su vez difiere fuertem<strong>en</strong>te <strong>de</strong> especies comoR. rhodolirion y R. cipoana, reafirmándose la necesidad <strong>de</strong> revisar la taxonomía d<strong>el</strong> género.6. Formar bancos g<strong>en</strong>ético in vitro e in vivo <strong>de</strong> especies <strong>de</strong> Rhodophiala disponible.Se logró formar un Banco <strong>de</strong> germoplasma tanto in vitro como in vivo, <strong>en</strong> la Universidad Austral<strong>de</strong> Chile e in vivo <strong>en</strong> la Universidad <strong>de</strong> Talca.7. Pres<strong>en</strong>tar los avances obt<strong>en</strong>idos <strong>en</strong> reuniones técnicas especializadasSe pres<strong>en</strong>taron trabajos a diversos congresos ci<strong>en</strong>tíficos.Informe Técnico y <strong>de</strong> Gestión Final 3
Proyecto BID-PI-C-2001-1-A-071“<strong>Aplicaciones</strong> biotecnológicas <strong>en</strong> <strong>el</strong> mejorami<strong>en</strong>to g<strong>en</strong>ético <strong>de</strong> especies <strong>de</strong> Rhodophialachil<strong>en</strong>asCuadro 1. Activida<strong>de</strong>s y tareas ejecutadas.Nº <strong>de</strong>Actividad a <strong>de</strong>sarrollarTarea ejecutadaactividad1 S<strong>el</strong>ección por observación visual <strong>de</strong> g<strong>en</strong>otipos 100%multiplicados in vitro <strong>de</strong> acuerdo a aptitu<strong>de</strong>s <strong>de</strong>propagación.Realizado1 Multiplicar g<strong>en</strong>otipos s<strong>el</strong>eccionados mediante sistema 80%<strong>de</strong> cultivo estacionario y sistema <strong>de</strong> inmersión temporalRazón El sistema <strong>de</strong> inmersión temporal no pres<strong>en</strong>tódiscrepancia mejoras significativas <strong>en</strong> los coefici<strong>en</strong>tes <strong>de</strong>multiplicación, a<strong>de</strong>más se produjo pérdida <strong>de</strong>plantas por problemas r<strong>el</strong>acionados con lahiperhidricidad (vitrificación), por lo que no seaplicó <strong>en</strong> todas las especies.2 Ejecución d<strong>el</strong> <strong>en</strong>sayo 1: efecto d<strong>el</strong> paclobutrazol <strong>en</strong> la 100%especie o híbrido más difícil <strong>de</strong> multiplicar <strong>de</strong> acuerdo aproceso <strong>de</strong> multiplicación previo.Realizado3 Ejecución d<strong>el</strong> <strong>en</strong>sayo 2: evaluar la interacción <strong>en</strong>tre la 100%citoquinina meta-topolina y paclobutrazol sobre lamultiplicación <strong>de</strong> microbulbillos in vitro.Realizado4 Procesami<strong>en</strong>to <strong>de</strong> datos y análisis estadístico 100%Realizado5 Ejecución d<strong>el</strong> <strong>en</strong>sayo 3: evaluar <strong>el</strong> efecto <strong>de</strong> lacauterización apical <strong>de</strong> microbulbillos <strong>en</strong> una especiedifícil <strong>de</strong> multiplicar.100%Realizado6 Procesami<strong>en</strong>to <strong>de</strong> datos y análisis estadístico 100%Realizado1 Extracción <strong>de</strong> ADN <strong>de</strong> especies <strong>en</strong> estudio yamplificación <strong>de</strong> regiones ITS1 e ITS2 mediante PCR100%Realizado2 Purificación <strong>de</strong> fragm<strong>en</strong>tos <strong>de</strong> ADN y secu<strong>en</strong>ciación 100%Realizado3 Análisis <strong>de</strong> secu<strong>en</strong>cias y comparación con secu<strong>en</strong>ciasexist<strong>en</strong>tes <strong>en</strong> bases <strong>de</strong> datosRealizado4 Digestión <strong>de</strong> fragm<strong>en</strong>tos PCR por <strong>en</strong>zimas <strong>de</strong>restricción y separación <strong>de</strong> productos <strong>en</strong> g<strong>el</strong>es <strong>de</strong>agarosaDiscrepancia Debido a los escasos sitios <strong>de</strong> restricciónpolimórficos se reemplazó esta actividad por <strong>el</strong>análisis <strong>de</strong> polimorfismos a niv<strong>el</strong> <strong>de</strong> mutacionespuntuales intra e interespecíficas y <strong>el</strong> estudio <strong>de</strong> los100%100%Informe Técnico y <strong>de</strong> Gestión Final 4
Proyecto BID-PI-C-2001-1-A-071“<strong>Aplicaciones</strong> biotecnológicas <strong>en</strong> <strong>el</strong> mejorami<strong>en</strong>to g<strong>en</strong>ético <strong>de</strong> especies <strong>de</strong> Rhodophialachil<strong>en</strong>ascromatogramas <strong>de</strong>rivados <strong>de</strong> las reacciones <strong>de</strong>secu<strong>en</strong>ciación.6 Realizar estudios cariológicos y moleculares <strong>de</strong> lasespecies <strong>en</strong> estudioRealizado7 Ejecución <strong>de</strong> <strong>en</strong>sayo 4: Aplicación <strong>de</strong> resultados <strong>de</strong>MTP-PBZ y cauterización apical <strong>en</strong> SCE <strong>en</strong> híbridos <strong>de</strong>Rhodophiala.Realizado8 Procesami<strong>en</strong>to <strong>de</strong> datos y análisis estadístico <strong>de</strong> <strong>en</strong>sayo4Realizado1 Ejecución <strong>en</strong>sayo 5: Determinar tiempo y frecu<strong>en</strong>cia <strong>de</strong>inmersión <strong>en</strong> sistema <strong>de</strong> inmersión temporal <strong>en</strong> R.bagnoldii y R. spl<strong>en</strong>d<strong>en</strong>sDiscrepancia No realizado <strong>de</strong>bido a que los <strong>en</strong>sayos anteriores nopermitieron increm<strong>en</strong>tar la cantidad <strong>de</strong> plántulaspara contar con material sufici<strong>en</strong>te para montar <strong>el</strong><strong>en</strong>sayo2 Ejecución <strong>en</strong>sayo 5: Determinar tiempo y frecu<strong>en</strong>cia <strong>de</strong>inmersión <strong>en</strong> sistema <strong>de</strong> inmersión temporal <strong>en</strong> R.montana y R. aff. laetaDiscrepancia No realizado <strong>de</strong>bido a que los <strong>en</strong>sayos anteriores nopermitieron increm<strong>en</strong>tar la cantidad <strong>de</strong> plántulaspara contar con material sufici<strong>en</strong>te para montar <strong>el</strong><strong>en</strong>sayo3 Procesami<strong>en</strong>to <strong>de</strong> datos y análisis estadístico. 0%4 Ejecución <strong>en</strong>sayo 6: Determinar cantidad <strong>de</strong> explantes<strong>en</strong> sistema <strong>de</strong> inmersión temporal <strong>en</strong>, R. bagnoldii y R.spl<strong>en</strong>d<strong>en</strong>sDiscrepancia Realizado solam<strong>en</strong>te para R. spl<strong>en</strong>d<strong>en</strong>s <strong>de</strong>bido aque solo <strong>en</strong> esa especie se contaba con materialsufici<strong>en</strong>te para montar este <strong>en</strong>sayo5 Ejecución <strong>en</strong>sayo 6: Determinar cantidad <strong>de</strong> explantes<strong>en</strong> sistema <strong>de</strong> inmersión temporal <strong>en</strong> R. montana y R.aff. laetaDiscrepancia No realizado <strong>de</strong>bido a que los <strong>en</strong>sayos anteriores nopermitieron increm<strong>en</strong>tar la cantidad <strong>de</strong> plántulaspara contar con material sufici<strong>en</strong>te para montar <strong>el</strong><strong>en</strong>sayo6 Procesami<strong>en</strong>to <strong>de</strong> datos y análisis estadístico. 0%7 Aplicar cultivo <strong>de</strong> inmersión temporal <strong>en</strong> los 10 híbridos<strong>de</strong> Rhodophiala <strong>de</strong> acuerdo a resultados anteriores100%100%100%0% (No se ha realizado<strong>de</strong>bido a falta <strong>de</strong> materialvegetal)0% (No se ha realizado<strong>de</strong>bido a falta <strong>de</strong> materialvegetal)50% (se ha realizadopara R. spl<strong>en</strong>d<strong>en</strong>s)0% (Aun no se harealizado por no contarcon <strong>el</strong> material vegetalsufici<strong>en</strong>te)0% (Aun no se harealizado por no contarcon <strong>el</strong> material vegetalsufici<strong>en</strong>te)Informe Técnico y <strong>de</strong> Gestión Final 5
Proyecto BID-PI-C-2001-1-A-071“<strong>Aplicaciones</strong> biotecnológicas <strong>en</strong> <strong>el</strong> mejorami<strong>en</strong>to g<strong>en</strong>ético <strong>de</strong> especies <strong>de</strong> Rhodophialachil<strong>en</strong>asNo realizado <strong>de</strong>bido al bajo vigor <strong>de</strong> los híbridos y ala reducción d<strong>el</strong> material original. Debido a loescaso d<strong>el</strong> material se <strong>de</strong>terminó mant<strong>en</strong>erlo <strong>en</strong> unsistema <strong>de</strong> Cultivo in vitro conocido y no arriesgarlo<strong>en</strong> un sistema <strong>de</strong> inmersión temporal que noproveyó una mayor tasa <strong>de</strong> multiplicación <strong>en</strong> <strong>el</strong> caso<strong>de</strong> Rhodophiala8 Aclimatación in vitro <strong>de</strong> cuatro especies <strong>de</strong> Rhodophiala 75% (Se ha realizadopara R. montana, R.spl<strong>en</strong>d<strong>en</strong>s y R. ananuca).Discrepancia Se realizó <strong>en</strong> forma masiva para las especies R.montana, R. spl<strong>en</strong>d<strong>en</strong>s y R. ananuca, especies quese adaptaron a las condiciones <strong>de</strong> inverna<strong>de</strong>ro nocalefaccionado <strong>de</strong> Valdivia. Se manti<strong>en</strong><strong>en</strong> algunosejemplares <strong>de</strong> otras especies como R. bagnoldii, R.phyc<strong>el</strong>loi<strong>de</strong>s y R. rhodolirion m<strong>en</strong>os adaptadas,junto con algunos híbridos9 Procesami<strong>en</strong>to <strong>de</strong> datos y análisis estadístico 75%10 Aclimatación ex vitro <strong>de</strong> las especies e híbridos <strong>de</strong>Rhodophiala75% (Se ha realizadopara R. montana, R.spl<strong>en</strong>d<strong>en</strong>s y R. ananuca).Discrepancia Se realizó <strong>en</strong> forma masiva para las especies R.montana, R. spl<strong>en</strong>d<strong>en</strong>s y R. ananuca, especies quese adaptaron a las condiciones <strong>de</strong> inverna<strong>de</strong>ro nocalefaccionado <strong>de</strong> Valdivia. Se manti<strong>en</strong><strong>en</strong> algunosejemplares <strong>de</strong> otras especies como R. bagnoldii, R.phyc<strong>el</strong>loi<strong>de</strong>s y R. rhodolirion m<strong>en</strong>os adaptadas,junto con algunos híbridos1 Preparación <strong>de</strong> texto para solicitud <strong>de</strong> pat<strong>en</strong>te No ejecutado (se solicita<strong>el</strong>iminar)No ejecutado, se solicitó <strong>el</strong>iminar2 Preparación y tramitación <strong>de</strong> solicitud <strong>de</strong> pat<strong>en</strong>te No ejecutado (se solicita<strong>el</strong>iminar)3 Análisis y contestación <strong>de</strong> Informes pr<strong>el</strong>iminares ypericialesNo ejecutado, se solicitó <strong>el</strong>iminar4 Análisis y contestación <strong>de</strong> Informes pr<strong>el</strong>iminares ypericialesNo ejecutado, se solicitó <strong>el</strong>iminarNo ejecutado (se solicita<strong>el</strong>iminar)No ejecutado (se solicita<strong>el</strong>iminar)Informe Técnico y <strong>de</strong> Gestión Final 6
Proyecto BID-PI-C-2001-1-A-071“<strong>Aplicaciones</strong> biotecnológicas <strong>en</strong> <strong>el</strong> mejorami<strong>en</strong>to g<strong>en</strong>ético <strong>de</strong> especies <strong>de</strong> Rhodophialachil<strong>en</strong>as3. Análisis <strong>de</strong> brecha.Se t<strong>en</strong>ía contemplado realizar <strong>en</strong>sayos mediante <strong>el</strong> Cultivo <strong>en</strong> <strong>el</strong> Sistema <strong>de</strong> InmersiónTemporal con cuatro especies <strong>de</strong> Rhodophiala (R. montana, R. spl<strong>en</strong>d<strong>en</strong>s, R. bagnoldii y R.ananuca (ex laeta) y diez híbridos, sin embargo, la cantidad <strong>de</strong> material vegetal por g<strong>en</strong>otipos<strong>el</strong>eccionado y disponible fue insufici<strong>en</strong>te para establecer un <strong>en</strong>sayo con las repeticionesnecesarias para validarse estadísticam<strong>en</strong>te. Debido a este inconv<strong>en</strong>i<strong>en</strong>te se solicitó realizaruna reprogramación <strong>de</strong> las activida<strong>de</strong>s propuestas <strong>en</strong> <strong>el</strong> proyecto, trabajándose solo con <strong>el</strong>material que se <strong>en</strong>cu<strong>en</strong>tre disponible <strong>en</strong> mayor cantidad.El objetivo Nº 4, activida<strong>de</strong>s Nº 1-4 “Preparación <strong>de</strong> texto para solicitud <strong>de</strong> pat<strong>en</strong>te” se solicitó aFIA <strong>el</strong>iminarlo, con la consigui<strong>en</strong>te <strong>de</strong>volución <strong>de</strong> los fondos consi<strong>de</strong>rados para ese ítem,<strong>de</strong>bido a que los resultados obt<strong>en</strong>idos <strong>en</strong> cultivo in vitro sólo son aplicables a g<strong>en</strong>otiposespecíficos y no se han logrado obt<strong>en</strong>er plantas poliploi<strong>de</strong>s que puedan multiplicarseint<strong>en</strong>sivam<strong>en</strong>te.Debido a que <strong>en</strong> g<strong>en</strong>eral Rhodophiala ha sido un género que no respon<strong>de</strong> efici<strong>en</strong>tem<strong>en</strong>te alcultivo in vitro, no es posible <strong>el</strong>aborar un protocolo aplicable para un sistema <strong>de</strong> propagaciónmasiva. Por lo tanto, se <strong>de</strong>cidió no pres<strong>en</strong>tar solicitud <strong>de</strong> pat<strong>en</strong>tami<strong>en</strong>to <strong>de</strong> los protocolos<strong>el</strong>aborados.4. Metodología.4.1. Descripción <strong>de</strong> la metodología efectivam<strong>en</strong>te utilizada durante <strong>el</strong> proyecto.Durante la ejecución <strong>de</strong> este proyecto se aplicaron varias metodologías, algunas <strong>de</strong> las cualesfueron modificadas <strong>en</strong> base a los <strong>en</strong>sayos que se realizaron. Entre las metodologías utilizadasse <strong>en</strong>cu<strong>en</strong>tran: Validación <strong>de</strong> metodología empleada <strong>en</strong> la observación <strong>de</strong> cromosoma, para estudio <strong>de</strong>cariotipos y recu<strong>en</strong>tos cromosómicos durante inducción <strong>de</strong> poliploidía. Validación <strong>de</strong> técnica <strong>de</strong> análisis <strong>de</strong> pol<strong>en</strong> para <strong>de</strong>terminar niv<strong>el</strong> <strong>de</strong> ploidía. Validación <strong>de</strong> metodología empleada <strong>en</strong> la inducción <strong>de</strong> poliploidía, <strong>en</strong> base a laaplicación <strong>de</strong> antimicóticos como la colchicina. Validación <strong>de</strong> metodología empleada <strong>en</strong> la germinación <strong>de</strong> semillas tanto in vivo comoin vitro Validación <strong>de</strong> metodología empleada <strong>en</strong> la multiplicación <strong>de</strong> microbulbillos in vitro Validación <strong>de</strong> metodología <strong>de</strong> crecimi<strong>en</strong>to rápido <strong>de</strong> bulbos in vitro y aclimatación <strong>de</strong>plantas <strong>en</strong> inverna<strong>de</strong>ro. Validación <strong>de</strong> metodología para la extracción <strong>de</strong> ADN, amplificación y purificación <strong>de</strong>productos PCR <strong>de</strong> región ITSInforme Técnico y <strong>de</strong> Gestión Final 7
Proyecto BID-PI-C-2001-1-A-071“<strong>Aplicaciones</strong> biotecnológicas <strong>en</strong> <strong>el</strong> mejorami<strong>en</strong>to g<strong>en</strong>ético <strong>de</strong> especies <strong>de</strong> Rhodophialachil<strong>en</strong>as4.1.1 Ensayos establecidos <strong>en</strong> cultivo in vitro4.1.1.1 Cauterización <strong>de</strong> la zona apical <strong>de</strong> microbulbillos <strong>de</strong> difer<strong>en</strong>tes g<strong>en</strong>otipos <strong>de</strong> R.bagnoldii.Para <strong>el</strong>lo se utilizaron microbulbillos in vitro <strong>de</strong> difer<strong>en</strong>tes g<strong>en</strong>otipos <strong>de</strong> Rhodophiala bagnoldii.A cada microbulbillo se le realizó un corte basal, y una cauterización d<strong>el</strong> ápice con bisturí, loscuales fueron sembrados <strong>en</strong> 30 ml <strong>de</strong> medio <strong>de</strong> cultivo MS 100%, <strong>en</strong> estado líquido. Estemedio <strong>de</strong> cultivo fue adicionado con 0,5 mg/L <strong>de</strong> meta-topolina (MTP) y 0,25 mg/L <strong>de</strong>paclobutrazol (PBZ), a<strong>de</strong>más <strong>de</strong> un medio testigo sin la adición <strong>de</strong> reguladores <strong>de</strong> crecimi<strong>en</strong>to..Se utilizaron 10 repeticiones por tratami<strong>en</strong>to, sembrando <strong>en</strong> cada frasco microbulbillos con unpeso igual o superior a 1.0 g. La incubación se realizó a 23ºC, 3000 lux y 16 horas <strong>de</strong> luz,incubándolas durante un período <strong>de</strong> tres meses.Se aplicó ANOVA y comparaciones múltiples <strong>de</strong> promedio mediante <strong>el</strong> test LSD (difer<strong>en</strong>ciamínima significativa) al 5% <strong>de</strong> significancia, con excepción <strong>de</strong> la variable Tasa <strong>de</strong> propagaciónque se evaluó mediante <strong>el</strong> Test <strong>de</strong> Kruskall Wallis, aplicando <strong>el</strong> Test <strong>de</strong> Bonferroni paracomparaciones múltiples <strong>de</strong> promedios.En base a los análisis estadísticos realizados se pue<strong>de</strong> observar que provocar unacauterización apical <strong>en</strong> la planta no ti<strong>en</strong>e un efecto significativo <strong>en</strong> la reg<strong>en</strong>eración <strong>de</strong> nuevosmicrobulbillos, ni <strong>en</strong> ninguno <strong>de</strong> los otros parámetros analizados.4.1.1.2. Cultivo <strong>de</strong> microbulbillos <strong>de</strong> difer<strong>en</strong>tes g<strong>en</strong>otipos <strong>de</strong> R. spl<strong>en</strong>d<strong>en</strong>s y d<strong>el</strong> g<strong>en</strong>otipos<strong>el</strong>eccionado Nº 363.Los microbulbillos se sembraron <strong>en</strong> medio <strong>de</strong> cultivo MS adicionado con 2.2, 4.4, 11.1, 22.2 M<strong>de</strong> meta-topolina (MTP) y 1.7, 3.4, 8.5 y 17.0 M <strong>de</strong> Paclobutrazol (PBZ), solos o <strong>en</strong>combinación, a<strong>de</strong>más d<strong>el</strong> tratami<strong>en</strong>to testigo sin la adición <strong>de</strong> reguladores <strong>de</strong> crecimi<strong>en</strong>to. Seutilizaron 10 repeticiones por tratami<strong>en</strong>to, sembrando <strong>en</strong> cada frasco microbulbillos con unpeso igual o superior a 1.0 g. La incubación se realizó a 23ºC, 3000 lux y 16 horas <strong>de</strong> luz,incubándolas durante un período <strong>de</strong> tres meses.Cuadro 2. Tratami<strong>en</strong>tos aplicados a difer<strong>en</strong>tes g<strong>en</strong>otipos <strong>de</strong> R. spl<strong>en</strong>d<strong>en</strong>sTratami<strong>en</strong>to MTP (µM) PBZ (µM)1 (Testigo) 0 02 2,2 03 4,4 04 11,1 05 22,2 06 0 1,77 0 3,48 0 8,59 0 17,010 2,2 1,711 4,4 3,412 22,2 17,0MTP: MetatopolinaPBZ: PaclobutrazolInforme Técnico y <strong>de</strong> Gestión Final 8
Proyecto BID-PI-C-2001-1-A-071“<strong>Aplicaciones</strong> biotecnológicas <strong>en</strong> <strong>el</strong> mejorami<strong>en</strong>to g<strong>en</strong>ético <strong>de</strong> especies <strong>de</strong> Rhodophialachil<strong>en</strong>asSe analizaron los datos correspondi<strong>en</strong>tes a los parámetros:Peso <strong>de</strong> plantaPeso <strong>de</strong> bulboN° <strong>de</strong> brotesLargo <strong>de</strong> brotesDiámetro <strong>de</strong> bulboHiperhidricidadContaminaciónIndice <strong>de</strong> multiplicación: (N° bulbos finales – N° bulbos iniciales)/N° bulbos inicialesIndice <strong>de</strong> crecimi<strong>en</strong>to: (Peso fresco final – peso fresco inicial)/Peso fresco inicialDifer<strong>en</strong>cia <strong>de</strong> peso (Peso final – peso inicial).Para cada parámetro se verificó si la distribución <strong>de</strong> los datos se ajusta a una distribuciónnormal mediante la prueba <strong>de</strong> Shapiro-Wilks. Luego se realizó la prueba <strong>de</strong> Lev<strong>en</strong>e’s paracorroborar la homocedasticidad o heterocedasticidad <strong>de</strong> las varianzas <strong>de</strong> los tratami<strong>en</strong>tos. Encaso <strong>de</strong> no ajustarse a una distribución normal (lo que sucedió <strong>en</strong> todos los parámetrosestudiados) o resultar varianzas heterocedásticas se realizó <strong>el</strong> test <strong>de</strong> Kruskal Wallis, paraluego realizar la comparación múltiple <strong>de</strong> promedios <strong>de</strong> Bonferroni.4.1.1.3. Reg<strong>en</strong>eración <strong>de</strong> microbulbillos <strong>de</strong> R. bagnoldii y R. montana <strong>en</strong> medio líquidoadicionado con retardantes <strong>de</strong> crecimi<strong>en</strong>to.Se realizaron dos <strong>en</strong>sayos <strong>en</strong> forma in<strong>de</strong>p<strong>en</strong>di<strong>en</strong>te con microbulbillos <strong>de</strong> difer<strong>en</strong>tes g<strong>en</strong>otipos<strong>de</strong> R. bagnoldii y R. montana, cultivado <strong>en</strong> medio adicionado con 0.85, 1.7, 3.4 y 6.8 M <strong>de</strong>Paclobutrazol (PBZ), a<strong>de</strong>más <strong>de</strong> un medio <strong>de</strong> Cultivo sin reguladores <strong>de</strong> crecimi<strong>en</strong>to (Testigo 1)y <strong>de</strong> un medio <strong>de</strong> cultivo adicionado solo con 4.4 M <strong>de</strong> MTP (Testigo 2).Se aplicó un ANOVA y comparaciones múltiples <strong>de</strong> promedio mediante <strong>el</strong> test LSD (difer<strong>en</strong>ciamínima significativa) al 5% <strong>de</strong> significancia, con excepción <strong>de</strong> la variable Tasa <strong>de</strong> propagaciónque se evaluó mediante <strong>el</strong> test <strong>de</strong> Kruskall Wallis, aplicando <strong>el</strong> Test <strong>de</strong> Bonferroni paracomparaciones múltiples <strong>de</strong> promedios.En <strong>el</strong> caso d<strong>el</strong> <strong>en</strong>sayo con R. bagnoldii para la evaluación estadística fueron <strong>el</strong>iminadosalgunos tratami<strong>en</strong>tos <strong>de</strong>bido a la pérdida <strong>de</strong> material por contaminación.4.1.1.4. Efecto <strong>de</strong> distintos sistemas <strong>de</strong> cultivo in vitro.Se comparó <strong>el</strong> efecto <strong>de</strong> distintos métodos para <strong>el</strong> Cultivo in vitro <strong>en</strong> R. spl<strong>en</strong>d<strong>en</strong>s, R. ananucay R.montana.1. Cultivo <strong>en</strong> medio sólido.2. Cultivo <strong>en</strong> medio líquido estacionario con base <strong>de</strong> algodón hidrófilo3. Cultivo <strong>en</strong> medio líquido <strong>en</strong> agitación orbital.4. Cultivo <strong>en</strong> sistema <strong>de</strong> inmersión temporal (SIT); utilizando 20 mL <strong>de</strong> medio <strong>de</strong> cultivo(SIT 20), 40 mL (SIT 40), y 60 mL (SIT 60), con una frecu<strong>en</strong>cia <strong>de</strong> inmersión <strong>de</strong> 3minutos cada 12 horas.En todos los casos se utilizó medio MS suplem<strong>en</strong>tado con vitaminas, reguladores <strong>de</strong>crecimi<strong>en</strong>to (0,54 M <strong>de</strong> ANA y 4,4 M <strong>de</strong> BAP), 30 g/L <strong>de</strong> sacarosa y <strong>en</strong> <strong>el</strong> medio solidificadocon agar se agregaron 8 g/L.Informe Técnico y <strong>de</strong> Gestión Final 9
Proyecto BID-PI-C-2001-1-A-071“<strong>Aplicaciones</strong> biotecnológicas <strong>en</strong> <strong>el</strong> mejorami<strong>en</strong>to g<strong>en</strong>ético <strong>de</strong> especies <strong>de</strong> Rhodophialachil<strong>en</strong>asLa unidad experim<strong>en</strong>tal consistió <strong>en</strong> cinco microbulbillos d<strong>en</strong>tro <strong>de</strong> cada unidad SIT. Para cadaespecie se instalaron nueve unida<strong>de</strong>s SIT, y cada una constituyó una repetición aplicándosetres repeticiones por tratami<strong>en</strong>to.En los tratami<strong>en</strong>tos consist<strong>en</strong>tes <strong>en</strong> la aplicación <strong>de</strong> sistemas <strong>de</strong> Cultivo líquido estacionariocon soporte <strong>de</strong> disco <strong>de</strong> algodón, líquido <strong>en</strong> agitación orbital y <strong>en</strong> medio solidificada con agar,la unidad experim<strong>en</strong>tal con cinco microbulbillos fue <strong>de</strong>positada <strong>en</strong> cont<strong>en</strong>edor <strong>de</strong> 1L, con 100mL <strong>de</strong> medio <strong>de</strong> cultivo, existi<strong>en</strong>do tres repeticiones por tratami<strong>en</strong>to.La evaluación <strong>de</strong> los resultados se realizó a través d<strong>el</strong> recu<strong>en</strong>to d<strong>el</strong> número <strong>de</strong> brotes, pesofresco, peso fresco <strong>de</strong> bulbos (separados <strong>de</strong> hojas y raíces), pres<strong>en</strong>cia <strong>de</strong> par<strong>de</strong>ami<strong>en</strong>to(mediante <strong>el</strong> registro d<strong>el</strong> número <strong>de</strong> plantas pres<strong>en</strong>tando regiones par<strong>de</strong>adas) e hiperhidricidad(mediante <strong>el</strong> registro <strong>de</strong> plántulas anormales que mostraban tejidos traslúcidos).Para <strong>de</strong>terminar la cantidad <strong>de</strong> explantes a cultivar por cada unidad <strong>de</strong> inmersión temporal, serealizó un <strong>en</strong>sayo con R. spl<strong>en</strong>d<strong>en</strong>s, g<strong>en</strong>otipo Nº 363. Para <strong>el</strong>lo se colocaron 10, 20 y 30microbulbillos con corte <strong>en</strong> la placa basal <strong>en</strong> frascos <strong>de</strong> 500 mL <strong>de</strong> volum<strong>en</strong>, con 200 mL <strong>de</strong>medio <strong>de</strong> cultivo Murashige y Skoog (1962) adicionado con 2,2 µM <strong>de</strong> MTP, con una frecu<strong>en</strong>cia<strong>de</strong> inmersión <strong>de</strong> 1 minuto/día.La evaluación <strong>de</strong> este <strong>en</strong>sayo se realizó a través <strong>de</strong> 3 períodosDebido a los resultados negativos d<strong>el</strong> <strong>en</strong>sayo anterior, se estableció un nuevo <strong>en</strong>sayo con R.montana g<strong>en</strong>otipo Nº 613 y R. spl<strong>en</strong>d<strong>en</strong>s g<strong>en</strong>otipo Nº 571, utilizando 3 repeticiones con 7explantes por repetición. Estos explantes consist<strong>en</strong> <strong>en</strong> trozos <strong>de</strong> microbulbillos con placa basal<strong>en</strong> medio <strong>de</strong> cultivo MS adicionado con 2,2 µM <strong>de</strong> MTP y 0,85 µM <strong>de</strong> PBZ. Las condiciones <strong>de</strong>cultivo fueron con una frecu<strong>en</strong>cia <strong>de</strong> inmersión <strong>de</strong> 1 minuto/día.4.1.1.5. Aclimatación y crecimi<strong>en</strong>to post transplante <strong>de</strong> material prov<strong>en</strong>i<strong>en</strong>te <strong>de</strong>condiciones in vitro.Una vez finalizada la etapa <strong>de</strong> cultivo in vitro se realizó la aclimatación <strong>de</strong> los microbulbillosprov<strong>en</strong>i<strong>en</strong>tes <strong>de</strong> medios <strong>de</strong> cultivo <strong>en</strong> difer<strong>en</strong>tes estados (líquido y sólido). Este experim<strong>en</strong>to serealizó para microbulbillos <strong>de</strong> R. ananuca, R. spl<strong>en</strong>d<strong>en</strong>s y R. montana <strong>en</strong> forma separada.El diseño experim<strong>en</strong>tal fue completam<strong>en</strong>te aleatorizado con cuatro repeticiones portratami<strong>en</strong>to. Cada repetición consistió <strong>en</strong> cuatro microbulbillos plantados <strong>en</strong> ban<strong>de</strong>jas plásticascon sustrato ar<strong>en</strong>a:turba, mant<strong>en</strong>idas <strong>en</strong> cámara <strong>de</strong> aclimatación. Se evaluó inicialm<strong>en</strong>te <strong>el</strong>peso, diámetro, número, longitud <strong>de</strong> hojas y raíces y luego <strong>de</strong> un mes la sobrevivi<strong>en</strong>cia,capacidad <strong>de</strong> <strong>en</strong>raizami<strong>en</strong>to, número <strong>de</strong> hojas y la ganancia <strong>en</strong> materia fresca. Para <strong>de</strong>terminarla cantidad <strong>de</strong> biomasa seca, se tomó una muestra aleatoria <strong>de</strong> cinco plántulas (sólo unamuestra reducida para permitir la evaluación <strong>de</strong> la aclimatación d<strong>el</strong> material vegetal restante).Luego <strong>de</strong> esta evaluación las ban<strong>de</strong>jas fueron trasladadas a inverna<strong>de</strong>ro, don<strong>de</strong>permanecieron durante 6 y 11 semanas, <strong>de</strong>p<strong>en</strong>di<strong>en</strong>do <strong>de</strong> la especie. Al finalizar esta etapa serealizó una segunda evaluación.Luego las plantas fueron colocadas <strong>en</strong> bot<strong>el</strong>las plásticas, con sustrato compuesto <strong>de</strong> dospartes <strong>de</strong> su<strong>el</strong>o y una parte <strong>de</strong> ar<strong>en</strong>a. Al cabo <strong>de</strong> 7 semanas <strong>de</strong> transcurrida esta etapa serealizó la última evaluación.Se comparó lo sucedido <strong>en</strong> ambos grupos <strong>de</strong> estudio (prov<strong>en</strong>i<strong>en</strong>tes <strong>de</strong> medio líquido y sólido)mediante una prueba <strong>de</strong> t-Stud<strong>en</strong>t. En aqu<strong>el</strong>los parámetros <strong>en</strong> don<strong>de</strong> los datos se distribuyeronnormalm<strong>en</strong>te y las varianzas <strong>de</strong> los dos grupos eran homogéneas. En caso contrario se utilizóla prueba <strong>de</strong> Mann-Whitney.Los datos individuales <strong>de</strong> las plantas fueron utilizados para estudiar la r<strong>el</strong>ación <strong>en</strong>tre <strong>el</strong> pesoalcanzado por la planta <strong>en</strong> función d<strong>el</strong> peso inicial d<strong>el</strong> bulbillo al mom<strong>en</strong>to d<strong>el</strong> transplante exInforme Técnico y <strong>de</strong> Gestión Final 10
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Adicionalm<strong>en</strong>te se obtuvieron ecuaciones estimadas d<strong>el</strong> peso final alcanzado <strong>en</strong>función d<strong>el</strong> peso inicial <strong>en</strong> ambos grupos, a<strong>de</strong>más <strong>de</strong> comparar la posibilidad <strong>de</strong> ajustar unmod<strong>el</strong>o <strong>de</strong> predicción <strong>de</strong> aum<strong>en</strong>to <strong>de</strong> peso <strong>en</strong>tre los tratami<strong>en</strong>tos para verificar que tanpre<strong>de</strong>cible es <strong>el</strong> crecimi<strong>en</strong>to <strong>de</strong> los bulbillos prov<strong>en</strong>i<strong>en</strong>tes <strong>de</strong> medios sólidos y líquidos.Figura 1. Aclimatación <strong>en</strong> cámara <strong>de</strong> crecimi<strong>en</strong>to y transfer<strong>en</strong>cia <strong>de</strong> plántulas a macetas<strong>de</strong> 1,5 L <strong>de</strong> capacidad.4.1.1.6. Seguimi<strong>en</strong>to a largo plazo <strong>de</strong> material originado <strong>de</strong>s<strong>de</strong> cultivo in vitro.Las plántulas que se han mant<strong>en</strong>ido <strong>en</strong> <strong>el</strong> inverna<strong>de</strong>ro d<strong>el</strong> Laboratorio <strong>de</strong> Cultivo <strong>de</strong> TejidosVegetales, se han evaluado <strong>en</strong> cuanto a su crecimi<strong>en</strong>to, aum<strong>en</strong>to <strong>de</strong> peso, calibre y floración através d<strong>el</strong> tiempo durante <strong>el</strong> transcurso d<strong>el</strong> proyecto.Debido a que las plantas han ido aum<strong>en</strong>tando <strong>en</strong> tamaño ha sido necesario trasladar losmicrobulbillos originados <strong>de</strong> la propagación in vitro <strong>de</strong>s<strong>de</strong> tubetes, a cont<strong>en</strong>edores con mayorcapacidad <strong>en</strong> profundidad (bot<strong>el</strong>las <strong>de</strong> 1,5 L), realizándose mediciones <strong>de</strong> su crecimi<strong>en</strong>to apartir <strong>de</strong> marzo d<strong>el</strong> 2006. En marzo d<strong>el</strong> 2007 se realizaron registros <strong>de</strong> floración y <strong>en</strong> abril d<strong>el</strong>2007, se <strong>de</strong>scalzaron las plantas evaluadas la temporada anterior para realizar mediciones <strong>de</strong>crecimi<strong>en</strong>to vegetativo, midi<strong>en</strong>do <strong>el</strong> diámetro y largo d<strong>el</strong> bulbo, peso total <strong>de</strong> la planta, número<strong>de</strong> hojas y raíces.Utilizando una forma <strong>de</strong> cultivo que simule las condiciones naturales <strong>en</strong> cuanto a la profundidadd<strong>el</strong> sustrato, se cultivaron los bulbos <strong>en</strong> tubos <strong>de</strong> 50 cm <strong>de</strong> profundidad con su<strong>el</strong>o ar<strong>en</strong>oso.Finalm<strong>en</strong>te, se realizó una división <strong>de</strong> la población <strong>de</strong> las plantas <strong>de</strong> R. montana <strong>en</strong> rangos,según <strong>el</strong> peso d<strong>el</strong> bulbillo, registrándose <strong>el</strong> porc<strong>en</strong>taje <strong>de</strong> floración <strong>de</strong> las plantas <strong>en</strong> cadarango. El manejo <strong>de</strong> estas plantas ha sido <strong>el</strong> sigui<strong>en</strong>te: riego: ad libitum, manual; fertilización <strong>en</strong>riego quinc<strong>en</strong>al con fertilizantes solubles (nitrato <strong>de</strong> potasio y fosfato monoamónico 1g/L).4.1.1.7. Aclimatación y crecimi<strong>en</strong>to ex vitro d<strong>el</strong> g<strong>en</strong>otipo <strong>de</strong> Rhodophiala spl<strong>en</strong>d<strong>en</strong>s Nº363.El g<strong>en</strong>otipo con mejor coefici<strong>en</strong>te <strong>de</strong> multiplicación in vitro fue <strong>el</strong> Nº 363 <strong>de</strong> R. spl<strong>en</strong>d<strong>en</strong>s, (conuna tasa <strong>de</strong> multiplicación <strong>de</strong> 4), <strong>el</strong> cual fue evaluado durante <strong>el</strong> periodo <strong>de</strong> aclimatación <strong>en</strong>condiciones <strong>de</strong> inverna<strong>de</strong>ro. Para <strong>el</strong>lo microbulbillos cultivados in vitro <strong>en</strong> medio líquido conbase <strong>de</strong> algodón, sin raíces y brotes fueron medidos <strong>en</strong> cuanto a su peso y calibre al mom<strong>en</strong>tod<strong>el</strong> trasplante. Los microbulbillos se plantaron <strong>en</strong> ban<strong>de</strong>jas con sustrato turba:ar<strong>en</strong>a y fueronmant<strong>en</strong>idos durante un mes <strong>en</strong> inverna<strong>de</strong>ro con una temperatura promedio <strong>de</strong> 22ºC.Informe Técnico y <strong>de</strong> Gestión Final 11
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Al mom<strong>en</strong>to <strong>de</strong> la floración, estadoque <strong>en</strong> <strong>el</strong> transcurso d<strong>el</strong> proyecto fue alcanzado solo por una planta <strong>en</strong> la cual se midió <strong>el</strong> largo<strong>de</strong> los tépalos y <strong>el</strong> tamaño d<strong>el</strong> pol<strong>en</strong>. Ambas variables fueron comparadas con mediciones <strong>de</strong>plantas diploi<strong>de</strong>s que se <strong>en</strong>contraban <strong>en</strong> floración <strong>en</strong> ese mom<strong>en</strong>to. Las mediciones <strong>de</strong> tamaño<strong>de</strong> pol<strong>en</strong> se realizaron extray<strong>en</strong>do granos <strong>de</strong> pol<strong>en</strong> fresco <strong>de</strong> flores abiertas, los cuales fueronmontados <strong>en</strong> portaobjeto y fotografiados <strong>en</strong> microscopio Carl Zeiss Axiolab, con aum<strong>en</strong>to 400X.El tamaño d<strong>el</strong> grano <strong>de</strong> pol<strong>en</strong> fue <strong>de</strong>terminado a través d<strong>el</strong> análisis <strong>de</strong> las fotografías con <strong>el</strong>software Image J, utilizando la fotografía <strong>de</strong> una reglilla micrométrica como refer<strong>en</strong>cia d<strong>el</strong>ectura. Se midió largo, ancho y perímetro d<strong>el</strong> grano <strong>de</strong> pol<strong>en</strong>.4.2 Descripción <strong>de</strong> la metodología utilizada <strong>en</strong> estudios citológicos y molecularesSe trabajo con 6 especies chil<strong>en</strong>as <strong>de</strong> Rhodophiala. Estas especies fueron colectadas <strong>de</strong>s<strong>de</strong> suambi<strong>en</strong>te natural por Patricio Peñaillillo (Universidad <strong>de</strong> Talca), si<strong>en</strong>do un ejemplar <strong>de</strong> cadaespecie registrado <strong>en</strong> <strong>el</strong> herbario <strong>de</strong> la Universidad <strong>de</strong> Talca. R. montana (Phil.) Traub fuecolectada <strong>en</strong> Laguna d<strong>el</strong> Maule, VII región cordillera, R. spl<strong>en</strong>d<strong>en</strong>s (R<strong>en</strong>gifo) Traub <strong>en</strong> VilchesAlto VII región cordillera, R. bagnoldii (Herb.) Traub <strong>en</strong> Huasco, III región costa, R. ananuca(Phil.) Traub <strong>en</strong> Aguada <strong>de</strong> Tongoy, III región costa, R. rhodolirion (Baker) Traub <strong>en</strong> LosQueñes, VII región Cordillera, R. phyc<strong>el</strong>loi<strong>de</strong>s (Herb.) Hunz <strong>en</strong> Huasco, III región costa.Para las especies m<strong>en</strong>cionadas <strong>de</strong> Rhodophiala, a excepción <strong>de</strong> R. phyc<strong>el</strong>loi<strong>de</strong>s, se realizaronpreparaciones citológicas <strong>de</strong>s<strong>de</strong> puntas <strong>de</strong> raíz según protocolo planteado por Grant et al.,(1984) y adaptado por Muñoz et al (2006) a Rhodophiala.Se tomaron 5 células por especie, <strong>de</strong>s<strong>de</strong> 2 a 4 plantas, para cada célula se contabilizó <strong>el</strong> nºcromosómico somático y cada cromosoma <strong>de</strong> estas células se midió <strong>el</strong> largo <strong>de</strong> brazo largo(BL) y largo <strong>de</strong> brazo corto (BC). Los cromosomas se agruparon <strong>en</strong> pares <strong>de</strong> acuerdo asimilitud morfológica y se ord<strong>en</strong>aron <strong>de</strong> mayor a m<strong>en</strong>or tamaño. Con estas mediciones secalculó <strong>el</strong> largo total d<strong>el</strong> complem<strong>en</strong>to, haploi<strong>de</strong>, <strong>el</strong> índice c<strong>en</strong>tromérico: BL/BC, fórmulacariotípica básica (Levan et al., 1964) y <strong>el</strong> índice <strong>de</strong> asimetría cariotípica (A) según la fórmulapropuesta por Romero Zarco (1986): A = 1 - [ S 1 n (brazo corto/ brazo largo/n)Para las especies m<strong>en</strong>cionadas, se realizó la amplificación d<strong>el</strong> fragm<strong>en</strong>to correspondi<strong>en</strong>te a laregión ITS1/5.8S/ITS2 <strong>en</strong> tres plantas por especie a través d<strong>el</strong> sigui<strong>en</strong>te protocolo:La extracción <strong>de</strong> ADN se realizó a partir <strong>de</strong> 0.1 g <strong>de</strong> hojas jóv<strong>en</strong>es que fueron maceradas <strong>en</strong>500 L Buffer <strong>de</strong> extracción CTAB 2% (Tris 100 mM pH 8, EDTA 20 mM, NaCl 1,4 M, CTAB2%) y 2 L <strong>de</strong> Mercaptoetanol, incubándose por 30 minutos a 60°C; luego se adicionó 500 L<strong>de</strong> Cloroformo:f<strong>en</strong>ol:alcohol isoamílico (25:24:1) seguido <strong>de</strong> c<strong>en</strong>trifugado (5 min a 10.000 rpm).Luego <strong>de</strong> la adición <strong>de</strong> 200 L <strong>de</strong> isopropanol frío (-18°C) al sobr<strong>en</strong>adante se c<strong>en</strong>trifugónuevam<strong>en</strong>te (10 min a 11.000 rpm) lavándose <strong>el</strong> p<strong>el</strong>let con etanol frío 70% y resusp<strong>en</strong>diéndose<strong>en</strong> ddH 2 O.La región ITS fue amplificada utilizando los cebadores ITS1-Plant –F, 5-CGCGAGAAGTCCACTG-3’ e ITS C26A-R 5’GTTTCTTTTCCTCCGCT-3’ (Varghese et al.,2003). La reacción PCR para la amplificación se llevó a cabo <strong>en</strong> un volum<strong>en</strong> total <strong>de</strong> 50 L,consist<strong>en</strong>te <strong>de</strong> 35.2 L <strong>de</strong> ddH 2 O, 5 ddH 2 O <strong>de</strong> 10X Taq polymerase Buffer (Ferm<strong>en</strong>tas), 1.25L <strong>de</strong> dNTPs (2 mM), 3 L <strong>de</strong> MgCl 2 (25 Mm), 1 L <strong>de</strong> cada cebador (10 pmol/L), 0.8 L <strong>de</strong>Informe Técnico y <strong>de</strong> Gestión Final 12
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Los productos fueron visualizadosmediante <strong>el</strong>ectroforesis <strong>en</strong> g<strong>el</strong>es <strong>de</strong> agarosa 1,5% mediante tinción con bromuro <strong>de</strong> etidio.Los productos amplificados fueron secu<strong>en</strong>ciados por un servidor externo, Macrog<strong>en</strong> Inc.,Corea. Las secu<strong>en</strong>cias fueron alineadas y analizadas utilizando <strong>el</strong> programa ClustalW,http://www.ebi.ac.uk/clustalw., con <strong>el</strong> cual se realizó la construcción <strong>de</strong> un filogramacomparando las secu<strong>en</strong>cias obt<strong>en</strong>idas con algunas reportadas por Meerow et al. (2000).Principales problemas metodológicos <strong>en</strong>fr<strong>en</strong>tadosEn los experim<strong>en</strong>tos <strong>de</strong> cultivo <strong>de</strong> tejidos <strong>el</strong> mayor problema consistió <strong>en</strong> la baja capacidad <strong>de</strong>reg<strong>en</strong>eración <strong>de</strong> las especies, la l<strong>en</strong>titud <strong>de</strong> la respuesta <strong>de</strong> brotación y la susceptibilidad <strong>de</strong> losexplantes a pres<strong>en</strong>tar problemas típicos d<strong>el</strong> cultivo in vitro como <strong>el</strong> par<strong>de</strong>ami<strong>en</strong>to. En medioslíquidos se apreciaron fuertes problemas r<strong>el</strong>acionados con la hiperhidratación (vitrificación), locual incidió fuertem<strong>en</strong>te <strong>en</strong> la mortalidad <strong>de</strong> las plantas y <strong>en</strong> la escasa sobreviv<strong>en</strong>cia <strong>de</strong>g<strong>en</strong>otipos poliploi<strong>de</strong>s. También hizo poco efici<strong>en</strong>te la inducción <strong>de</strong> poliploidía y no permitióproducir numerosos clones <strong>de</strong> los individuos s<strong>el</strong>eccionados.En los experim<strong>en</strong>tos r<strong>el</strong>acionados con los estudios moleculares, los problemas consistieron <strong>en</strong>la amplificación <strong>de</strong> productos inespecíficos por parte <strong>de</strong> los partidores inicialm<strong>en</strong>te utilizados.Otro problema importante consistió <strong>en</strong> los escasos sitios polimórficos <strong>en</strong>contrados <strong>en</strong> lassecu<strong>en</strong>cias ITS <strong>de</strong> las especies, a excepción <strong>de</strong> R. rhodolirion. Esto no hizo posible laid<strong>en</strong>tificación <strong>de</strong> híbridos ínter específicos pero sí posibilitó la confirmación, a niv<strong>el</strong> molecularque R. rhodolirion es una especie distante d<strong>el</strong> resto <strong>de</strong> las especies d<strong>el</strong> género yprobablem<strong>en</strong>te correspon<strong>de</strong> a otro género.Adaptaciones o modificaciones introducidas durante la ejecución d<strong>el</strong> proyecto, yrazones que explican las discrepancias con la metodología originalm<strong>en</strong>te propuestaLa efici<strong>en</strong>cia <strong>de</strong> los protocolos <strong>de</strong> cultivo in vitro hasta ahora <strong>de</strong>sarrollados (incluy<strong>en</strong>do <strong>el</strong> sistema<strong>de</strong> inmersión temporal), no permitió g<strong>en</strong>erar la cantidad <strong>de</strong> material vegetal que se esperabaobt<strong>en</strong>er producto <strong>de</strong> micropropagación. Este serviría para realizar nuevos <strong>en</strong>sayos, y, dado qu<strong>en</strong>o se contó con la cantidad <strong>de</strong> tejido u órganos para ejecutar estos <strong>en</strong>sayos, se modificaron lasactivida<strong>de</strong>s. Se <strong>de</strong>terminó la efici<strong>en</strong>cia <strong>de</strong> protocolos <strong>de</strong> cultivo <strong>de</strong> tejidos <strong>en</strong> inmersión temporal,agitación y estacionarios <strong>en</strong> algunas especies <strong>de</strong> Rhodophiala, <strong>de</strong>p<strong>en</strong>di<strong>en</strong>do <strong>de</strong> la disponibilidad<strong>de</strong> plántulas o microbulbillos que existía <strong>de</strong> cada especie.La preparación y tramitación <strong>de</strong> solicitud <strong>de</strong> pat<strong>en</strong>te no se realizó <strong>de</strong>bido a que los resultadosobt<strong>en</strong>idos <strong>en</strong> cultivo in vitro sólo son aplicables a g<strong>en</strong>otipos específicos. Pocos g<strong>en</strong>otiposalcanzaron la floración por lo que no fueron evaluados con respecto a sus característicasflorales, por <strong>el</strong> largo tiempo que transcurrió <strong>de</strong>s<strong>de</strong> la aclimatación hasta la floración, a<strong>de</strong>más d<strong>el</strong><strong>de</strong>sconocimi<strong>en</strong>to que existe acerca <strong>de</strong> las condiciones ambi<strong>en</strong>tales que induc<strong>en</strong> la floración <strong>en</strong>estas especies. Tampoco se podía asegurar que habría un interés comercial por dichosg<strong>en</strong>otipos como pot<strong>en</strong>ciales varieda<strong>de</strong>s ornam<strong>en</strong>tales. Por <strong>el</strong>lo, <strong>el</strong> pat<strong>en</strong>tami<strong>en</strong>to <strong>de</strong> un protocoloespecífico <strong>de</strong> propagación sería apresurado y arriesgado al no po<strong>de</strong>r extrapolarse a un sistemaInforme Técnico y <strong>de</strong> Gestión Final 13
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Proyecto BID-PI-C-2001-1-A-071“<strong>Aplicaciones</strong> biotecnológicas <strong>en</strong> <strong>el</strong> mejorami<strong>en</strong>to g<strong>en</strong>ético <strong>de</strong> especies <strong>de</strong> Rhodophialachil<strong>en</strong>asCuadro 3. Resultado <strong>en</strong> peso <strong>de</strong> planta, peso <strong>de</strong> bulbo y número <strong>de</strong> brotes portratami<strong>en</strong>to y promedio d<strong>el</strong> <strong>en</strong>sayo, separado según parámetro estudiado, <strong>en</strong>microbulbillos <strong>de</strong> R. spl<strong>en</strong>d<strong>en</strong>sTratami<strong>en</strong>to Peso <strong>de</strong> planta Peso <strong>de</strong> bulbo N° brotes0 – 0 2.88 +/- 1.84 1.48 +/- 0.56 2.50 +/- 3.672.2 M MTP – 0 1.93 +/- 1.05 0.73 +/- 0.31 2.00 +/- 2.454.4 M MTP - 0 1.87 +/- 1.19 0.60 +/- 0.19 1.00 +/- 0.0011.1 M MTP – 0 2.38 +/- 1.58 0.83 +/- 0.55 1.00 +- 0.0022.2 M MTP – 0 1.82 +/- 0.59 0.97 +/- 0.77 1.00 +/- 0.001.7 M PBZ – 0 3.02 +/- 1.06 0.82 +/- 0.41 1.00 +/- 0.003.4 M PBZ – 0 2.62 +/- 1.90 1.22 +/- 0.72 1.33 +/- 0.828.5 M PBZ – 0 2.60 +/- 1.40 1.37 +/- 0.60 1.33 +/- 0.5217 M PBZ – 0 3.20 +/-1.70 1.05 +/- 0.53 1.00 +/- 0.002.2 M MTP-1.7 M 2.02 +/- 1.45 1.13 +/- 1.28 1.67 +/- 1.21PBZ4.4 M MTP-3.4 M 2.05 +/- 1.39 0.90 +/- 0.37 1.17 +/- 0.41PBZ22.2 M MTP-17 1.57 +/- 0.92 1.08 +/- 0.51 1.00 +/- 0.00M PBZPromedio g<strong>en</strong>eral 2.33 +/- 1.38 1.02 +/- 0.63 1.33 +/- 1.33Bonferroni 5% N.S. N.S. N.S.Datos se refier<strong>en</strong> a promedio +/- <strong>de</strong>sviación estándarInforme Técnico y <strong>de</strong> Gestión Final 16
Proyecto BID-PI-C-2001-1-A-071“<strong>Aplicaciones</strong> biotecnológicas <strong>en</strong> <strong>el</strong> mejorami<strong>en</strong>to g<strong>en</strong>ético <strong>de</strong> especies <strong>de</strong> Rhodophialachil<strong>en</strong>asCuadro 4. Resultado <strong>en</strong> largo <strong>de</strong> brotes, diámetro <strong>de</strong> bulbo, hiperhidricidad ycontaminación por tratami<strong>en</strong>to y promedio d<strong>el</strong> <strong>en</strong>sayo, separado segúnparámetro estudiado, <strong>en</strong> microbulbillos <strong>de</strong> R. spl<strong>en</strong>d<strong>en</strong>sTratami<strong>en</strong>to Largo <strong>de</strong> brotes Diámetro <strong>de</strong> bulbo Hiperhidricidad Contaminación0 – 0 5.67 +/- 5.82 0.90 +/- 0.62 33.33% 33.33%2.2 M MTP – 0 9.50 +/- 6.44 0.55 +/- 0.23 16.67% 0.00%4.4 M MTP - 0 10.00 +/- 7.46 0.50 +/- 0.14 16.67% 33.33%11.1 M MTP – 0 13.83 +/- 7.88 0.57 +/- 0.16 16.67% 66.67%22.2 M MTP – 0 12.50 +/- 6.89 3.42 +/- 7.14 16.67% 0.00%1.7 M PBZ – 0 11.25 +/- 9.05 0.83 +/- 0.39 33.33% 0.00%3.4 M PBZ – 0 5.33 +/- 7.53 0.57 +/- 0.32 50.00% 33.33%8.5 M PBZ – 0 2.33 +/- 2.07 0.88 +/- 0.32 33.33% 0.00%17 M PBZ – 0 4.08 +/- 3.69 1.15 +/- 0.78 0.00% 50.00%2.2 M MTP-1.7 M 6.83 +/- 8.52 0.50 +/- 0.22 50.00% 100.00%PBZ4.4 M MTP-3.4 M 5.17 +/- 6.34 0.57 +/- 0.46 0.00% 66.67%PBZ22.2 M MTP-17 M 3.50 +/- 4.81 0.52 +/- 0.19 83.33% 66.67%PBZPromedio g<strong>en</strong>eral 7.50 +/- 7.13 0.91 +/- 2.08 29.17% 37.50%Bonferroni 5% N.S. N.S.Datos se refier<strong>en</strong> a promedio +/- <strong>de</strong>sviación estándarInforme Técnico y <strong>de</strong> Gestión Final 17
Proyecto BID-PI-C-2001-1-A-071“<strong>Aplicaciones</strong> biotecnológicas <strong>en</strong> <strong>el</strong> mejorami<strong>en</strong>to g<strong>en</strong>ético <strong>de</strong> especies <strong>de</strong> Rhodophialachil<strong>en</strong>asCuadro 5. Resultado <strong>en</strong> índice <strong>de</strong> crecimi<strong>en</strong>to, difer<strong>en</strong>cia <strong>de</strong> peso e índice <strong>de</strong>multiplicación por tratami<strong>en</strong>to y promedio d<strong>el</strong> <strong>en</strong>sayo, separado segúnparámetro estudiado, <strong>en</strong> microbulbillos <strong>de</strong> R. spl<strong>en</strong>d<strong>en</strong>sTratami<strong>en</strong>to Índice <strong>de</strong> crecimi<strong>en</strong>to Difer<strong>en</strong>cia <strong>de</strong> peso Índice <strong>de</strong>multiplicación0 – 0 11.50 +/- 15.77 2.55 +/- 1.90 0.67 +/- 1.632.2 M MTP – 0 2.34 +/- 1.10 1.27 +/- 0.65 1.00 +/- 2.454.4 M MTP - 0 2.92 +/- 3.52 1.18 +/- 1.30 0.00 +/- 0.0011.1 M MTP – 0 3.22 +/- 2.21 1.77 +/- 1.29 0.00 +/- 0.0022.2 M MTP – 0 3.96 +/- 2.75 1.25 +/- 0.68 -0.08 +/- 0.201.7 M PBZ – 0 8.90 +/- 10.48 2.37 +/- 1.20 0.00 +/- 0.003.4 M PBZ – 0 6.00 +/- 7.84 2.04 +/- 2.08 0.33 +/- 0.828.5 M PBZ – 0 6.31 +/- 5.46 2.14 +/- 1.29 0.00 +/- 0.0017 M PBZ – 0 3.05 +/- 1.64 2.35 +/- 1.26 0.00 +/- 0.002.2 M MTP- 1.7 1.48 +/- 1.58 1.10 +/- 0.93 0.67 +/- 1.21M PBZ4.4 M MTP-3.4 M 4.48 +/- 6.92 1.50 +/- 1.32 0.17 +/- 0.41PBZ22.2 M MTP-17 3.60 +/- 2.64 1.22 +/- 0.91 0.00 +/- 0.00M PBZPromedio g<strong>en</strong>eral 4.81 +/- 6.76 1.73 +/- 1.30 0.23 +/- 0.95Bonferroni 5% N.S. N.S. N.S.Datos se refier<strong>en</strong> a promedio +/- <strong>de</strong>sviación estándarPara los parámetros: Índice <strong>de</strong> multiplicación, índice <strong>de</strong> crecimi<strong>en</strong>to, peso <strong>de</strong> bulbo y largo <strong>de</strong>brotes no se <strong>de</strong>tectaron difer<strong>en</strong>cias significativas <strong>en</strong>tre los tratami<strong>en</strong>tos aplicados a 72 clonesd<strong>el</strong> g<strong>en</strong>otipo 363. Se pres<strong>en</strong>tan los resultados promedio <strong>de</strong> todas las unida<strong>de</strong>s d<strong>el</strong> <strong>en</strong>sayo, paraestos parámetros. La unidad experim<strong>en</strong>tal estuvo constituida por 1 g <strong>de</strong> inóculo <strong>de</strong> bulbillos <strong>de</strong>R. spl<strong>en</strong>d<strong>en</strong>sInforme Técnico y <strong>de</strong> Gestión Final 18
Proyecto BID-PI-C-2001-1-A-071“<strong>Aplicaciones</strong> biotecnológicas <strong>en</strong> <strong>el</strong> mejorami<strong>en</strong>to g<strong>en</strong>ético <strong>de</strong> especies <strong>de</strong> Rhodophialachil<strong>en</strong>asCuadro 6. Resultado <strong>en</strong> peso <strong>de</strong> planta, peso <strong>de</strong> bulbo y número <strong>de</strong> brotes portratami<strong>en</strong>to y promedio d<strong>el</strong> <strong>en</strong>sayo, separado según parámetro estudiado, <strong>en</strong>microbulbillos <strong>de</strong> R. spl<strong>en</strong>d<strong>en</strong>s g<strong>en</strong>otipo 363Tratami<strong>en</strong>to Peso <strong>de</strong> planta Peso <strong>de</strong> bulbo N° <strong>de</strong> brotes0 – 0 3.71 +/- 1.37 2.78 +/- 1.49 1.67 +/- 0.82 b2.2 M MTP – 0 4.75 +/- 2.28 1.73 +/- 0.88 9.17 +/- 4.07 a4.4 M MTP - 0 3.35 +/- 1.31 1.62 +/- 0.94 2.67 +/- 1.86 b11.1 M MTP – 0 4.08 +/- 1.37 1.57 +/- 0.54 5.50 +/- 4.93 ab22.2 M MTP – 0 3.42 +/- 0.81 1.62 +/- 1.35 3.50 +/- 2.07 b1.7 M PBZ – 0 3.67 +/- 1.33 1.03 +/- 0.55 3.50 +/- 1.76 b3.4 M PBZ – 0 3.40 +/- 1.20 2.07 +/- 1.14 2.50 +/- 3.21 b8.5 M PBZ – 0 2.11 +/- 1.02 1.58 +/- 0.44 2.17 +/- 1.60 b17 M PBZ – 0 2.48 +/- 0.77 1.03 +/- 0.63 3.17 +/- 2.64 b2.2 M MTP + M 2.60 +/- 1.11 0.96 +/- 0.93 3.00 +/- 1.79 b1.7 PBZ4.4 M MTP + 3.4 4.30 +/- 0.95 2.22 +/- 1.60 2.50 +/- 1.87 bM PBZ22.2 M MTP + 17 3.42 +/- 1.30 0.97 +/- 0.87 3.67 +/- 3.08 bM PBZPromedio g<strong>en</strong>eral 3.44 +/- 1.40 1.60 +/- 1.08 3.58 +/- 3.16 bBonferroni 5% N.S. N.S. *Datos se refier<strong>en</strong> a promedio +/- <strong>de</strong>sviación estándarSe <strong>de</strong>tectaron difer<strong>en</strong>cias significativas <strong>en</strong> cuanto al N° <strong>de</strong> brotes obt<strong>en</strong>idos <strong>de</strong>s<strong>de</strong> 1g <strong>de</strong>microbulbillos <strong>de</strong> inóculoInforme Técnico y <strong>de</strong> Gestión Final 19
Proyecto BID-PI-C-2001-1-A-071“<strong>Aplicaciones</strong> biotecnológicas <strong>en</strong> <strong>el</strong> mejorami<strong>en</strong>to g<strong>en</strong>ético <strong>de</strong> especies <strong>de</strong> Rhodophialachil<strong>en</strong>asCuadro 7. Resultado <strong>en</strong> largo <strong>de</strong> brotes, diámetro <strong>de</strong> bulbo, hiperhidricidad ycontaminación por tratami<strong>en</strong>to y promedio d<strong>el</strong> <strong>en</strong>sayo, separado segúnparámetro estudiado, <strong>en</strong> microbulbillos <strong>de</strong> R. spl<strong>en</strong>d<strong>en</strong>s g<strong>en</strong>otipo 363.Tratami<strong>en</strong>to Largo <strong>de</strong> brotes Diámetro <strong>de</strong> bulbo Hiperhidricidad Contaminación0 – 0 2.33 +/- 2.73 0.45 +/- 0.37 33.33% 16.67%2.2 M MTP – 0 10.67 +/- 1.63 0.28 +/- 0.10 0.00% 0.00%4.4 M MTP - 0 8.33 +/- 8.02 0.80 +/- 0.47 16.67% 50.00%11.1 M MTP – 0 10.00 +/- 7.46 0.47 +/- 0.24 16.67% 16.67%22.2 M MTP – 0 7.67 +/- 8.04 0.57 +/- 0.71 33.33% 33.33%1.7 M PBZ – 0 4.17 +/- 5.46 0.42 +/- 0.31 66.67% 66.67%3.4 M PBZ – 0 1.50 +/- 3.21 0.87 +/- 0.61 83.33% 50.00%8.5 M PBZ – 0 0.83 +/- 2.04 0.47 +/- 0.27 100.00% 83.33%17 M PBZ – 0 2.83 +/- 2.40 0.43 +/- 0.38 16.67% 83.33%2.2 M MTP + M 4.50 +/- 3.89 0.43 +/- 0.23 66.67% 83.33%1.7 PBZ4.4 M MTP + 3.4 3.67 +/- 4.32 0.53 +/- 0.28 50.00% 100.00%M PBZ22.2 M MTP + 17 3.50 +/- 1.97 0.22 +/- 0.10 83.33% 50.00%M PBZPromedio g<strong>en</strong>eral 5.00 +/- 5.49 0.49 +/- 0.39 47.22% 52.78%Bonferroni 5% N.S. N.S.Datos se refier<strong>en</strong> a promedio +/- <strong>de</strong>sviación estándarInforme Técnico y <strong>de</strong> Gestión Final 20
Proyecto BID-PI-C-2001-1-A-071“<strong>Aplicaciones</strong> biotecnológicas <strong>en</strong> <strong>el</strong> mejorami<strong>en</strong>to g<strong>en</strong>ético <strong>de</strong> especies <strong>de</strong> Rhodophialachil<strong>en</strong>asCuadro 8. Resultado <strong>en</strong> índice <strong>de</strong> crecimi<strong>en</strong>to, difer<strong>en</strong>cia <strong>de</strong> peso e índice <strong>de</strong>multiplicación por tratami<strong>en</strong>to y promedio d<strong>el</strong> <strong>en</strong>sayo, separado segúnparámetro estudiado, <strong>en</strong> microbulbillos <strong>de</strong> R. spl<strong>en</strong>d<strong>en</strong>s g<strong>en</strong>otipo 363.Tratami<strong>en</strong>toIndice <strong>de</strong>crecimi<strong>en</strong>toDifer<strong>en</strong>cia <strong>de</strong> peso Indice <strong>de</strong>multiplicación0 – 0 2.33 +/- 1.47 2.57 +/-1.44 0.17 +/- 0.522.2 M MTP – 0 3.56 +/- 2.26 3.70 +/-2.29 3.83 +/- 3.494.4 M MTP - 0 1.96 +/- 1.39 2.17 +/-1.40 0.94 +/- 1.5611.1 M MTP – 0 2.62 +/- 1.11 2.95 +/-1.28 2.25 +/- 2.3222.2 M MTP – 0 1.82 +/- 0.89 2.14 +/-0.84 1.67 +/- 2.251.7 M PBZ – 0 2.35 +/- 1.50 2.51 +/-1.51 1.50 +/- 1.483.4 M PBZ – 0 1.99 +/- 1.30 2.21 +/-1.32 0.75 +/- 1.418.5 M PBZ – 0 0.83 +/- 0.96 0.94 +/-1.05 -0.13 +/- 0.3217 M PBZ – 0 1.01 +/- 0.65 1.22 +/-0.71 1.67 +/- 2.252.2 M MTP + M 1.7 1.15 +/- 0.85 1.37 +/-1.08 1.58 +/- 2.01PBZ4.4 M MTP + 3.4 M 2.59 +/- 1.18 3.04 +/-1.13 0.67 +/- 1.03PBZ22.2 M MTP + 17 M 1.69 +/- 0.87 2.16 +/-1.21 1.03 +/- 1.78PBZPromedio g<strong>en</strong>eral 1.99 +/- 1.39 2.25 +/-1.44 1.33 +/- 2.01Bonferroni 5% N.S. N.S. N.S.Datos se refier<strong>en</strong> a promedio +/- <strong>de</strong>sviación estándarEl tratami<strong>en</strong>to que consistió <strong>en</strong> agregar 2.2 M <strong>de</strong> Metatopolina produjo la mayor cantidad <strong>de</strong>brotes <strong>de</strong>s<strong>de</strong> 1g <strong>de</strong> inóculo <strong>de</strong> microbulbillos. Llama la at<strong>en</strong>ción la alta hiperhidricidadproducida por los tratami<strong>en</strong>tos <strong>en</strong> don<strong>de</strong> se agregó Paclobutrazol.Comparando lo sucedido <strong>en</strong>tre la muestra estudiada <strong>en</strong> <strong>el</strong> <strong>en</strong>sayo 1 (mezcla <strong>de</strong> diversosg<strong>en</strong>otipos) y <strong>el</strong> g<strong>en</strong>otipo 363 d<strong>el</strong> segundo <strong>en</strong>sayo, se constató que exist<strong>en</strong> difer<strong>en</strong>ciassignificativas <strong>en</strong>tre ambos grupos, <strong>en</strong> cuanto a su capacidad <strong>de</strong> multiplicación.Informe Técnico y <strong>de</strong> Gestión Final 21
Proyecto BID-PI-C-2001-1-A-071“<strong>Aplicaciones</strong> biotecnológicas <strong>en</strong> <strong>el</strong> mejorami<strong>en</strong>to g<strong>en</strong>ético <strong>de</strong> especies <strong>de</strong> Rhodophialachil<strong>en</strong>asCuadro 9. Resum<strong>en</strong> comparativo <strong>en</strong>tre la mezcla <strong>de</strong> g<strong>en</strong>otipos y <strong>el</strong> g<strong>en</strong>otipo 363.G<strong>en</strong>otiposIndice <strong>de</strong> Indice <strong>de</strong> crecimi<strong>en</strong>to Hiperhidricidad (%)multiplicaciónS 363 1.32 +/- 2.00 a 1.99 +/- 1.38 b 47.22Mezcla diversa 0.22 +/- 0.94 b 4.81 +/- 6.75 a 29.17Letras distintas indican difer<strong>en</strong>cias significativas (Mann-Whitney, 5%).Este resultado correspon<strong>de</strong> a uno <strong>de</strong> los más significativos d<strong>el</strong> proyecto, <strong>en</strong>contrándose ung<strong>en</strong>otipo <strong>de</strong> mayor capacidad <strong>de</strong> multiplicación que la población promedio, lo que constituyemejorami<strong>en</strong>to. Como se verá <strong>en</strong> resultados <strong>de</strong> experim<strong>en</strong>tos pres<strong>en</strong>tados más ad<strong>el</strong>ante, esteg<strong>en</strong>otipo posee una bu<strong>en</strong>a capacidad <strong>de</strong> sobreviv<strong>en</strong>cia a condiciones ex vitro.Figura 2. G<strong>en</strong>otipo 363, medio<strong>de</strong> cultivo con 2.2 µM MTPFigura 3. Mezcla <strong>de</strong> g<strong>en</strong>otipos, medio <strong>de</strong>cultivo sin reguladores <strong>de</strong> crecimi<strong>en</strong>toPor otra parte, <strong>el</strong> g<strong>en</strong>otipo 363 posee un índice <strong>de</strong> crecimi<strong>en</strong>to inferior al grupo constituido porg<strong>en</strong>otipos difer<strong>en</strong>tes.5.3. Reg<strong>en</strong>eración <strong>de</strong> microbulbillos <strong>de</strong> R. bagnoldii y R. montana <strong>en</strong> medio líquidoadicionado con retardantes <strong>de</strong> crecimi<strong>en</strong>to.Se realizaron dos <strong>en</strong>sayos <strong>en</strong> forma in<strong>de</strong>p<strong>en</strong>di<strong>en</strong>te con microbulbillos <strong>de</strong> difer<strong>en</strong>tes g<strong>en</strong>otipos<strong>de</strong> R. bagnoldii y R. montana, cultivado <strong>en</strong> medio adicionado con 0.85, 1.7, 3.4 y 6.8 M <strong>de</strong>Paclobutrazol (PBZ), a<strong>de</strong>más <strong>de</strong> un medio <strong>de</strong> Cultivo sin reguladores <strong>de</strong> crecimi<strong>en</strong>to (Testigo 1)y <strong>de</strong> un medio <strong>de</strong> Cultivo adicionado solo con 4.4 M <strong>de</strong> MTP (Testigo 2).Se aplicó un ANOVA y comparaciones múltiples <strong>de</strong> promedio mediante <strong>el</strong> test LSD (difer<strong>en</strong>ciamínima significativa) al 5% <strong>de</strong> significancia, con excepción <strong>de</strong> la variable Tasa <strong>de</strong> propagaciónque se evaluó mediante <strong>el</strong> test <strong>de</strong> Kruskall Wallis, aplicando <strong>el</strong> Test <strong>de</strong> Bonferroni paracomparaciones múltiples <strong>de</strong> promedios.Informe Técnico y <strong>de</strong> Gestión Final 22
Proyecto BID-PI-C-2001-1-A-071“<strong>Aplicaciones</strong> biotecnológicas <strong>en</strong> <strong>el</strong> mejorami<strong>en</strong>to g<strong>en</strong>ético <strong>de</strong> especies <strong>de</strong> Rhodophialachil<strong>en</strong>asEn <strong>el</strong> caso d<strong>el</strong> <strong>en</strong>sayo con R. bagnoldii para la evaluación estadística fueron <strong>el</strong>iminadosalgunos tratami<strong>en</strong>tos <strong>de</strong>bido a la pérdida <strong>de</strong> material por contaminación.Cuadro 10. Comportami<strong>en</strong>to <strong>de</strong> R. bagnoldii y R. montana <strong>en</strong> medio <strong>de</strong> Cultivoadicionado con retardantes <strong>de</strong> crecimi<strong>en</strong>to.Tratami<strong>en</strong>tosTasaPropagación *Peso planta(g)Peso bulbo(g)IC bulboDiámetrobulbo (cm)Longitudbrote (cm)R. bagnoldiiTestigo 1 2.28 4.62 2.71 a 1.35 a 0.37 cb 6.57 abTestigo 2 0.57 3.38 0.85 b -0.27 b 0.31 c 4.00 b0.85 M PBZ 2.14 6.20 2.30 a 0.79 ab 0.65 ba 10.16 a6.8 M PBZ 1.00 6.02 3.01 a 1.69 a 1.05 a 5.71 bSignif. 5% N.S. N.S. * * * *R. montanaTestigo 1 1.00 2.83 1.43 2.06 0.71 9.83Testigo 2 1.16 2.84 1.63 2.33 0.88 10.660.85 M PBZ 1.33 2.06 0.84 1.58 0.53 10.331.7 M PBZ 1.50 2.50 0.81 1.90 0.73 9.663.4 M PBZ 1.50 2.49 0.85 2.05 0.55 8.006.8 M PBZ 1.00 4.11 2.54 3.25 1.43 3.83Signif. 5% N.S. N.S. N.S. N.S. N.S. N.S.*N° bulbos finales/explanteDe acuerdo con los resultados pres<strong>en</strong>tados anteriorm<strong>en</strong>te se pue<strong>de</strong> observar que <strong>el</strong> retardante<strong>de</strong> crecimi<strong>en</strong>to paclobutrazol afecta la longitud d<strong>el</strong> brote <strong>en</strong> forma significativa <strong>en</strong> <strong>el</strong> caso <strong>de</strong> R.bagnoldii y <strong>en</strong> <strong>el</strong> caso <strong>de</strong> R. montana se obtuvieron brotes <strong>de</strong> m<strong>en</strong>or tamaño pero sindifer<strong>en</strong>cias significativas <strong>en</strong>tre los tratami<strong>en</strong>tos. La disminución d<strong>el</strong> crecimi<strong>en</strong>to d<strong>el</strong> brote masque favorecer la formación <strong>de</strong> nuevos microbulbillos favorece <strong>el</strong> peso y tamaño <strong>de</strong> losmicrobulbillos, con lo cual pue<strong>de</strong> plantearse como una bu<strong>en</strong>a forma para <strong>en</strong>gordarmicrobulbillos in vitro.En g<strong>en</strong>eral, se pue<strong>de</strong> concluir que la capacidad <strong>de</strong> r<strong>en</strong>egeración <strong>de</strong> Rhodophiala sp. se<strong>en</strong>cu<strong>en</strong>tra influ<strong>en</strong>ciada por <strong>el</strong> g<strong>en</strong>otipo mas que por las condiciones nutricionales a la que sonsometidas. Sin embargo, los <strong>en</strong>sayos realizados han permitido concluir que las mejorescondiciones para promover la multiplicación <strong>de</strong> los microbulbillos son <strong>en</strong> un medio sinreguladores <strong>de</strong> crecimi<strong>en</strong>to o adicionados con 2,2 M <strong>de</strong> Meta-topolina, pero con tasas <strong>de</strong>multiplicación aún poco efici<strong>en</strong>tes para este tipo <strong>de</strong> cultivo.Informe Técnico y <strong>de</strong> Gestión Final 23
Proyecto BID-PI-C-2001-1-A-071“<strong>Aplicaciones</strong> biotecnológicas <strong>en</strong> <strong>el</strong> mejorami<strong>en</strong>to g<strong>en</strong>ético <strong>de</strong> especies <strong>de</strong> Rhodophialachil<strong>en</strong>as5.4 Resultados cultivo <strong>en</strong> Sistema <strong>de</strong> Inmersión Temporal (SIT)Objetivo: Determinar cantidad <strong>de</strong> explantes. Este <strong>en</strong>sayo se realizó con R. spl<strong>en</strong>d<strong>en</strong>s g<strong>en</strong>otipoNº 363. La evaluación <strong>de</strong> este <strong>en</strong>sayo se realizó a través <strong>de</strong> 3 períodos, obt<strong>en</strong>iéndose losresultados que se indican <strong>en</strong> la tabla.Cuadro 11. N° total <strong>de</strong> microbulbillos cosechados por unidad SIT <strong>de</strong>s<strong>de</strong> distintasd<strong>en</strong>sida<strong>de</strong>s <strong>de</strong> inóculo (N° <strong>de</strong> bulbos iniciales) a través d<strong>el</strong> tiempo (días <strong>en</strong>cultivo SIT)N° Bulbos InicialesDías <strong>en</strong> Cultivo SIT 10 20 3050 10 20 31124 12 25 30184 11 20 17Cuadro 12. N° <strong>de</strong> bulbos recuperados por cada bulbo sembrado por unidad SIT adistintas d<strong>en</strong>sida<strong>de</strong>s <strong>de</strong> inóculo (N° <strong>de</strong> bulbos iniciales) a través d<strong>el</strong> tiempo(días <strong>en</strong> cultivo SIT)N° <strong>de</strong> bulbos inicialesDías <strong>en</strong> Cultivo SIT 10 20 3050 1.0 1.0 1.0124 1.2 1.3 1.0184 1.1 1.0 0.6Se aprecia que utilizando este sistema <strong>de</strong> inmersión temporal no se logró increm<strong>en</strong>tar <strong>el</strong>número <strong>de</strong> bulbillos por cada <strong>de</strong> bulbillo sembrado, cosechándose prácticam<strong>en</strong>te la mismacantidad <strong>de</strong> bulbillos sembrados inicialm<strong>en</strong>te al final <strong>de</strong> 184 días <strong>de</strong> evaluación. Incluso, a unad<strong>en</strong>sidad <strong>de</strong> inóculo alta (30 bulbillos por frasco) se perdió material, recuperándose al final d<strong>el</strong>período d<strong>el</strong> experim<strong>en</strong>to un 60% d<strong>el</strong> material sembrado original, por lo que este sistema no fueefectivo <strong>en</strong> producir micropropagación. Utilizar más allá <strong>de</strong> 20 bulbillos por unidad frasco esaún más perjudicial, probablem<strong>en</strong>te por un exceso <strong>de</strong> humedad r<strong>el</strong>ativa y problemas <strong>de</strong>contaminación.Debido a que los resultados d<strong>el</strong> <strong>en</strong>sayo anterior hicieron vislumbrar una situación pocofavorable para <strong>el</strong> cultivo <strong>de</strong> Rhodophiala bajo <strong>el</strong> sistema <strong>de</strong> inmersión temporal, se establecióun <strong>en</strong>sayo <strong>en</strong> don<strong>de</strong> se comparan los difer<strong>en</strong>tes sistemas <strong>de</strong> cultivo utilizados hasta <strong>el</strong>mom<strong>en</strong>to <strong>en</strong> tres especies <strong>de</strong> Rhodophiala <strong>de</strong> acuerdo a la disponibilidad d<strong>el</strong> material vegetal.Informe Técnico y <strong>de</strong> Gestión Final 24
Proyecto BID-PI-C-2001-1-A-071“<strong>Aplicaciones</strong> biotecnológicas <strong>en</strong> <strong>el</strong> mejorami<strong>en</strong>to g<strong>en</strong>ético <strong>de</strong> especies <strong>de</strong> Rhodophialachil<strong>en</strong>as5.5 Efecto <strong>de</strong> distintos sistemas <strong>de</strong> cultivo in vitro. Se comparó <strong>el</strong> efecto <strong>de</strong> distintosmétodos para <strong>el</strong> cultivo in vitro <strong>en</strong> R. spl<strong>en</strong>d<strong>en</strong>s, R. ananuca y R.montana.Cuadro 13. Comparación <strong>de</strong> difer<strong>en</strong>tes sistemas <strong>de</strong> cultivo <strong>en</strong> tres especies <strong>de</strong>RhodophialaSistemaNúmero <strong>de</strong>brotesÍndice <strong>de</strong>crecimi<strong>en</strong>toÍndice <strong>de</strong> crecimi<strong>en</strong>to<strong>de</strong> bulbo%HiperhidricidadR. spl<strong>en</strong>d<strong>en</strong>sSIT 20 6.3 ± 1.5 1.1 ± 0.4 0.6 ± 0.2 4.2 ± 7.2 aSIT 40 5.3 ± 0.6 1.2 ± 0.2 0.9 ± 0.1 24.4 ± 21.4 abSIT 60 6.0 ± 1.0 1.1 ± 0.8 0.8 ± 0.6 37.9 ± 20.3 abLíquido algodón 5.0 ± 0.6 1.4 ± 0.8 0.9 ± 0.5 63.3 ± 15.3 bLiquido agitación 5.3 ± 0.6 1.7 ± 2.2 1.4 ± 2.5 62.2 ± 3.9 bG<strong>el</strong>ificado 5.0 ± 0.0 0.6 ± 0.1 0.4 ± 0.04 6.7 ± 11.5 aSignif. 5% N.S. N.S. N.S. *R. montanaSIT 20 5.3 ± 0.6 0.3 ± 0.4 0.2 ± 0.3 17.8 ± 16.8SIT 40 5.3 ± 0.6 0.8 ± 0.4 0.6 ± 0.3 16.7 ± 28.9SIT 60 6.3 ± 1.5 0.7 ± 0.6 0.3 ± 0.3 0.0 + 0.0Liquido algodón 5.0 ± 0.0 0.4 ± 0.1 0.1 ± 0.1 13.3 ± 11.5G<strong>el</strong>ificado 6.0 ± 1.0 0.1 ± 0.3 -0.1 ± 0.2 18.1 ± 20.3Signif. 5% N.S. N.S. N.S. N.S.R. ananucaSIT 20 9.3 ± 2.1 a 1.9 ± 1.4 1.1 ± 1.0 12.1 ± 21.0 aSIT 40 5.7 ± 1.2 a b 1.0 ± 0.9 0.8 ± 0.8 24.8 ± 13.5 aSIT 60 6.7 ± 0.6 a b 1.5 ± 0.5 1.0 ± 0.7 19.0 ± 21.8 aLiquido algodón 8.0 ± 2.0 a b 2.6 ± 2.4 0.9 ± 0.9 7.5 ± 6.6 aLiquido agitación 5.0 ± 0.0 b 0.6 ± 0.4 0.5 ± 0.5 93.3 ± 11.5 bG<strong>el</strong>ificado 8.0 ± 1.7 a b 0.6 ± 0.3 0.2 ± 0.1 3.7 ± 6.4 aSignif. 5% * N.S. N.S. *SIT = Sistema <strong>de</strong> inmersión temporalInforme Técnico y <strong>de</strong> Gestión Final 25
Proyecto BID-PI-C-2001-1-A-071“<strong>Aplicaciones</strong> biotecnológicas <strong>en</strong> <strong>el</strong> mejorami<strong>en</strong>to g<strong>en</strong>ético <strong>de</strong> especies <strong>de</strong> Rhodophialachil<strong>en</strong>asEl único parámetro que <strong>en</strong>tregó resultados significativos fue <strong>el</strong> porc<strong>en</strong>taje <strong>de</strong> hiperhidricidad,que es un problema fisiológico que provoca la acumulación interna <strong>de</strong> agua <strong>en</strong> los bulbos, <strong>el</strong>cual <strong>de</strong>p<strong>en</strong>di<strong>en</strong>do <strong>de</strong> su magnitud provoca que este material no reg<strong>en</strong>ere brotes y no sea aptopara subcultivos posteriores.De acuerdo a los resultados observados <strong>en</strong> <strong>el</strong> Cuadro 1, <strong>el</strong> uso d<strong>el</strong> sistema <strong>de</strong> inmersióntemporal permitió reducir los niv<strong>el</strong>es <strong>de</strong> hiperhidricidad fr<strong>en</strong>te a los otros sistemas <strong>en</strong> mediolíquido, especialm<strong>en</strong>te <strong>en</strong> <strong>el</strong> tratami<strong>en</strong>to con m<strong>en</strong>or cantidad <strong>de</strong> medio <strong>de</strong> cultivo por explante(20 mL/explante). En R. ananuca, <strong>el</strong> cultivo <strong>en</strong> medio líquido <strong>en</strong> agitación increm<strong>en</strong>tó <strong>el</strong>porc<strong>en</strong>taje <strong>de</strong> explantes hiperhidratados y produjo m<strong>en</strong>or número <strong>de</strong> brotes que <strong>el</strong> tratami<strong>en</strong>tocon 20 mL/explante.En cuanto a la reg<strong>en</strong>eración, no existieron difer<strong>en</strong>cias significativas <strong>en</strong> <strong>el</strong> número <strong>de</strong> brotes eíndice <strong>de</strong> crecimi<strong>en</strong>to <strong>en</strong> ninguno <strong>de</strong> los tratami<strong>en</strong>tos utilizados. Para R. montana no se<strong>de</strong>tectaron difer<strong>en</strong>cias <strong>en</strong>tre los distintos sistemas <strong>de</strong> cultivo. En esta especie no se aplicó <strong>el</strong>tratami<strong>en</strong>to <strong>en</strong> agitación orbital.Se pue<strong>de</strong> concluir que <strong>en</strong> g<strong>en</strong>eral la respuesta <strong>de</strong> las tres especies fue muy variable, pero esuniforme <strong>en</strong> cuanto al sistema <strong>de</strong> cultivo utilizado, ya que se obtuvieron resultados similares <strong>de</strong>reg<strong>en</strong>eración, sin po<strong>de</strong>r <strong>de</strong>terminarse que <strong>el</strong> Sistema <strong>de</strong> Inmersión Temporal sea más efici<strong>en</strong>te.Debido a la poca habilidad <strong>de</strong> reg<strong>en</strong>eración <strong>de</strong> Rhodophiala <strong>en</strong> los sistemas tradicionales <strong>de</strong>cultivo (<strong>en</strong> medios sólidos), es poco probable que mejore su multiplicación <strong>en</strong> <strong>el</strong> cultivo coninmersión temporal, <strong>en</strong>contrándose esta respuesta influ<strong>en</strong>ciada mas por <strong>el</strong> g<strong>en</strong>otipo que por lascondiciones nutritivas y <strong>de</strong> cultivo utilizadas5.6 Aclimatación y crecimi<strong>en</strong>to post transplante <strong>de</strong> material prov<strong>en</strong>i<strong>en</strong>te <strong>de</strong> condicionesin vitro.Cuadro 14. Porc<strong>en</strong>taje <strong>de</strong> sobreviv<strong>en</strong>cia, peso e índice <strong>de</strong> crecimi<strong>en</strong>to <strong>de</strong>spués <strong>de</strong> tresetapas <strong>de</strong> aclimatación.Medio <strong>de</strong> orig<strong>en</strong> yespecies% <strong>de</strong> Sobreviv<strong>en</strong>cia Peso <strong>de</strong>sobrevivi<strong>en</strong>tes (g)Índice <strong>de</strong>crecimi<strong>en</strong>toR. montanaSólido 87.2 1.38 ± 1.03 1.86 ± 1.53Liquido 68.8 1.95 ± 1.24 1.24 ± 1.435% signif. N.S. N.S.R. spl<strong>en</strong>d<strong>en</strong>sSólido 93.8 1.51 ± 1.13 2.43 ± 2.09Liquido 37.5 2.35 ± 1.61 1.18 ± 1.055% signif. N.S. N.S.R. ananucaSólido 93.8 1.97 ± 0.64 2.25 ± 1.19 aLiquido 37.5 1.69 ± 0.70 0.67 ± 0.54 b5% signif. N.S. *Informe Técnico y <strong>de</strong> Gestión Final 26
Proyecto BID-PI-C-2001-1-A-071“<strong>Aplicaciones</strong> biotecnológicas <strong>en</strong> <strong>el</strong> mejorami<strong>en</strong>to g<strong>en</strong>ético <strong>de</strong> especies <strong>de</strong> Rhodophialachil<strong>en</strong>asEl cuadro 2 muestra que <strong>el</strong> mayor porc<strong>en</strong>taje <strong>de</strong> sobreviv<strong>en</strong>cia se obti<strong>en</strong>e <strong>en</strong> plantas quefueron cultivadas <strong>en</strong> medio sólido.Cuadro15. Parámetros evaluados <strong>en</strong> Rhodophiala sp. <strong>de</strong>spués <strong>de</strong> tres etapas <strong>de</strong>aclimatación.Medio <strong>de</strong>orig<strong>en</strong> yespeciesDiámetro(mm)Nº <strong>de</strong> hojas Longitud <strong>de</strong> la hojamayor (cm)Nº <strong>de</strong> raíces Longitud d<strong>el</strong>a raíz máslarga (cm)R. montanaSólido 6.35 ± 2.94 1.85 ± 0.86 12.8 ± 5.65 3.35 ± 2.84 19.7 ± 11.7Líquido 7.90 ± 2.51 2.18 ± 1.99 12.1 ± 7.51 7.45 ± 6.99 23.6 ± 14.95% signif. N.S. N.S. N.S. N.S. N.S.R. spl<strong>en</strong>d<strong>en</strong>sSólido 6.34 ± 2.0 a 1.53 ± 0.74 17.8 ± 5.21 7.93 ± 9.45 18.5 ± 7.94Líquido 8.38 ± 1.6 b 1.83 ± 0.75 13.9 ± 8.05 9.16 ± 11.3 19.8 ± 10.65% signif. N.S. N.S. N.S. N.S. N.S.R. ananucaSólido 8.23 ± 1.11 1.73 ± 0.79 20.7 ± 4.18 1.66 ± 0.81 25.3 ± 7.43Líquido 7.90 ± 0.82 1.83 ± 0.75 19.2 ± 4.09 1.93 ± 0.88 21.4 ± 7.425% signif. N.S. N.S. N.S. N.S. N.S.Después <strong>de</strong> tres estados <strong>de</strong> aclimatación, la sobreviv<strong>en</strong>cia <strong>de</strong> las plantas prov<strong>en</strong>i<strong>en</strong>tes <strong>de</strong>medio sólido fue mayor que la prov<strong>en</strong>i<strong>en</strong>te <strong>de</strong> medio líquido, sin embargo, al cabo <strong>de</strong> algunosmeses <strong>de</strong> aclimatación, <strong>el</strong> crecimi<strong>en</strong>to <strong>de</strong> las plantas prov<strong>en</strong>i<strong>en</strong>tes <strong>de</strong> ambos medios <strong>de</strong> cultivo(sólido y líquido) <strong>en</strong> R. montana y R. spl<strong>en</strong>d<strong>en</strong>s se comp<strong>en</strong>só. En R. ananuca, las plantasprov<strong>en</strong>i<strong>en</strong>tes <strong>de</strong> medio sólido tuvieron un índice <strong>de</strong> crecimi<strong>en</strong>to mayor.5.7 Seguimi<strong>en</strong>to a largo plazo <strong>de</strong> material cultivado in vitro: las plántulas que se hanmant<strong>en</strong>ido <strong>en</strong> <strong>el</strong> inverna<strong>de</strong>ro d<strong>el</strong> Laboratorio <strong>de</strong> Cultivo <strong>de</strong> Tejidos Vegetales, se han evaluado<strong>en</strong> cuanto a su crecimi<strong>en</strong>to, aum<strong>en</strong>to <strong>de</strong> peso, calibre y floración a través d<strong>el</strong> tiempo durante <strong>el</strong>transcurso d<strong>el</strong> proyecto.Para la población <strong>de</strong> R. montana mant<strong>en</strong>ida <strong>en</strong> inverna<strong>de</strong>ro se han obt<strong>en</strong>ido los sigui<strong>en</strong>tesresultados:Informe Técnico y <strong>de</strong> Gestión Final 27
Proyecto BID-PI-C-2001-1-A-071“<strong>Aplicaciones</strong> biotecnológicas <strong>en</strong> <strong>el</strong> mejorami<strong>en</strong>to g<strong>en</strong>ético <strong>de</strong> especies <strong>de</strong> Rhodophialachil<strong>en</strong>asCuadro 16. Evaluación <strong>de</strong> población <strong>de</strong> R. montana y porc<strong>en</strong>taje <strong>de</strong> floración a marzo <strong>de</strong>2007 <strong>en</strong> cada cuartil.Cuartil* Peso Diam. Cuartil Calibre IC % Floracióncuartil (g) (mm)(cm)1 17.3 19.0 6.0 4.5 02 24.8 22.3 7.0 7.4 03 38.5 24.0 7.6 12.1 04 50.7 29.4 9.2 10.5 42.8Cuartil Largo hoja Ancho hoja N° hojas N° raíces Largo raíces(cm) (mm)(cm)1 39.5 5.4 3.3 5.9 39.22 41.9 5.9 4.4 8.1 34.83 51.3 6.9 5.9 11.3 39.14 50.3 7.9 7.7 12.4 39.7 población <strong>de</strong> 28 plantasSe aprecia que las plantas que lograron florecer correspond<strong>en</strong> al cuartil N° 4, o sea al grupoconstituido por <strong>el</strong> 25% <strong>de</strong> las plantas <strong>de</strong> mayor peso. Existe una clara r<strong>el</strong>ación <strong>en</strong>tre la biomasaalcanzada y la capacidad <strong>de</strong> florecer. En las plantas pert<strong>en</strong>eci<strong>en</strong>tes a cuartiles inferiores noocurrió floración.Las gráficas que se muestran a continuación correspond<strong>en</strong> a la evolución d<strong>el</strong> peso durante los30 meses post trasplante a inverna<strong>de</strong>ro. Las mediciones realizadas <strong>en</strong> las plantas individualesfueron promediadas repres<strong>en</strong>tando cada punto <strong>en</strong> la curva una fecha distinta <strong>en</strong> que se realizóla medición, midiéndose <strong>el</strong> mismo grupo <strong>de</strong> plantas <strong>en</strong> difer<strong>en</strong>tes fechas a los largo <strong>de</strong> 30meses. Se ajustó una curva <strong>de</strong> aum<strong>en</strong>to <strong>de</strong> peso <strong>en</strong> <strong>el</strong> tiempo a través <strong>de</strong> una regresión.Peso <strong>de</strong> plantas <strong>de</strong> R. montana a lo largo <strong>de</strong> 30mesesN = 28Peso (g)50403020100y = 0,1589e 0,1793xR 2 = 0,978132,41,13,70 4 8 12 16 20 24 28 32 36Meses a partir <strong>de</strong> plantación <strong>en</strong> inverna<strong>de</strong>roSe incluye ecuación <strong>de</strong> regresión. Líneas verticales indican <strong>de</strong>sviación estándarFigura 4. Increm<strong>en</strong>to <strong>en</strong> peso <strong>de</strong> los bulbos <strong>en</strong> R. montana, durante 30 meses <strong>de</strong> cultivo<strong>en</strong> inverna<strong>de</strong>ro.Informe Técnico y <strong>de</strong> Gestión Final 28
Proyecto BID-PI-C-2001-1-A-071“<strong>Aplicaciones</strong> biotecnológicas <strong>en</strong> <strong>el</strong> mejorami<strong>en</strong>to g<strong>en</strong>ético <strong>de</strong> especies <strong>de</strong> Rhodophialachil<strong>en</strong>asCalibre bulbo R. montana a lo largo <strong>de</strong> 30meses N=28Calibre bulbo (cm)10,08,06,04,02,00,0y = 0,4297e 0,095xR 2 = 0,95227,12,51,10 4 8 12 16 20 24 28 32 36Meses <strong>de</strong>s<strong>de</strong> plantación <strong>en</strong> inverna<strong>de</strong>roSe incluye ecuación <strong>de</strong> regresión. Líneas verticales indican <strong>de</strong>sviación estándarFigura 5. Aum<strong>en</strong>to <strong>de</strong> calibre <strong>de</strong> los bulbos <strong>en</strong> R. montana <strong>en</strong> inverna<strong>de</strong>ro.A continuación se muestra un gráfico que señala la difer<strong>en</strong>cia <strong>en</strong> <strong>el</strong> peso alcanzado a través d<strong>el</strong>tiempo <strong>en</strong>tre las plantas que lograron la floración y las que no alcanzaron dicho estado.Peso <strong>de</strong> plantas florecidas y no florecidasluego <strong>de</strong> 30 meses <strong>de</strong> cultivoPeso (g)807060504030201000 4 8 12 16 20 24 28 32 36Meses <strong>de</strong>s<strong>de</strong> plantación <strong>en</strong>inverna<strong>de</strong>roFlorecidasNo florecidasFigura 6. Aum<strong>en</strong>to <strong>de</strong> peso <strong>de</strong> las plantas <strong>de</strong> R. montana <strong>en</strong> inverna<strong>de</strong>ro.Informe Técnico y <strong>de</strong> Gestión Final 29
Proyecto BID-PI-C-2001-1-A-071“<strong>Aplicaciones</strong> biotecnológicas <strong>en</strong> <strong>el</strong> mejorami<strong>en</strong>to g<strong>en</strong>ético <strong>de</strong> especies <strong>de</strong> Rhodophialachil<strong>en</strong>asCon respecto a las características <strong>de</strong> las flores observadas, estas fueron las sigui<strong>en</strong>tes:CaracterísticaPromedio ± D.EFloración 7.5Días <strong>en</strong> flor 14.0 +/-1.7N° <strong>de</strong> varas florales 1.0 +/-0.0N° <strong>de</strong> flores x vara 2.7 +/-0.6Largo vara floral 45.0 +/-2.6Diámetro <strong>de</strong> la flor 3.8 +/-0.6Largo tépalos 3.5 +/-0.5Ancho tépalos 0.8 +/-0.1Color tépalosAmarilloN° <strong>de</strong> tépalos 6.0+/-0.0N° estambres 6.0+/-0.0N° hojas pres<strong>en</strong>tes 4.5+/-0.7Largo hojas 36.0+/-7.1Ancho hojas 0.6+/-0.1Formación <strong>de</strong> frutos 0.0+/-0.0n=3Figura 7. Plántulas mant<strong>en</strong>idas <strong>en</strong> cont<strong>en</strong>edores <strong>de</strong> mayor capacidad.Como lo señalan estudios previos realizados por <strong>el</strong> grupo <strong>de</strong> la Universidad <strong>de</strong> Talca, lasplantas <strong>de</strong> Rhodophiala no pres<strong>en</strong>tan receso, sino que solam<strong>en</strong>te disminuy<strong>en</strong> su <strong>de</strong>sarrollo <strong>en</strong>cuanto al número <strong>de</strong> hojas y probablem<strong>en</strong>te restringi<strong>en</strong>do <strong>el</strong> crecimi<strong>en</strong>to durante los meses <strong>de</strong>abril a septiembre (observación visual).Otra población observada fueron 100 plantas mant<strong>en</strong>idas <strong>en</strong> macetas <strong>de</strong> 1,5 L (macetasconsist<strong>en</strong>tes <strong>en</strong> bot<strong>el</strong>las plásticas modificadas). Estas plantas, prov<strong>en</strong>i<strong>en</strong>tes d<strong>el</strong> cultivo in vitro,fueron ingresadas al inverna<strong>de</strong>ro <strong>en</strong> noviembre <strong>de</strong> 2004, colocadas <strong>en</strong> tubotes y luegotrasladas a bot<strong>el</strong>las plásticas <strong>de</strong> 1,5 L. La floración <strong>de</strong> estas plantas se registró <strong>de</strong>sd<strong>en</strong>oviembre 2006 a Marzo <strong>de</strong> 2007.La sigui<strong>en</strong>te tabla muestra las características <strong>de</strong> la floración <strong>de</strong> las distintas plantas:Informe Técnico y <strong>de</strong> Gestión Final 30
Proyecto BID-PI-C-2001-1-A-071“<strong>Aplicaciones</strong> biotecnológicas <strong>en</strong> <strong>el</strong> mejorami<strong>en</strong>to g<strong>en</strong>ético <strong>de</strong> especies <strong>de</strong> Rhodophialachil<strong>en</strong>asCaracterísticaPromedio ± D.EEdad cronológica2.0 añosFecha floraciónDías <strong>en</strong> flor 11.3 +/- 2.1N° <strong>de</strong> varas florales 1.0 +/- 0.0N° <strong>de</strong> flores x vara 2.8 +/- 0.6Largo vara floral 38.9 +/- 5.7Diámetro <strong>de</strong> la flor 4.0 +/- 0.3Largo tépalos 3.7 +/- 0.4Ancho tépalos 0.9 +/- 0.1Largo estambres 1.5 +/- 0.0Largo pistilo 2.5 +/- 0.0Color tépalosAmarilloN° <strong>de</strong> tépalos 6.0 +/- 0.0N° estambres 6.0 +/- 0.0N° hojas pres<strong>en</strong>tes 3.9 +/- 1.7Largo hojas pres<strong>en</strong>tes 27.2 +/- 3.8Ancho hojas pres<strong>en</strong>tes 0.5 +/- 0.1Formación <strong>de</strong> fruto 0.0 +/- 0.0n=9Figura 8. Rhodophiala montana <strong>en</strong> floración <strong>en</strong> inverna<strong>de</strong>ro d<strong>el</strong> Laboratorio <strong>de</strong> cultivo<strong>de</strong> Tejidos Vegetales (UACh).Cómo observación cabe señalar que un g<strong>en</strong>otipo floreció dos veces <strong>en</strong> la temporada, <strong>en</strong> losmeses <strong>de</strong> <strong>en</strong>ero y marzo 2007.5.8 Aclimatación y crecimi<strong>en</strong>to ex vitro d<strong>el</strong> g<strong>en</strong>otipo <strong>de</strong> Rhodophiala spl<strong>en</strong>d<strong>en</strong>s Nº 363.El g<strong>en</strong>otipo con mejor coefici<strong>en</strong>te <strong>de</strong> multiplicación in vitro fue <strong>el</strong> Nº 363 <strong>de</strong> R. spl<strong>en</strong>d<strong>en</strong>s, (conuna tasa <strong>de</strong> multiplicación <strong>de</strong> 4), <strong>el</strong> cual fue evaluado durante <strong>el</strong> periodo <strong>de</strong> aclimatación <strong>en</strong>condiciones <strong>de</strong> inverna<strong>de</strong>ro. Para <strong>el</strong>lo microbulbillos cultivado in vitro <strong>en</strong> medio líquido con base<strong>de</strong> algodón, sin raíces y brotes fueron medidos <strong>en</strong> cuanto a su peso y calibre al mom<strong>en</strong>to d<strong>el</strong>Informe Técnico y <strong>de</strong> Gestión Final 31
Proyecto BID-PI-C-2001-1-A-071“<strong>Aplicaciones</strong> biotecnológicas <strong>en</strong> <strong>el</strong> mejorami<strong>en</strong>to g<strong>en</strong>ético <strong>de</strong> especies <strong>de</strong> Rhodophialachil<strong>en</strong>astrasplante. Los microbulbillos se plantaron <strong>en</strong> ban<strong>de</strong>jas con sustrato turba:ar<strong>en</strong>a y fueronmant<strong>en</strong>idos durante un mes <strong>en</strong> inverna<strong>de</strong>ro con una temperatura promedio <strong>de</strong> 22ºC.Cuadro 17. Parámetros evaluados durante la aclimatación d<strong>el</strong> g<strong>en</strong>otipo <strong>de</strong> R. spl<strong>en</strong>d<strong>en</strong>sNº 363Parámetros evaluadosPromedio ± D.E.Sobreviv<strong>en</strong>cia 0.77Peso (g) 0.06 ± 0.04Diámetro (cm 2.54 ±0.73Largo hoja (cm) 2.13 ±1.89Largo raíz (cm 1.17 ±1.20Índice <strong>de</strong> crecimi<strong>en</strong>to /mes -0.32 ± 0.53Aum<strong>en</strong>to largo hojas (cm) 1.40 ±1.86Este g<strong>en</strong>otipo pres<strong>en</strong>tó un 77% <strong>de</strong> sobreviv<strong>en</strong>cia bajo estas condiciones, con <strong>de</strong>sarrollo d<strong>en</strong>uevas hojas y raíces y un índice <strong>de</strong> crecimi<strong>en</strong>to (peso final –peso inicial)/peso inicial)negativo, lo que refleja una <strong>de</strong>shidratación <strong>de</strong> los microbulbillos y/o un balance negativo <strong>en</strong>cuanto a fotosíntesis/respiración. Esta situación es normal <strong>en</strong> etapas iniciales <strong>de</strong> laaclimatación y <strong>de</strong>biera revertirse con <strong>el</strong> transcurso d<strong>el</strong> tiempo.Figura 9. Microbulbillos <strong>de</strong> R. spl<strong>en</strong>d<strong>en</strong>s para aclimatación.Estos resultados <strong>de</strong>muestran no solo la bu<strong>en</strong>a capacidad <strong>de</strong> adaptación al cultivo in vitro d<strong>el</strong>g<strong>en</strong>otipo <strong>de</strong> R. spl<strong>en</strong>d<strong>en</strong>s Nº 363, sino que también su bu<strong>en</strong>a adaptación al Cultivo ex vitro.Este resultado se constituye <strong>en</strong> uno <strong>de</strong> los más importantes d<strong>el</strong> proyecto <strong>de</strong>bido a que permiteverificar que <strong>el</strong> g<strong>en</strong>otipo <strong>de</strong> mejor aptitud multiplicativa, y que pudiera t<strong>en</strong>er alguna posibilidad<strong>en</strong> <strong>el</strong> <strong>de</strong>sarrollo <strong>de</strong> varieda<strong>de</strong>s comerciales, posee una bu<strong>en</strong>a capacidad <strong>de</strong> adaptación alCultivo ex vitro y pue<strong>de</strong> ser cultivado <strong>en</strong> inverna<strong>de</strong>ro. Lam<strong>en</strong>tablem<strong>en</strong>te <strong>en</strong> <strong>el</strong> período d<strong>el</strong>Informe Técnico y <strong>de</strong> Gestión Final 32
Proyecto BID-PI-C-2001-1-A-071“<strong>Aplicaciones</strong> biotecnológicas <strong>en</strong> <strong>el</strong> mejorami<strong>en</strong>to g<strong>en</strong>ético <strong>de</strong> especies <strong>de</strong> Rhodophialachil<strong>en</strong>asproyecto no se produjo floración <strong>de</strong> este g<strong>en</strong>otipo. (La especie R. spl<strong>en</strong>d<strong>en</strong>s no floreció <strong>en</strong> lascondiciones <strong>de</strong> inverna<strong>de</strong>ro no calefaccionado <strong>en</strong> Valdivia).Durante <strong>el</strong> mes <strong>de</strong> diciembre d<strong>el</strong> 2007 <strong>en</strong> <strong>el</strong> inverna<strong>de</strong>ro <strong>de</strong> la Universidad Austral <strong>de</strong> Chilefloreció una planta <strong>de</strong> Rhodophiala montana (g<strong>en</strong>otipo Nº 125), id<strong>en</strong>tificada como posiblepoliploi<strong>de</strong>, ya que había sido tratado con una solución <strong>de</strong> colchicina al 0,2%.Para comprobar su estado cromosómico se realizaron evaluaciones d<strong>el</strong> tamaño <strong>de</strong> pol<strong>en</strong> y d<strong>el</strong>tamaño <strong>de</strong> los tépalos. De acuerdo a las medicines realizadas, <strong>el</strong> tamaño <strong>de</strong> pol<strong>en</strong> d<strong>el</strong> posiblepoliploi<strong>de</strong> es significativam<strong>en</strong>te mayor que <strong>el</strong> producido por los diploi<strong>de</strong>s. Esto fue corroboradopor una prueba <strong>de</strong> t-Stud<strong>en</strong>t (P
Proyecto BID-PI-C-2001-1-A-071“<strong>Aplicaciones</strong> biotecnológicas <strong>en</strong> <strong>el</strong> mejorami<strong>en</strong>to g<strong>en</strong>ético <strong>de</strong> especies <strong>de</strong> Rhodophialachil<strong>en</strong>as* Esta planta fue clasificada como posible poliploi<strong>de</strong> según su tamaño <strong>de</strong> estomassignificativam<strong>en</strong>te mayor a los diploi<strong>de</strong>s (este rasgo está altam<strong>en</strong>te corr<strong>el</strong>acionado con <strong>el</strong> niv<strong>el</strong><strong>de</strong> ploidía)Figura 10. Grano <strong>de</strong> pol<strong>en</strong> <strong>de</strong> una posible planta poliploi<strong>de</strong>A continuación se muestra <strong>el</strong> resultado <strong>de</strong> la medición <strong>de</strong> los tépalos <strong>de</strong> la planta posiblepoliploi<strong>de</strong> comparado con una muestra <strong>de</strong> plantas diploi<strong>de</strong>s.Cuadro 19. Características <strong>de</strong> la flor <strong>de</strong> distintos g<strong>en</strong>otipos <strong>de</strong> R. montana, incluy<strong>en</strong>do unposible poliploi<strong>de</strong> y diploi<strong>de</strong>sLargo vara cmN° flores porvaraLargo tépalosmmAncho tépalosmmG<strong>en</strong>otipom 125poliploi<strong>de</strong> 33 3 43 9montana s/n 37 3 40 0,8m 608 29,5 3m 126 27,5 8 29 7m 149 38 5 35 9m 112 27 3 30 8m 114 20 3 25 7m 170 33 3 37 7m 142 26 4 30 7m 133 32 3 35 8m 789 38,5 3 35 8Promediodiploi<strong>de</strong> 30,9 3,8 32,9 6,9sd 5,68 1,54 4,41 2,24El único rasgo <strong>en</strong> <strong>el</strong> que <strong>el</strong> posible poliploi<strong>de</strong> muestra una leve v<strong>en</strong>taja es <strong>en</strong> <strong>el</strong> largo <strong>de</strong> lostépalos. A continuación se muestra una gráfica <strong>de</strong> los datos correspondi<strong>en</strong>tes a largo <strong>de</strong>tépalos.Informe Técnico y <strong>de</strong> Gestión Final 34
Proyecto BID-PI-C-2001-1-A-071“<strong>Aplicaciones</strong> biotecnológicas <strong>en</strong> <strong>el</strong> mejorami<strong>en</strong>to g<strong>en</strong>ético <strong>de</strong> especies <strong>de</strong> Rhodophialachil<strong>en</strong>asLargo tépalos poliploi<strong>de</strong> (n =1) vs diploi<strong>de</strong> (n=10)mm50403020100poliploi<strong>de</strong>diploi<strong>de</strong>Largo tépaloFigura 11. Largo <strong>de</strong> tépatos <strong>de</strong> un posible poliploi<strong>de</strong> con respecto a un diploi<strong>de</strong>Diploi<strong>de</strong>Poliploi<strong>de</strong>Figura 12. Fotografía <strong>de</strong> planta <strong>de</strong> R. montana g<strong>en</strong>otipo Nº 125 diploi<strong>de</strong> (izquierda) ypoliploi<strong>de</strong> (<strong>de</strong>recha).En resum<strong>en</strong>, los resultados <strong>de</strong> todo <strong>el</strong> proceso <strong>de</strong> inducción <strong>de</strong> poliploidía son bastantemo<strong>de</strong>stos. Sin embargo, ese era uno <strong>de</strong> los riesgos d<strong>el</strong> proyecto, consignados <strong>en</strong> la propuestaoriginal. La poliploidía es una condición g<strong>en</strong>ética que significa la duplicación total <strong>de</strong> g<strong>en</strong>oma,<strong>de</strong> todos los g<strong>en</strong>es y <strong>el</strong>em<strong>en</strong>tos reguladores <strong>de</strong> esos g<strong>en</strong>es (tanto activadores comosil<strong>en</strong>ciadores). Esta situación involucra un cambio <strong>en</strong>orme <strong>en</strong> las activida<strong>de</strong>s metabólicas <strong>de</strong> laplanta, lo que repercute <strong>en</strong> <strong>el</strong> f<strong>en</strong>otipo, tanto positiva como negativam<strong>en</strong>te. Si bi<strong>en</strong>, se hanlogrado avances <strong>en</strong> <strong>el</strong> <strong>de</strong>sarrollo <strong>de</strong> cultivares florícolas utilizando la inducción <strong>de</strong>Informe Técnico y <strong>de</strong> Gestión Final 35
Proyecto BID-PI-C-2001-1-A-071“<strong>Aplicaciones</strong> biotecnológicas <strong>en</strong> <strong>el</strong> mejorami<strong>en</strong>to g<strong>en</strong>ético <strong>de</strong> especies <strong>de</strong> Rhodophialachil<strong>en</strong>asautopoliploidía, no necesariam<strong>en</strong>te cada vez que se induzca poliploidía se producirá unmejorami<strong>en</strong>to. El resultado es bastante incierto. No obstante, esta era una alternativa válidapara int<strong>en</strong>tar aum<strong>en</strong>tar <strong>el</strong> tamaño <strong>de</strong> la infloresc<strong>en</strong>cia con miras a la utilización comercial <strong>de</strong>Rhodophiala.5.9 Resultados <strong>de</strong> estudios citológicos y moleculares <strong>en</strong> torno a clarificar r<strong>el</strong>acionesfilog<strong>en</strong>éticas <strong>en</strong>tre especies e híbridosLa Tabla 1 muestra los números cromosómicos, niv<strong>el</strong>es <strong>de</strong> ploidía, fórmula cariotípica e índices<strong>de</strong> asimetría <strong>de</strong> los cariotipos <strong>de</strong> las distintas especies <strong>de</strong> Rhodophiala estudiadas. Lasespecies muestran números cromosómicos somáticos mayoritariam<strong>en</strong>te 2n=18, existi<strong>en</strong>docasos <strong>de</strong> 2n=16, Los índices <strong>de</strong> asimetría ti<strong>en</strong>d<strong>en</strong> a acercarse a 0.6 <strong>en</strong> la mayoría <strong>de</strong> lasespecies, a excepción <strong>de</strong> R. rhodolirion que es 0.46. En cuatro especies, los 2 pares <strong>de</strong>cromosomas más pequeños son metacéntricos, los <strong>de</strong> mayor tamaño son submetacéntricos ysubt<strong>el</strong>océntricos, <strong>en</strong> R. rhodolirion los 2 pares más pequeños son subt<strong>el</strong>océntrico ysubmetacéntrico, los <strong>de</strong> mayor tamaño son metacéntricos, submetacéntrico y subt<strong>el</strong>océntrico.Análisis <strong>de</strong> las secu<strong>en</strong>cias <strong>de</strong> regiones ITS1/5.8S/ITS2 <strong>en</strong>tre partidores ITS Plant y C26A (738pb) <strong>de</strong> cada especie estudiada rev<strong>el</strong>aron la exist<strong>en</strong>cia <strong>de</strong> escasa variabilidad interespecífica.Entre R. montana y R. spl<strong>en</strong>d<strong>en</strong>s no se <strong>de</strong>tectaron polimorfismos interespecíficos. Entre R.montana y R. bagnoldii, las secu<strong>en</strong>cias <strong>de</strong> ambas especies difirieron por 2 mutacionespuntuales, R. montana y R. phyc<strong>el</strong>loi<strong>de</strong>s por 2 mutaciones puntuales al igual que R. montana yR. ananuca. Al comparar <strong>en</strong>tre sí las <strong>de</strong>más especies, no se <strong>de</strong>tectaron polimorfismosinterespecíficos. En R. montana se <strong>de</strong>tectó polimorfismo intraespecífico <strong>en</strong> un sitio <strong>de</strong> mutaciónpuntual, <strong>en</strong> R. spl<strong>en</strong>d<strong>en</strong>s 2 sitios y <strong>en</strong> R. bagnoldii 3 sitios. Los difer<strong>en</strong>tes sitios <strong>de</strong> mutaciónpuntual intra e interespecíficos, como los sitios <strong>de</strong> restricción para difer<strong>en</strong>tes <strong>en</strong>zimas seindican <strong>en</strong> la Tabla 2. La especie R. rhodolirion constituye un caso especial, difiri<strong>en</strong>do <strong>en</strong> más<strong>de</strong> 90 sitios puntuales <strong>de</strong> mutación con respecto a las <strong>de</strong>más especies.La Figura 1 pres<strong>en</strong>ta un filograma resultado <strong>de</strong> la comparación <strong>de</strong> las secu<strong>en</strong>cias ITS <strong>de</strong> lasespecies estudiadas junto a secu<strong>en</strong>cias reportadas por Meerow et al., (2000) <strong>de</strong> R. cipoana,Phyc<strong>el</strong>la ignea e Hippeastrum brasileum La especies <strong>de</strong> R. ananuca, R. montana, R.phyc<strong>el</strong>loi<strong>de</strong>s, R. spl<strong>en</strong>d<strong>en</strong>s y R.bagnoldii constituy<strong>en</strong> un grupo cercanam<strong>en</strong>te r<strong>el</strong>acionado,alejándose <strong>de</strong> R. rhodolirion que es más cercana a P. ignea y separándose <strong>de</strong> R. cipoana quees más cercana a H. brasileum.Informe Técnico y <strong>de</strong> Gestión Final 36
Proyecto BID-PI-C-2001-1-A-071“<strong>Aplicaciones</strong> biotecnológicas <strong>en</strong> <strong>el</strong> mejorami<strong>en</strong>to g<strong>en</strong>ético <strong>de</strong> especies <strong>de</strong> Rhodophialachil<strong>en</strong>asCuadro 20. Número cromosómico somático, niv<strong>el</strong> <strong>de</strong> ploidía e índices asimetría paradistintas especies <strong>de</strong> RhodophialaEspecie Nº ind. 2n Ploidia Fórmula cariotipica* Indice <strong>de</strong>asimetríaR. montana 4 18 2X 10%: 3sm + 4stR. spl<strong>en</strong>d<strong>en</strong>s 4 18 2X < 10%: 2m0.62>10%: 4sm +3 stR. bagnoldii 2 18 2X 10%: 4sm + 3 stR. ananuca 2 18 2X 10%: 3sm + 4stR. rhodolirion 2 16 2X 10%: 3m + 2sm + 1 st*Se dividió <strong>en</strong> dos grupos <strong>de</strong> cromosomas: pequeños, que individualm<strong>en</strong>te repres<strong>en</strong>tan m<strong>en</strong>osd<strong>el</strong> 10% d<strong>el</strong> complem<strong>en</strong>to haploi<strong>de</strong>; gran<strong>de</strong>s que repres<strong>en</strong>tan más d<strong>el</strong> 10%.Figura 13. Cromosomas metafásicosR.spl<strong>en</strong>d<strong>en</strong>sFigura 14. Cromosomas metafásicosR.rhodolirionInforme Técnico y <strong>de</strong> Gestión Final 37
Proyecto BID-PI-C-2001-1-A-071“<strong>Aplicaciones</strong> biotecnológicas <strong>en</strong> <strong>el</strong> mejorami<strong>en</strong>to g<strong>en</strong>ético <strong>de</strong> especies <strong>de</strong> Rhodophialachil<strong>en</strong>asCuadro 21. Polimorfismos región ITS (738 pb) intra e interespecíficos <strong>en</strong>tredistintas combinaciones <strong>de</strong> especies.Especie R montana R spl<strong>en</strong>d<strong>en</strong>s R. bagnoldii* R. phyc<strong>el</strong>loi<strong>de</strong>s* R. ananuca*R. montanaBase nº 92GGTAGGGNAGNo Base Nº 105GCAACTGCCGGCAACCGCCGBase Nº 106GCAACTGCCGGCAACCGCCGAciI CCGC : 9Base N’ 106GCAACTGCCGGCAACCGCCGAciI CCGC : 6AciI CCGCBase Nº136CCCTAGCCGCCCCAGCCGBfaI CTAGBseYICCCAGCBase Nº 136CCCTAGCCGCCCCAGCCGBfaI CTAG :BseYI CCCAGCBase Nº 136CCCTAGCCGCCCCAGCCGBfaI CTAG :BseYI CCCAGCR.spl<strong>en</strong>d<strong>en</strong>sNo Base nº 105ACNGCACCGCACTGCBase Nº 136CCCAGCCTAGR. bagnoldii Base Nº 92,GGAGGGGTGGBase Nº 239GCAAGGCTAGBase Nº 276CGACAACGGCAAR.phyc<strong>el</strong>loi<strong>de</strong>sNo No NoR. ananuca NoR.rhodolirion+ 90mutacionespuntuales+ 90 mutacionespuntuales+ 90mutacionespuntualesNoNo+ 90 mutacionespuntualesNoNo+ 90 mutacionespuntuales*Las secu<strong>en</strong>cias <strong>de</strong>scritas <strong>en</strong> la tabla correspond<strong>en</strong> a R. montana <strong>en</strong> la fila superior y a R.bagnoldii, R. phyc<strong>el</strong>loi<strong>de</strong>s o R. ananuca <strong>en</strong> la fila inferiorInforme Técnico y <strong>de</strong> Gestión Final 38
Proyecto BID-PI-C-2001-1-A-071“<strong>Aplicaciones</strong> biotecnológicas <strong>en</strong> <strong>el</strong> mejorami<strong>en</strong>to g<strong>en</strong>ético <strong>de</strong> especies <strong>de</strong> Rhodophialachil<strong>en</strong>asFigura 15. Filograma <strong>de</strong> r<strong>el</strong>aciones filog<strong>en</strong>éticas <strong>en</strong>tre distintas especies <strong>de</strong> Rhodophialacon refer<strong>en</strong>cia a especies <strong>de</strong> otros géneros cercanos (Hippeastrum y Phyc<strong>el</strong>la)Informe Técnico y <strong>de</strong> Gestión Final 39
Proyecto BID-PI-C-2001-1-A-071“<strong>Aplicaciones</strong> biotecnológicas <strong>en</strong> <strong>el</strong> mejorami<strong>en</strong>to g<strong>en</strong>ético <strong>de</strong> especies <strong>de</strong> Rhodophialachil<strong>en</strong>asLos resultados <strong>en</strong> cuanto a número y morfología cromosómica (Tabla 1) se correspond<strong>en</strong> conlo reportado por Naranjo y Poggio (2000) para las especies R. bifida (2n = 18 y 16), R. <strong>el</strong>wessi(2n = 18, 36, 72) R. araucana (2n = 54), R. rhodolirion (2n = 16) y R. andicola (2n = 16) y loinformado por Palma-Rojas (1999) <strong>en</strong> R. phyc<strong>el</strong>loi<strong>de</strong>s 2n=18 y R. adv<strong>en</strong>a (2n = 18). El cariotipoes bimodal y bastante constante <strong>en</strong>tre las especies, estando constituido por 2 pares pequeñosmetacéntricos y 7 pares <strong>de</strong> mayor tamaño, submetacéntricos y subt<strong>el</strong>océntricos. La especie R.rhodolirion posee un número y morfología cariotípica difer<strong>en</strong>te. Los resultados confirman losnúmeros básicos propuestos para <strong>el</strong> género <strong>de</strong> x = 9 y x = 8 (Naranjo y Andrada, 1975), lo queti<strong>en</strong>e consist<strong>en</strong>cia con los citotipos reportados por Naranjo y Poggio (2000), que correspond<strong>en</strong>a múltiplos <strong>de</strong> 9. Estos autores reportan casos <strong>de</strong> poliploidía para algunas accesiones. Otroscasos <strong>de</strong> poliploidía han sido reportados por Muñoz et al. 2006, qui<strong>en</strong> obtuvo plantastetraploi<strong>de</strong>s a través d<strong>el</strong> uso <strong>de</strong> colchicina.El índice <strong>de</strong> asimetría es una bu<strong>en</strong>a forma <strong>de</strong> expresar la morfología cariotípica g<strong>en</strong>eral <strong>en</strong>plantas (Romero Zarco, 1986). Naranjo y Poggio (2000), <strong>de</strong>scrib<strong>en</strong> índices <strong>de</strong> asimetría <strong>de</strong> 0.55a 0.61 para R. bifida, <strong>de</strong> 0.61 a 0.66 para R. <strong>el</strong>weesi, 0.59 para R. araucana; R. rhodolirion y R.andicola pres<strong>en</strong>taron índices <strong>de</strong> asimetría difer<strong>en</strong>tes, 0.36 y 0.23 respectivam<strong>en</strong>te. En <strong>el</strong>pres<strong>en</strong>te estudio los índices <strong>de</strong> asimetría se aproximaron a 0.6, <strong>de</strong> manera similar a lo<strong>en</strong>contrado por los autores citados, coincidi<strong>en</strong>do también con la difer<strong>en</strong>ciación <strong>de</strong> R. rhodolirion(0.46), cuyo índice <strong>de</strong> asimetría refleja una distinta morfología cromosómica con respecto a las<strong>de</strong>más especies.Des<strong>de</strong> <strong>el</strong> punto <strong>de</strong> vista práctico, la región ITS resultó fácil <strong>de</strong> amplificar <strong>de</strong>bido a la pres<strong>en</strong>cia<strong>de</strong> secu<strong>en</strong>cias altam<strong>en</strong>te conservadas flanqueantes que permitieron obt<strong>en</strong>er secu<strong>en</strong>cias ITS <strong>de</strong>alta calidad <strong>en</strong> todas las especies estudiadas utilizando los cebadores ITS Plant y C26Adiseñados por Varghese et al. (2003)., lo cual reafirma la <strong>de</strong>scrito por Baldwin et al., (1995)para angiospermas, <strong>en</strong> cuanto a la amplia y s<strong>en</strong>cilla aplicabilidad <strong>de</strong> esta región <strong>en</strong> estudiosg<strong>en</strong>éticos y construcción <strong>de</strong> filog<strong>en</strong>ias.Sin embargo, a excepción <strong>de</strong> R. rhodolirion, la variablidad <strong>en</strong>contrada <strong>en</strong>tre las especiesestudiadas fue escasa (Figura 1), incluso la variabilidad <strong>en</strong>contrada <strong>en</strong>tre distintos individuos<strong>de</strong> R. spl<strong>en</strong>d<strong>en</strong>s es mayor a la pres<strong>en</strong>te <strong>en</strong>tre R. bagnoldii, R. phyc<strong>el</strong>loi<strong>de</strong>s y R. ananuca,haci<strong>en</strong>do difícil la id<strong>en</strong>tificación <strong>de</strong> posibles híbridos interespecíficos a través <strong>de</strong> sitios <strong>de</strong>restricción polimórficos que permitan habilitar la técnica ITS-RFLP. Teóricam<strong>en</strong>te, sería factible<strong>de</strong>tectar híbridos <strong>en</strong>tre R. montana y las especies: R. ananuca, R. phyc<strong>el</strong>loi<strong>de</strong>s y R. bagnoldii(Tabla 2). Los híbridos <strong>en</strong>tre las otras combinaciones no podrían reconocerse a partir d<strong>el</strong>estudio <strong>de</strong> este fragm<strong>en</strong>to. Esto se suma a la constancia d<strong>el</strong> cariotipo <strong>en</strong>tre estas especies, quetambién dificuLa la búsqueda <strong>de</strong> evid<strong>en</strong>cia cariológica <strong>de</strong> hibridación. Estas dos estrategias,molecular (ITS-RFLP) y cariológica, han sido usadas por P<strong>el</strong>legrino et al., 2005 <strong>en</strong> laconfirmación <strong>de</strong> hibridación <strong>en</strong>tre Orchis mascula y O. provincialis. Obviam<strong>en</strong>te R. rhodolirionconstituye una excepción, aunque sería difícil esperar <strong>de</strong>sc<strong>en</strong>d<strong>en</strong>cia viable <strong>de</strong> la cruza <strong>de</strong> estaespecie con algún repres<strong>en</strong>tante d<strong>el</strong> resto <strong>de</strong> las especies d<strong>el</strong> género.La reducida variabilidad <strong>en</strong>contrada <strong>en</strong>tre un grupo <strong>de</strong> especies, <strong>el</strong> que a su vez difierefuertem<strong>en</strong>te <strong>de</strong> especies como R. rhodolirion y R. cipoana, reafirma la necesidad <strong>de</strong> revisar lataxonomía d<strong>el</strong> género. Al comparar la secu<strong>en</strong>cia ITS obt<strong>en</strong>ida <strong>de</strong> R. rhodolirion con lassecu<strong>en</strong>cias exist<strong>en</strong>tes <strong>en</strong> la base <strong>de</strong> datos “nucleoti<strong>de</strong> collection” <strong>de</strong> NCBIwww.ncbi.nlm.nhi.gov la mayor homología se pres<strong>en</strong>ta con Phyc<strong>el</strong>la ignea. Sin embargo, noexist<strong>en</strong> autores que sugieran la reclasificación <strong>de</strong> R. rhodolirion <strong>en</strong> <strong>el</strong> género Phyc<strong>el</strong>la.Informe Técnico y <strong>de</strong> Gestión Final 40
Proyecto BID-PI-C-2001-1-A-071“<strong>Aplicaciones</strong> biotecnológicas <strong>en</strong> <strong>el</strong> mejorami<strong>en</strong>to g<strong>en</strong>ético <strong>de</strong> especies <strong>de</strong> Rhodophialachil<strong>en</strong>asLos resultados <strong>de</strong> los estudios moleculares realizados <strong>en</strong> esta oportunidad concuerdan con losugerido por Naranjo y Poggio (2000) y con lo propuesto por Rav<strong>en</strong>na (2003), acerca <strong>de</strong>rehabilitar <strong>el</strong> género Rhodolirion.BIBLIOGRAFIABaldwin, B., San<strong>de</strong>rson, M., Porter, M., Wojciechhowski, M., Campb<strong>el</strong>l, C. y Donoghe, M. TheITS region of nuclear ribosomal DNA: A valuable source of evid<strong>en</strong>ce on angiosperm phylog<strong>en</strong>y.1995. Annals of the Missouri botanical gard<strong>en</strong>. 82: 247 – 277.Grant, J., Brown, A. y Grace, J. 1984. Cytological and isozyme diversity in Glycine tom<strong>en</strong>t<strong>el</strong>laHayata (leguminosae). Australian Journal of Botany 32: 665 – 667.King, R., Gornall, R., Preston, C. y Croft, J.M. 2001. Molecular confirmation of Potamogeton xbottnicus (P.pectinatus x P. vaginatus, Potamogetonaceae) in Britain. Botanical Journal of theLinnean Society, 135: 67 – 70.Levan, A., Fredga, K., y Sandberg, A. 1964. Nom<strong>en</strong>clatura for c<strong>en</strong>tromeric position onchromosomes. Hereditas 52:201-220.Meerow, A., Guy, C., Qin-Bao, L., Yang, S. 2000. Phylog<strong>en</strong>y of the American Amaryllidaceaebased on nrDNA ITS sequ<strong>en</strong>ces. Systematic Botany 25: 708 – 726Muñoz, M., Rieg<strong>el</strong>, R And Seemann, P. 2006. Use of image citometry for the early scre<strong>en</strong>ing ofinduced autopolyploids. Plant Breeding 125: 414-416.Naranjo, C.A. y Andra<strong>de</strong>, B. 1975. El cariotipo fundam<strong>en</strong>tal d<strong>el</strong> género Hippeastrum Herb.(Amaryllidaceae) Darviniana 19:556-582.Naranjo, C. y Poggio, L. 2000. Karyotypes of five Rhodophiala species (Amaryllidaceae).Boletin <strong>de</strong> la Sociedad Arg<strong>en</strong>tina <strong>de</strong> Botánica. 35 (3-4): 335-343.Olate, E. Y Bridg<strong>en</strong>, M. 2005. Techniques for the in vitro propagation of Rhodophiala andLeucocoryne spp. Acta Horticulturae 673: 335 – 339Palma-Rojas, C. 1999. Caracterización citog<strong>en</strong>ética <strong>de</strong> los géneros Rhodophiala Presl. yPhyc<strong>el</strong>la Lindl. (Amaryllidaceae). In: Los neófitos nativos y su importancia <strong>en</strong> la floricuLura.Schiappacasse, F.y Peñailillo, P. Eds. Universidad <strong>de</strong> Talca. Chile. Pp. 73 – 79.P<strong>el</strong>legrino, G., Emerico, S., Musacchio, A., Scrugli, A y Cozzolino, S. 2005. Confirmation ofhybridization among sympatric insular populations of Orchis mascula and O. provincialis PlantSystematics and Evolution. 251: 131 – 142.Rav<strong>en</strong>na, P. 2003. Elucidation and systematics of the Chilean g<strong>en</strong>era of Amaryllidaceae.Botánica Australis 2: 1 – 20.Romero Zarco, C. 1986. A new method for estimating karyotype asummetry. Taxon 35: 526 –530.Informe Técnico y <strong>de</strong> Gestión Final 41
Proyecto BID-PI-C-2001-1-A-071“<strong>Aplicaciones</strong> biotecnológicas <strong>en</strong> <strong>el</strong> mejorami<strong>en</strong>to g<strong>en</strong>ético <strong>de</strong> especies <strong>de</strong> Rhodophialachil<strong>en</strong>asSchiappacasse, F.; Peñailillo, P. Y Yánez, P. 2002. Propagación <strong>de</strong> bulbosas chil<strong>en</strong>asornam<strong>en</strong>tales. Editorial Universidad <strong>de</strong> Talca. Talca. Chile. 65 p.Seemann, P., Muñoz, M., Jara, G., Rieg<strong>el</strong>, R., Schiappacasse, F., Peñailillo, P., Vico, V. 2004.Propagación in vitro <strong>de</strong> dos especies <strong>de</strong> Rhodophiala sp. a partir <strong>de</strong> microbulbillos. Resúm<strong>en</strong>es55º Congreso Agronómico <strong>de</strong> Chile. Valdivia 19-22. 10.2004. Nº. 62.Traub, H. 1956. The g<strong>en</strong>era Rhodophiala Presl and Phyc<strong>el</strong>la Lindl.: key to the species andsynonymy. Plant life (Herbertia) 12: 67 – 76.Varguese, R., Chauhan, V. y Misra, A. 2003. Hypervariable spacer regions are good sites for<strong>de</strong>v<strong>el</strong>oping specific PCR-RFLP markers and PCR primers for scre<strong>en</strong>ing actinorhizal symbionts.Journal of Biosci<strong>en</strong>ce 28:437-442.6. PROBLEMAS ENFRENTADOS6.1. Legales: no se pres<strong>en</strong>taron6.2. Técnicos: se <strong>de</strong>cidió no continuar con <strong>el</strong> cultivo <strong>en</strong> medio líquido mediante <strong>el</strong> sistema <strong>de</strong>inmersión temporal, <strong>de</strong>bido a que no se contó con una cantidad apropiada <strong>de</strong> material vegetalpara la realización <strong>de</strong> los <strong>en</strong>sayos.6.3. Administrativos: se solicitó realizar la <strong>de</strong>volución <strong>de</strong> los fondos consi<strong>de</strong>rados para laPreparación y tramitación <strong>de</strong> solicitud <strong>de</strong> pat<strong>en</strong>te, los cuales asc<strong>en</strong>dían a $3.000.000.6.4. De gestión: no se pres<strong>en</strong>taron.Informe Técnico y <strong>de</strong> Gestión Final 42
Proyecto BID-PI-C-2001-1-A-071“<strong>Aplicaciones</strong> biotecnológicas <strong>en</strong> <strong>el</strong> mejorami<strong>en</strong>to g<strong>en</strong>ético <strong>de</strong> especies <strong>de</strong> Rhodophialachil<strong>en</strong>as7. ACTIVIDADES DE DIFUSIONDurante <strong>el</strong> periodo 2006-2008 se pres<strong>en</strong>taron los sigui<strong>en</strong>tes trabajos: 57º Congreso Agronómico <strong>de</strong> Chile. 7º Congreso <strong>de</strong> la Sociedad Chil<strong>en</strong>a <strong>de</strong>Fruticultura. 3er Congreso <strong>de</strong> la Sociedad Chil<strong>en</strong>a <strong>de</strong> Horticultura. 17 al 20 <strong>de</strong>octubre <strong>de</strong> 2006. Santiago.Capacidad <strong>de</strong> reg<strong>en</strong>eración <strong>de</strong> g<strong>en</strong>otipos <strong>de</strong> Rhodophiala spl<strong>en</strong>d<strong>en</strong>s (R<strong>en</strong>gifo)Traub. <strong>en</strong> medio líquido adicionado con retardantes <strong>de</strong> crecimi<strong>en</strong>to.Jara, G., Muñoz, M. y Seemann, P.Instituto <strong>de</strong> Producción y Sanidad Vegetal, Universidad Austral <strong>de</strong> Chile, Valdivia.E-mail: gjara@uach.clA partir d<strong>el</strong> Banco <strong>de</strong> Germoplasma Chil<strong>en</strong>o <strong>de</strong> Rhodophiala se realizó una s<strong>el</strong>ección<strong>de</strong> 65 g<strong>en</strong>otipos <strong>de</strong> R. spl<strong>en</strong>d<strong>en</strong>s, los cuales fueron divididos <strong>en</strong> un grupo <strong>de</strong> 64g<strong>en</strong>otipos y <strong>en</strong> un grupo con clones d<strong>el</strong> g<strong>en</strong>otipo 363, para realizar dos <strong>en</strong>sayosin<strong>de</strong>p<strong>en</strong>di<strong>en</strong>tes. En ambos <strong>en</strong>sayos los microbulbillos fueron sembrados <strong>en</strong> <strong>el</strong> medio<strong>de</strong> Murashige y Skoog (1962), líquido, adicionado con difer<strong>en</strong>tes combinaciones <strong>de</strong>Meta-topolina (0-22.2 µM) y Paclobutrazol (0-17µM), incubándolos durante 2 mesesbajo condiciones controladas. Se realizaron evaluaciones pre y post incubación sobr<strong>el</strong>os parámetros; peso <strong>de</strong> planta y bulbo (g), número y diámetro <strong>de</strong> bulbo (cm), altura <strong>de</strong>brotes (cm), para obt<strong>en</strong>er <strong>el</strong> Índice <strong>de</strong> multiplicación e Índice <strong>de</strong> crecimi<strong>en</strong>to. A<strong>de</strong>másse <strong>de</strong>terminaron visualm<strong>en</strong>te la pres<strong>en</strong>cia <strong>de</strong> hiperhidricidad y contaminación. Losdatos fueron analizados estadísticam<strong>en</strong>te mediante <strong>el</strong> Test <strong>de</strong> Kruskal Wallis, paraluego realizar la comparación múltiple <strong>de</strong> promedios con <strong>el</strong> Test <strong>de</strong> Bonferroni. No seobservaron difer<strong>en</strong>cias significativas para <strong>el</strong> <strong>en</strong>sayo con g<strong>en</strong>otipos múltiples <strong>en</strong>ninguno <strong>de</strong> los tratami<strong>en</strong>tos utilizados y parámetros evaluados, <strong>en</strong> cambio, <strong>en</strong> <strong>el</strong><strong>en</strong>sayo con un solo g<strong>en</strong>otipo se <strong>de</strong>terminaron difer<strong>en</strong>cias significativas para <strong>el</strong>parámetro número <strong>de</strong> brotes. Al contrastar los resultados <strong>de</strong> ambos <strong>en</strong>sayos (mezcla<strong>de</strong> g<strong>en</strong>otipos) y <strong>el</strong> g<strong>en</strong>otipo 363, se <strong>de</strong>terminó que existe una mayor capacidad <strong>de</strong>multiplicación <strong>de</strong> este último g<strong>en</strong>otipo, con un coefici<strong>en</strong>te <strong>de</strong> 3,8 <strong>en</strong> <strong>el</strong> medio con 2,2µM <strong>de</strong> Meta-topolina.Informe Técnico y <strong>de</strong> Gestión Final 43
Proyecto BID-PI-C-2001-1-A-071“<strong>Aplicaciones</strong> biotecnológicas <strong>en</strong> <strong>el</strong> mejorami<strong>en</strong>to g<strong>en</strong>ético <strong>de</strong> especies <strong>de</strong> Rhodophialachil<strong>en</strong>asCultivo in vitro <strong>en</strong> medio semisólido y líquido <strong>en</strong> Rhodophiala: Influ<strong>en</strong>cia <strong>en</strong> <strong>el</strong>crecimi<strong>en</strong>to y aclimatización <strong>de</strong> bulbillosMUÑOZ M. 1 , SEEMANN P. 1 , RIEGEL R. 1 y JARA G. 1Universidad Austral <strong>de</strong> Chile, Facultad <strong>de</strong> Ci<strong>en</strong>cias Agrarias, Instituto <strong>de</strong> Producción ySanidad Vegetal. Casilla 567, Valdivia. Email: mamunoz@uach.clRhodophiala Presl. (Amaryllidaceae) es un género nativo <strong>de</strong> Chile, con notorio pot<strong>en</strong>cialornam<strong>en</strong>tal, que se distribuye <strong>de</strong>s<strong>de</strong> la II a la X región <strong>en</strong>contrándose también <strong>en</strong> Arg<strong>en</strong>tina yBolivia. Debido a la baja tasa <strong>de</strong> propagación natural, <strong>el</strong> cultivo <strong>de</strong> tejidos in vitro pue<strong>de</strong>constituir una valiosa herrami<strong>en</strong>ta que permita la propagación rápida y masiva <strong>de</strong> materialg<strong>en</strong>éticam<strong>en</strong>te homogéneo para futuro uso ornam<strong>en</strong>tal. En este trabajo se realizaron diversosexperim<strong>en</strong>tos empleándose <strong>el</strong> medio Murashige Skoog (1962) semisólido o líquido <strong>en</strong> contactoperman<strong>en</strong>te e intermit<strong>en</strong>te, a través d<strong>el</strong> cultivo <strong>en</strong> inmersión temporal <strong>de</strong> R. spl<strong>en</strong>d<strong>en</strong>s, R.montana y R. ananuca. En un primer <strong>en</strong>sayo, se evaluó la tasa <strong>de</strong> propagación e increm<strong>en</strong>to<strong>en</strong> biomasa <strong>de</strong> estas especies <strong>en</strong> medio semisólido (agar 8 gL-1) versus medio líquido con unsoporte <strong>de</strong> algodón <strong>en</strong> la base d<strong>el</strong> frasco. Existió mayor crecimi<strong>en</strong>to <strong>de</strong> bulbos in vitro <strong>en</strong> R.montana utilizando medio líquido, aunque la aclimatización fue m<strong>en</strong>os exitosa y <strong>el</strong> crecimi<strong>en</strong>toex vitro fue errático, mostrando un comportami<strong>en</strong>to poco homogéneo <strong>en</strong>tre los bulbossobrevivi<strong>en</strong>tes. En cambio, <strong>en</strong> bulbos prov<strong>en</strong>i<strong>en</strong>tes <strong>de</strong> cultivo <strong>en</strong> medio sólido la aclimatizaciónfue más uniforme y controlable para las tres especies <strong>en</strong> estudio. En un segundo <strong>en</strong>sayo, seaplicó inmersión temporal fr<strong>en</strong>te a formas <strong>de</strong> cultivo <strong>en</strong> medio estacionario sólido y líquido. Laaplicación intermit<strong>en</strong>te d<strong>el</strong> medio MS permitió reducir la hiperhidratación <strong>de</strong> los explantes, no<strong>de</strong>tectándose difer<strong>en</strong>cias significativas <strong>en</strong> biomasa y número <strong>de</strong> microbulbillos producidos.Informe Técnico y <strong>de</strong> Gestión Final 44
Proyecto BID-PI-C-2001-1-A-071“<strong>Aplicaciones</strong> biotecnológicas <strong>en</strong> <strong>el</strong> mejorami<strong>en</strong>to g<strong>en</strong>ético <strong>de</strong> especies <strong>de</strong> Rhodophialachil<strong>en</strong>as 2º Simposio <strong>de</strong> Horticultura Ornam<strong>en</strong>tal. Talca, VII Región – Chile. 6 y 7 <strong>de</strong>Diciembre <strong>de</strong> 2007.Cultivo in vitro y aclimatación <strong>de</strong> plántulas <strong>de</strong> Rhodophiala montanaJara, G., Seemann, P., y Muñoz, M.Instituto <strong>de</strong> Producción y Sanidad Vegetal, Facultad <strong>de</strong> Ci<strong>en</strong>cias Agrarias,Universidad Austral <strong>de</strong> Chile. E.mail:gjara@uach.clINTRODUCCIÓNRhodophiala montana es una planta geófita, <strong>de</strong> la familia Amaryllidaceae, que se distribuyeprincipalm<strong>en</strong>te <strong>en</strong> la VII región, <strong>en</strong> su<strong>el</strong>o ar<strong>en</strong>oso. Su floración ocurre <strong>en</strong> primavera y verano,formando flores amarillas, amarilla/anaranjadas, lo cual les otorga características apropiadascomo planta ornam<strong>en</strong>tal. Debido a este pot<strong>en</strong>cial y a su propagación natural poco efici<strong>en</strong>te laaplicación <strong>de</strong> herrami<strong>en</strong>tas biotecnológicas, como <strong>el</strong> Cultivo <strong>de</strong> tejidos, ha sido analizadaconsi<strong>de</strong>rando difer<strong>en</strong>tes tipos <strong>de</strong> material vegetal y condiciones <strong>de</strong> Cultivo para supropagación.La <strong>de</strong>sv<strong>en</strong>taja d<strong>el</strong> cultivo in vitro a partir <strong>de</strong> escamas gem<strong>el</strong>as prov<strong>en</strong>i<strong>en</strong>tes <strong>de</strong> bulbos, ha sidosu bajo porc<strong>en</strong>taje <strong>de</strong> reg<strong>en</strong>eración <strong>de</strong> brotes, <strong>el</strong> que no supera <strong>el</strong> 20% y <strong>en</strong> <strong>el</strong> caso <strong>de</strong> lautilización <strong>de</strong> semillas su poca uniformidad <strong>en</strong> la germinación, con valores que no superan <strong>el</strong>60% <strong>en</strong> un periodo <strong>de</strong> tiempo muy amplio (Jara, et. al. 2004). La multiplicación posterior <strong>de</strong> losmicrobulbillos in vitro tampoco ha dado bu<strong>en</strong>os resultados, con un coefici<strong>en</strong>te <strong>de</strong> multiplicación<strong>de</strong> 2.0 con un corte basal <strong>en</strong> <strong>el</strong> microbulbillo. Muñoz (2006), <strong>de</strong>terminó que la aptitud altransplante <strong>de</strong> bulbos <strong>de</strong> R. montana cultivado <strong>en</strong> medio sólido y líquido no es significativa,<strong>de</strong>terminándose que la sobreviv<strong>en</strong>cia es mejor <strong>en</strong> material prov<strong>en</strong>i<strong>en</strong>te <strong>de</strong> medio sólido que <strong>de</strong>medio líquido.Por lo anterior, se planteó como objetivo d<strong>el</strong> pres<strong>en</strong>te trabajo <strong>de</strong>terminar <strong>el</strong> efecto d<strong>el</strong> calibre d<strong>el</strong>os microbulbillos y <strong>de</strong> difer<strong>en</strong>tes condiciones <strong>de</strong> aclimatación sobre <strong>el</strong> <strong>de</strong>sarrollo vegetativoposterior.MATERIALES Y METODOSPara <strong>el</strong> <strong>en</strong>sayo <strong>de</strong> aclimatación se utilizaron microbulbillos <strong>de</strong> difer<strong>en</strong>tes g<strong>en</strong>otipos <strong>de</strong>Rhodophiala montana, cultivadas in vitro <strong>en</strong> <strong>el</strong> medio nutritivo <strong>de</strong> Murashige y Skoog (1962)adicionado con 1,0 mg/L <strong>de</strong> 6-B<strong>en</strong>zil Amino Purina (BAP) y 0,1 mg/L Acido Naftal<strong>en</strong> Acético(ANA), y g<strong>el</strong>ificado con 8 g/L <strong>de</strong> agar, <strong>de</strong> acuerdo a protocolos previam<strong>en</strong>te <strong>de</strong>sarrollados (Jaraet al. 2004, Seemann et al. 2006) Las plántulas fueron lavadas y <strong>de</strong>sinfectadas con unasolución <strong>de</strong> cloro al 1%, para luego evaluar las variables; número, peso y diámetro <strong>de</strong> losmicrobulbillos, número y longitud <strong>de</strong> raíces.Los microbulbillos <strong>de</strong> R. montana se clasificaron <strong>en</strong> 3 rangos <strong>de</strong> calibre <strong>de</strong> los microbulbillos:Rango 1: <strong>en</strong>tre 0,2- 0.4 cm <strong>de</strong> diámetroRango 2: 0,5 – 0.6 cm <strong>de</strong> diámetroRango 3: 0,7- 1,2 cm <strong>de</strong> diámetroEstos fueron trasladados a dos condiciones ambi<strong>en</strong>tales difer<strong>en</strong>tes. Se comparó <strong>el</strong> efecto <strong>de</strong>dos cámaras <strong>de</strong> incubación cuyas condiciones exactas fueron:1.- Cámara <strong>de</strong> aclimatación 1: una temperatura <strong>de</strong> 22ºC, 16 horas luz y un promedio <strong>de</strong> 50μmol/m 2 s 1 <strong>de</strong> int<strong>en</strong>sidad lumínica.2.- Cámara <strong>de</strong> aclimatación 2: con una temperatura promedio <strong>de</strong> 20ºC, 16 horas luz y unpromedio <strong>de</strong> 40 μmol/m 2 s 1 .Informe Técnico y <strong>de</strong> Gestión Final 45
Proyecto BID-PI-C-2001-1-A-071“<strong>Aplicaciones</strong> biotecnológicas <strong>en</strong> <strong>el</strong> mejorami<strong>en</strong>to g<strong>en</strong>ético <strong>de</strong> especies <strong>de</strong> Rhodophialachil<strong>en</strong>asCada microbulbillo con sus raíces, fue transplantado a ban<strong>de</strong>jas plásticas con una mezcla <strong>de</strong>sustrato compuesto por turba y ar<strong>en</strong>a <strong>en</strong> partes iguales. Se realizó una fertilización cada 15días con solución Hoagland completa. Por cada ban<strong>de</strong>ja se colocaron 6 microbulbillos con 4 o5 repeticiones por tratami<strong>en</strong>to. Las ban<strong>de</strong>jas fueron cubiertas con tapa transpar<strong>en</strong>te, para evitarla <strong>de</strong>shidratación, abriéndose parcialm<strong>en</strong>te a los 10 días.A los 30 días se realizó una segunda evaluación <strong>de</strong> las variables; emerg<strong>en</strong>cia foliar, número ylongitud <strong>de</strong> hojas. Paral<strong>el</strong>am<strong>en</strong>te las plántulas fueron <strong>de</strong>scalzadas y transplantadas a macetas<strong>de</strong> 30 cm <strong>de</strong> alto con tierra, mant<strong>en</strong>iéndose <strong>en</strong> inverna<strong>de</strong>ro, don<strong>de</strong> permanecieron durante 3meses, para evaluar las variables; peso <strong>de</strong> planta completa, número y longitud <strong>de</strong> raíces,número y diámetro <strong>de</strong> bulbos y número <strong>de</strong> hojas.RESULTADOS Y CONCLUSIÓNESLa respuesta <strong>de</strong> la emerg<strong>en</strong>cia <strong>de</strong> nuevas hojas <strong>en</strong> los microbulbillos <strong>en</strong> ambos ambi<strong>en</strong>tes <strong>de</strong>aclimatación pres<strong>en</strong>tó difer<strong>en</strong>cias significativas, observándose los mayores Valores <strong>en</strong> lacámara <strong>de</strong> aclimatación 2, don<strong>de</strong> las condiciones ambi<strong>en</strong>tales son más fluctuantes.Transcurridos 3 meses luego <strong>de</strong> la formación <strong>de</strong> las hojas se obtuvieron resultadossignificativos, tanto para las variables peso <strong>de</strong> planta y diámetro <strong>de</strong> los bulbos, aportadas porlos bulbillos <strong>de</strong> mayor calibre (rango 2 y 3) y por los bulbillos prov<strong>en</strong>i<strong>en</strong>tes <strong>de</strong> la aclimataciónrealizada <strong>en</strong> la cámara Nº 2.Cuadro 1. Comportami<strong>en</strong>to <strong>de</strong> bulbillos <strong>de</strong> R. montana <strong>en</strong> fase <strong>de</strong> aclimataciónTratami<strong>en</strong>toEmerg<strong>en</strong>ciafoliar (%)Peso planta (g)Diámetro <strong>de</strong>bulbos (cm)Tipo <strong>de</strong> aclimataciónCámara 1 72,0 b 0,6 b 0,46 aCámara 2 89,0 a 1,1 a 0,56 aSignificancia * * n.sCalibre <strong>de</strong> microbulbillos (cm)Rango 1: 0,2-0,4 69,0 b 0,5 c 0,37 bRango 2: 0,5-0,6 84,0 a 0,8 b 0,52 aRango 3: 0,7-1,2 88,0 a 1,2 a 0,64 aSignificancia * *Los resultados permit<strong>en</strong> concluir que:*Informe Técnico y <strong>de</strong> Gestión Final 46
Proyecto BID-PI-C-2001-1-A-071“<strong>Aplicaciones</strong> biotecnológicas <strong>en</strong> <strong>el</strong> mejorami<strong>en</strong>to g<strong>en</strong>ético <strong>de</strong> especies <strong>de</strong> Rhodophialachil<strong>en</strong>asLas condiciones ambi<strong>en</strong>tales fluctuantes permit<strong>en</strong> una mejor emerg<strong>en</strong>cia foliar y mayorespesos <strong>de</strong> planta <strong>de</strong>bidos al aum<strong>en</strong>to <strong>en</strong> los diámetros <strong>de</strong> bulbos.Los rangos <strong>de</strong> calibre <strong>de</strong> los microbulbillos ti<strong>en</strong><strong>en</strong> un efecto significativo sobre los parámetrosvegetativos <strong>de</strong>terminados.REFERENCIASJara, G., Seemann, P., Muñoz, M., Rieg<strong>el</strong>, R., Schiapacasse, F., Peñailillo, P. y Vico, V. 2004.Investigaciones pr<strong>el</strong>iminares realizadas <strong>en</strong> torno al establecimi<strong>en</strong>to in vitro <strong>de</strong> especieschil<strong>en</strong>as <strong>de</strong> Rhodophiala. In XIV Congreso Ci<strong>en</strong>tífico. Instituto Nacional <strong>de</strong> Ci<strong>en</strong>ciasAgrarias. San José <strong>de</strong> Las Lajas, Cuba. 217 p.Muñoz, M. 2006. Estudio <strong>de</strong> sistemas <strong>de</strong> Cultivo in vitro, aclimatación <strong>de</strong> plántulas ycrecimi<strong>en</strong>to <strong>de</strong> bulbos <strong>en</strong> Rhodophiala Presl. (Amaryllidaceae). Tesis pres<strong>en</strong>tada comoparte <strong>de</strong> los requisitos para la obt<strong>en</strong>ción d<strong>el</strong> grado <strong>de</strong> Magíster <strong>en</strong> Ci<strong>en</strong>cias Vegetales.107 pp.Seemann, P., Schiappacasse, F., Rieg<strong>el</strong>, R., Peñailillo, P., Muñoz. M., Jara, G., Vico, V. YBasoalto, A., 2006. <strong>Aplicaciones</strong> biotecnológicas <strong>en</strong> <strong>el</strong> mejorami<strong>en</strong>to g<strong>en</strong>ético <strong>de</strong>especies <strong>de</strong> Rhodophiala chil<strong>en</strong>as. 11º Informe <strong>de</strong> Avance Técnico y <strong>de</strong> GestiónProyecto BID-PI-C-2001-1-A-071 (ex BIOT-01-A-071). Valdivia. Universidad Austral <strong>de</strong>Chile y Universidad <strong>de</strong> Talca. 55 p.*Con financiami<strong>en</strong>to d<strong>el</strong> proyecto FIA-BID-PI-C-2001-1-A-071.Informe Técnico y <strong>de</strong> Gestión Final 47
Proyecto BID-PI-C-2001-1-A-071“<strong>Aplicaciones</strong> biotecnológicas <strong>en</strong> <strong>el</strong> mejorami<strong>en</strong>to g<strong>en</strong>ético <strong>de</strong> especies <strong>de</strong> Rhodophialachil<strong>en</strong>asAnálisis <strong>de</strong> polimorfismos intra e interespecíficos a niv<strong>el</strong> <strong>de</strong> región ITS, estudios <strong>de</strong>cariotipo y aproximaciones filog<strong>en</strong>éticas <strong>en</strong>tre especies <strong>de</strong> Rhodophiala Presl.Muñoz, M 1 ., Rieg<strong>el</strong>, R 2 ., Seemann, P 2 ., Schiappacasse, F 3 ., Peñailillo, P 3 ., Jara, G 2 ., Basoalto,A 3 .1 Escu<strong>el</strong>a <strong>de</strong> Graduados, Universidad Austral <strong>de</strong> Chile2 Instituto <strong>de</strong> Producción y Sanidad Vegetal, Universidad Austral <strong>de</strong> Chile3 Departam<strong>en</strong>to <strong>de</strong> Horticultura, Universidad <strong>de</strong> TalcaIntroducciónRhodophiala Presl. es un género nativo d<strong>el</strong> Cono Sur Americano. Sus especies han sido<strong>de</strong>scritas <strong>en</strong> Chile, Arg<strong>en</strong>tina y Bolivia (Traub, 1956). Se trata <strong>de</strong> geófitas bulbosaspert<strong>en</strong>eci<strong>en</strong>tes a Amaryllidaceae J. St.-Hill, <strong>de</strong> vistosas flores que han llamado la at<strong>en</strong>ción <strong>de</strong>investigadores <strong>en</strong> floricultura <strong>en</strong> <strong>el</strong> mundo, realizándose iniciativas para su domesticación conmiras a su utilización como Cultivo ornam<strong>en</strong>tal (Morgan, comunicación personal., Muñoz et al,2006, Olate y Bridg<strong>en</strong>, 2005, Seemann et al. 2004, Schiappacasse, 2002).En <strong>el</strong> pasado, ha sido tratado como parte d<strong>el</strong> g<strong>en</strong>ero Hippeastrum, si<strong>en</strong>do la taxonomía y loslímites d<strong>el</strong> género controversiales. Meerow et al., (2000), utilizando datos prov<strong>en</strong>i<strong>en</strong>tes d<strong>el</strong>análisis d<strong>el</strong> espaciador trascrito interno <strong>de</strong> g<strong>en</strong>es ribosomales (ITS) distingue a Rhodophiala <strong>de</strong>Hyppeastrum t<strong>en</strong>i<strong>en</strong>do un orig<strong>en</strong> apar<strong>en</strong>tem<strong>en</strong>te polifilético, aunque sosti<strong>en</strong>e que un muestreomás amplio d<strong>el</strong> género es necesario.Por otra parte, se ha obt<strong>en</strong>ido <strong>de</strong>sc<strong>en</strong>d<strong>en</strong>cia viable <strong>de</strong>s<strong>de</strong> cruzami<strong>en</strong>tos controlados <strong>en</strong>tredistintas especies <strong>de</strong> Rhodophiala, habiéndose reportado también la exist<strong>en</strong>cia <strong>de</strong> f<strong>en</strong>otiposintermedios <strong>en</strong> la naturaleza (Flavia Schiappacasse, Universidad <strong>de</strong> Talca, comunicaciónpersonal).Una <strong>de</strong> las formas <strong>de</strong> obt<strong>en</strong>er evid<strong>en</strong>cia molecular <strong>de</strong> hibridización interespecífica es a travésd<strong>el</strong> estudio <strong>de</strong> la secu<strong>en</strong>ciación d<strong>el</strong> espaciador trascrito interno <strong>de</strong> g<strong>en</strong>es ribosomales (nrITS).Dado su carácter conservado intra especie, <strong>en</strong> los híbridos se espera que la secu<strong>en</strong>cia <strong>de</strong> laregión ITS muestre heterocigocidad <strong>en</strong> las bases <strong>en</strong> las posiciones <strong>en</strong> las cuales los dosespecies par<strong>en</strong>tales pose<strong>en</strong> secu<strong>en</strong>cias difer<strong>en</strong>tes (King et al., 2001 y P<strong>el</strong>legrino et al., 2005).Por otra parte, para taxa r<strong>el</strong>acionados, ITS ha mostrado gran utilidad para g<strong>en</strong>erar filog<strong>en</strong>iasg<strong>en</strong>éticas a niv<strong>el</strong> <strong>de</strong> familia y m<strong>en</strong>ores (Meerow et al., 2000).El sigui<strong>en</strong>te trabajo pret<strong>en</strong><strong>de</strong> aportar información cariológica y molecular <strong>de</strong> estas especies quepueda ser usada para <strong>el</strong> estudio <strong>de</strong> las r<strong>el</strong>aciones filog<strong>en</strong>éticas <strong>en</strong>tre <strong>el</strong>las.A<strong>de</strong>más, se plantea <strong>el</strong> diseño <strong>de</strong> un sistema basado <strong>en</strong> sitios <strong>de</strong> restricción polimórficos a niv<strong>el</strong><strong>de</strong> región ITS para id<strong>en</strong>tificar posibles híbridos exist<strong>en</strong>tes <strong>en</strong> la naturaleza, como producidos através <strong>de</strong> cruzami<strong>en</strong>tos controlados.MetodologíaSe trabajó con 6 especies chil<strong>en</strong>as <strong>de</strong> Rhodophiala. Estas especies fueron colectadas <strong>de</strong>s<strong>de</strong> suambi<strong>en</strong>te natural por Patricio Peñaillillo (Universidad <strong>de</strong> Talca), si<strong>en</strong>do un ejemplar <strong>de</strong> cadaespecie registrado <strong>en</strong> <strong>el</strong> herbario <strong>de</strong> la Universidad <strong>de</strong> Talca. R. montana (Phil.) Traub fuecolectada <strong>en</strong> Laguna d<strong>el</strong> Maule, VII región cordillera, R. spl<strong>en</strong>d<strong>en</strong>s (R<strong>en</strong>gifo) Traub <strong>en</strong> VilchesAlto VII región cordillera, R. bagnoldii (Herb.) Traub <strong>en</strong> Huasco, III región costa, R. ananuca(Phil.) Traub <strong>en</strong> Aguada <strong>de</strong> Tongoy, III región costa, R. rhodolirion (Baker) Traub <strong>en</strong> LosQueñes, VII región Cordillera, R. phyc<strong>el</strong>loi<strong>de</strong>s (Herb.) Hunz <strong>en</strong> Huasco, III región costa.Para las especies m<strong>en</strong>cionadas <strong>de</strong> Rhodophiala, a excepción <strong>de</strong> R. phyc<strong>el</strong>loi<strong>de</strong>s, se realizaronpreparaciones citológicas <strong>de</strong>s<strong>de</strong> puntas <strong>de</strong> raíz según protocolo planteado por Grant et al.,Informe Técnico y <strong>de</strong> Gestión Final 48
Proyecto BID-PI-C-2001-1-A-071“<strong>Aplicaciones</strong> biotecnológicas <strong>en</strong> <strong>el</strong> mejorami<strong>en</strong>to g<strong>en</strong>ético <strong>de</strong> especies <strong>de</strong> Rhodophialachil<strong>en</strong>as(1984) y adaptado por Muñoz et al., (2006) a Rhodophiala. Para los estudios moleculares serealizó la amplificación, previa extracción <strong>de</strong> ADN, d<strong>el</strong> fragm<strong>en</strong>to correspondi<strong>en</strong>te a la regiónITS1/5.8S/ITS2 <strong>en</strong> tres plantas por especie utilizando los cebadores ITS1-Plant–F, 5-CGCGAGAAGTCCACTG-3’ e ITS C26A-R 5’GTTTCTTTTCCTCCGCT-3’ .Los productos fueronvisualizados mediante <strong>el</strong>ectroforesis <strong>en</strong> g<strong>el</strong>es <strong>de</strong> Agarosa 1,5% mediante tinción con bromuro<strong>de</strong> etidio.Los productos amplificados fueron secu<strong>en</strong>ciados por un servidor externo, Macrog<strong>en</strong> Inc.,Corea. Las secu<strong>en</strong>cias fueron alineadas y analizadas utilizando <strong>el</strong> programa ClustalW,http://www.ebi.ac.uk/clustalw., con <strong>el</strong> cual se realizó la construcción <strong>de</strong> un filogramacomparando las secu<strong>en</strong>cias obt<strong>en</strong>idas con algunas reportadas por Merrow et al. (2000).Resultados y DiscusiónLas especies muestran números cromosómicos somáticos mayoritariam<strong>en</strong>te 2n=18, existi<strong>en</strong>docasos <strong>de</strong> 2n=16, Los índices <strong>de</strong> asimetría ti<strong>en</strong>d<strong>en</strong> a acercarse a 0.6 <strong>en</strong> la mayoría <strong>de</strong> lasespecies, a excepción <strong>de</strong> R. rhodolirion que es 0.46. En cuatro especies, los 2 pares <strong>de</strong>cromosomas más pequeños son metacéntricos, los <strong>de</strong> mayor tamaño son submetacéntricos ysubt<strong>el</strong>océntricos, <strong>en</strong> R. rhodolirion los 2 pares más pequeños son subt<strong>el</strong>océntrico ysubmetacéntrico, los <strong>de</strong> mayor tamaño son metacéntricos, submetacéntrico y subt<strong>el</strong>océntrico.Un filograma Resultado <strong>de</strong> la comparación <strong>de</strong> las secu<strong>en</strong>cias ITS <strong>de</strong> las especies estudiadasjunto a secu<strong>en</strong>cias reportadas por Meerow et al., (2000) <strong>de</strong> R. cipoana, Phyc<strong>el</strong>la ignea eHippeastrum brasileum <strong>en</strong>tre otras, nos indica que las especies R. ananuca, R. montana, R.phyc<strong>el</strong>loi<strong>de</strong>s, R. spl<strong>en</strong>d<strong>en</strong>s y R.bagnoldii. constituy<strong>en</strong> un grupo cercanam<strong>en</strong>te r<strong>el</strong>acionado,alejándose <strong>de</strong> R. rhodolirion que es más cercana a P. ignea y separándose <strong>de</strong> R. cipoana quees más cercana a H. brasileum.Sin embargo, a excepción <strong>de</strong> R. rhodolirion, la variabilidad <strong>en</strong>contrada <strong>en</strong>tre las especiesestudiadas fue escasa, incluso la variabilidad <strong>en</strong>contrada <strong>en</strong>tre distintos individuos <strong>de</strong> R.spl<strong>en</strong>d<strong>en</strong>s es mayor a la pres<strong>en</strong>te <strong>en</strong>tre R. bagnoldii, R. phyc<strong>el</strong>loi<strong>de</strong>s y R. ananuca, haci<strong>en</strong>dodifícil la id<strong>en</strong>tificación <strong>de</strong> posibles híbridos interespecíficos a través <strong>de</strong> sitios <strong>de</strong> restricciónpolimórficos que permitan habilitar la técnica ITS-RFLP. Teóricam<strong>en</strong>te, sería factible <strong>de</strong>tectarhíbridos <strong>en</strong>tre R. montana y las especies: R. ananuca, R. phyc<strong>el</strong>loi<strong>de</strong>s y R. bagnoldii. R.rhodolirion constituye una excepción, aunque sería difícil esperar <strong>de</strong>sc<strong>en</strong>d<strong>en</strong>cia viable <strong>de</strong> lacruza <strong>de</strong> esta especie con algún repres<strong>en</strong>tante d<strong>el</strong> resto <strong>de</strong> las especies d<strong>el</strong> género.ConclusionesLa reducida variabilidad <strong>en</strong>contrada <strong>en</strong>tre un grupo <strong>de</strong> especies, <strong>el</strong> que a su vez difierefuertem<strong>en</strong>te <strong>de</strong> especies como R. rhodolirion y R. cipoana, reafirma la necesidad <strong>de</strong> revisar lataxonomía d<strong>el</strong> género. Los resultados <strong>de</strong> los estudios moleculares realizados <strong>en</strong> estaoportunidad concuerdan con lo sugerido por Naranjo y Poggio (2000) y con lo propuesto porRav<strong>en</strong>na (2003), acerca <strong>de</strong> rehabilitar <strong>el</strong> género Rhodolirion, sugiri<strong>en</strong>do que sería másapropiado clasificar como Rhodolirion andinum Phil., propuesto inicialm<strong>en</strong>te (ver sinonimias <strong>en</strong>Traub, 1956), a la actual R. rhodolirion (Baker) Traub., basándose <strong>en</strong> <strong>el</strong> hecho <strong>de</strong> que, a<strong>de</strong>más<strong>de</strong> diferir <strong>en</strong> número y morfología cromosómica d<strong>el</strong> resto <strong>de</strong> las especies <strong>de</strong> Rhodophiala, sedifer<strong>en</strong>cia claram<strong>en</strong>te a niv<strong>el</strong> <strong>de</strong> región ITS.Meerow, A., Guy, C., Qin-Bao, L., Yang, S. 2000. Phylog<strong>en</strong>y of the American Amaryllidaceaebased on nrDNA ITS sequ<strong>en</strong>ces. Systematic Botany 25: 708 – 726Muñoz, M., Rieg<strong>el</strong>, R And Seemann, P. 2006. Use of image citometry for the early scre<strong>en</strong>ing ofinduced autopolyploids. Plant Breeding 125: 414-416.Informe Técnico y <strong>de</strong> Gestión Final 49
Proyecto BID-PI-C-2001-1-A-071“<strong>Aplicaciones</strong> biotecnológicas <strong>en</strong> <strong>el</strong> mejorami<strong>en</strong>to g<strong>en</strong>ético <strong>de</strong> especies <strong>de</strong> Rhodophialachil<strong>en</strong>asTraub, H. 1956. The g<strong>en</strong>era Rhodophiala Presl and Phyc<strong>el</strong>la Lindl.: key to the species andsynonymy. Plant life (Herbertia) 12: 67 – 76. 58º Congreso Agronómico <strong>de</strong> Chile, 8° Congreso <strong>de</strong> la Sociedad Chil<strong>en</strong>a <strong>de</strong>Fruticultura y <strong>el</strong> 4° Congreso <strong>de</strong> la Sociedad Chil<strong>en</strong>a <strong>de</strong> Horticultura. Arica, Chile.11-14 <strong>de</strong> septiembre d<strong>el</strong> 2007.Aclimatación y <strong>de</strong>sarrollo ex vitro <strong>de</strong> plántulas <strong>de</strong> Rhodophiala spp. prov<strong>en</strong>i<strong>en</strong>tes <strong>de</strong>difer<strong>en</strong>tes sistemas <strong>de</strong> cultivo in vitro.Seemann, P., Muñoz, M. y Jara, G.Instituto <strong>de</strong> Producción y Sanidad Vegetal, Universidad Austral <strong>de</strong> Chile, Valdivia.E-mail: pseemann@uach.clLa respuesta <strong>de</strong> las plantas micropropagadas luego <strong>de</strong> su transfer<strong>en</strong>cia a condiciones ex vitro,<strong>en</strong> la gran mayoría <strong>de</strong> los casos inci<strong>de</strong> negativam<strong>en</strong>te <strong>en</strong> su tasa <strong>de</strong> sobreviv<strong>en</strong>cia, <strong>de</strong> tal formaque es necesario <strong>de</strong>terminar las mejores condiciones <strong>de</strong> cultivo para que la transfer<strong>en</strong>cia seaexitosa. Se postula que esta respuesta podría ser <strong>de</strong>p<strong>en</strong>di<strong>en</strong>te d<strong>el</strong> sistema <strong>de</strong> cultivo in vitroempleado <strong>en</strong> la fase <strong>de</strong> micropropagación. Para este efecto, se utilizaron plántulas <strong>de</strong> tresespecies geófitas ornam<strong>en</strong>tales: Rhodophiala ananuca, R. spl<strong>en</strong>d<strong>en</strong>s y R. montana,previam<strong>en</strong>te cultivadas <strong>en</strong> medio MS líquido y sólido, que fueron repicadas a ban<strong>de</strong>jas consustrato ar<strong>en</strong>a:turba (1:1), y mant<strong>en</strong>idas <strong>en</strong> cámara <strong>de</strong> incubación con una temperaturapromedio <strong>de</strong> 22°C y 3000 lux <strong>de</strong> luminancia. Cada 15 días se fertilizó con solución MS diluida al50%. Luego <strong>de</strong> un mes <strong>de</strong> cultivo <strong>en</strong> estas condiciones se evaluaron las variables peso,diámetro, número <strong>de</strong> bulbillos, largo <strong>de</strong> hojas y raíces, sobrevivi<strong>en</strong>cia al trasplante, y laganancia <strong>en</strong> materia fresca. Posteriorm<strong>en</strong>te, las ban<strong>de</strong>jas fueron transferidas a inverna<strong>de</strong>ro, ymant<strong>en</strong>idas bajo condiciones ambi<strong>en</strong>tales naturales durante 6 u 11 semanas, <strong>de</strong>p<strong>en</strong>di<strong>en</strong>do d<strong>el</strong>a especie, realizando una segunda evaluación, previa al transplante <strong>de</strong>finitivo <strong>de</strong> las plantas acont<strong>en</strong>edores plásticos, con sustrato compuesto <strong>de</strong> su<strong>el</strong>o y ar<strong>en</strong>a (2:1), con fertilizacióncompleta NPKMgS (12:15:15:4:3, 0,93 g/L). Los resultados indican que <strong>en</strong> la primera etapa d<strong>el</strong>transplante se <strong>de</strong>terminó una apar<strong>en</strong>te homologación <strong>en</strong> <strong>el</strong> crecimi<strong>en</strong>to <strong>de</strong> las plantas, mi<strong>en</strong>trasque <strong>en</strong> la etapa <strong>de</strong> inverna<strong>de</strong>ro las plantas prov<strong>en</strong>i<strong>en</strong>tes d<strong>el</strong> medio sólido ya comi<strong>en</strong>zan amanifestar una mayor sobreviv<strong>en</strong>cia y crecimi<strong>en</strong>to. La sobreviv<strong>en</strong>cia post transplante ex vitro<strong>de</strong> las plantas prov<strong>en</strong>i<strong>en</strong>tes <strong>de</strong> medio sólido alcanzó <strong>en</strong>tre 87 y 94%, mi<strong>en</strong>tras que <strong>en</strong> lasprov<strong>en</strong>i<strong>en</strong>tes <strong>de</strong> medio líquido sobrevivieron <strong>en</strong>tre 38 y 69%,según la especie, reflejando lainflu<strong>en</strong>cia d<strong>el</strong> estado d<strong>el</strong> medio <strong>de</strong> Cultivo <strong>en</strong> la posterior aclimatación <strong>de</strong> plántulas <strong>de</strong>Rhodophiala. De la misma forma, las plantas prov<strong>en</strong>i<strong>en</strong>tes <strong>de</strong> medio sólido, se v<strong>en</strong> favorecidas<strong>en</strong> la mayoría <strong>de</strong> los parámetros <strong>de</strong> <strong>de</strong>sarrollo.Financiado mediante proyecto FIA -BIOT-01-A-71Informe Técnico y <strong>de</strong> Gestión Final 50
Proyecto BID-PI-C-2001-1-A-071“<strong>Aplicaciones</strong> biotecnológicas <strong>en</strong> <strong>el</strong> mejorami<strong>en</strong>to g<strong>en</strong>ético <strong>de</strong> especies <strong>de</strong> Rhodophialachil<strong>en</strong>as8. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES No se logró optimizar la multiplicación ac<strong>el</strong>erada <strong>de</strong> especies e híbridos <strong>de</strong>Rhodophiala, mediante <strong>el</strong> Sistema <strong>de</strong> Inmersión Temporal propuesto. Se aplicaron difer<strong>en</strong>tes protocolos para la multiplicación in vitro <strong>en</strong> g<strong>en</strong>otiposs<strong>el</strong>eccionados <strong>en</strong> base a su capacidad <strong>de</strong> multiplicación. Uno <strong>de</strong> los g<strong>en</strong>otipos s<strong>el</strong>eccionados <strong>de</strong> R. spl<strong>en</strong>d<strong>en</strong>s (Nº 363), con un coefici<strong>en</strong>te <strong>de</strong>multiplicación alto (x 4), ha <strong>de</strong>mostrado a<strong>de</strong>más una bu<strong>en</strong>a adaptación a condiciones exvitro, constituyéndose <strong>en</strong> un g<strong>en</strong>otipo con características superiores al resto <strong>en</strong> cuanto asu facilidad <strong>de</strong> clonación través <strong>de</strong> micropropagación y cultivar posteriorm<strong>en</strong>te <strong>en</strong>inverna<strong>de</strong>ro. Alre<strong>de</strong>dor d<strong>el</strong> 10% <strong>de</strong> los individuos <strong>de</strong> una población g<strong>en</strong>éticam<strong>en</strong>te heterogénea <strong>de</strong>plantas originadas <strong>de</strong>s<strong>de</strong> cultivo in vitro pue<strong>de</strong> alcanzar la floración a los 30 meses <strong>de</strong>cultivo <strong>en</strong> inverna<strong>de</strong>ro sin calefacción. Las plantas que alcanzan la floración a los 30 meses han <strong>de</strong>sarrollado mayor biomasaque <strong>el</strong> promedio y todas correspond<strong>en</strong> a plantas con bulbos <strong>de</strong> peso superior,mostrando la importancia d<strong>el</strong> alcance <strong>de</strong> biomasa para llegar a la etapa reproductiva. Las plantas que florecieron <strong>de</strong>stacaron d<strong>el</strong> resto <strong>en</strong> cuanto al aum<strong>en</strong>to <strong>de</strong> biomasa. Estaes una característica que <strong>de</strong>p<strong>en</strong><strong>de</strong> <strong>de</strong> factores ambi<strong>en</strong>tales y g<strong>en</strong>éticos, por lo que seríarecom<strong>en</strong>dable int<strong>en</strong>tar clonar estas plantas para separar los efectos g<strong>en</strong>éticos <strong>de</strong> losambi<strong>en</strong>tales. Exist<strong>en</strong> secu<strong>en</strong>cias disponibles <strong>de</strong> la región d<strong>el</strong> espaciador transcrito interno <strong>de</strong>Rhodophiala <strong>en</strong>tre los g<strong>en</strong>es ribosomales que codifican las unida<strong>de</strong>s <strong>de</strong> RNA ribosomal18S, 5,8S y 26S. Se espera que a través d<strong>el</strong> análisis <strong>de</strong> estas secu<strong>en</strong>cias se obt<strong>en</strong>ganpatrones g<strong>en</strong>éticos que permitan distinguir especies e híbridos <strong>de</strong> Rhodophiala. A travésd<strong>el</strong> estudio <strong>de</strong> las secu<strong>en</strong>cias <strong>de</strong> la región ITS, y <strong>de</strong> la id<strong>en</strong>tificación <strong>de</strong> la pres<strong>en</strong>cia oaus<strong>en</strong>cia <strong>de</strong> mutaciones especie-específicas, es posible distinguir especies e híbridos,sin embargo, al <strong>de</strong>sarrollar partidores especie específicos o la <strong>de</strong>tección <strong>de</strong> perfiles <strong>de</strong>restricción <strong>en</strong>zimático típicos <strong>de</strong> las especies, se podría implem<strong>en</strong>tar un sistema <strong>de</strong>id<strong>en</strong>tificación <strong>de</strong> especies e híbridos sin necesidad <strong>de</strong> secu<strong>en</strong>ciar (proceso más caro)cada individuo estudiado e incluso se podrían id<strong>en</strong>tificar posibles híbridos exist<strong>en</strong>tes <strong>en</strong>la naturaleza.Informe Técnico y <strong>de</strong> Gestión Final 51
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Proyecto BID-PI-C-2001-1-A-071“<strong>Aplicaciones</strong> biotecnológicas <strong>en</strong> <strong>el</strong> mejorami<strong>en</strong>to g<strong>en</strong>ético <strong>de</strong> especies <strong>de</strong> Rhodophialachil<strong>en</strong>as2. Cumplimi<strong>en</strong>to <strong>de</strong> los objetivos2.1. Id<strong>en</strong>tificar y caracterizar 8 especies <strong>de</strong> Rhodophiala2.2. Determinar la temperatura óptima para lograr la <strong>en</strong>gorda rápida <strong>de</strong> los bulbos,incluy<strong>en</strong>do protocolo <strong>de</strong> fertilización.Se cumplió parcialm<strong>en</strong>te ya que se realizó un estudio que incluyó 4 especies utilizandoplántulas prov<strong>en</strong>i<strong>en</strong>tes <strong>de</strong> semilla, <strong>en</strong> este caso <strong>el</strong> experim<strong>en</strong>to no se pudo evaluar bi<strong>en</strong>, ya quehubo mucha muerte <strong>de</strong> plantas.2.3. Realizar estudios pr<strong>el</strong>iminares sobre control <strong>de</strong> floración y poscosecha <strong>de</strong> lasespecies.Se cumplió parcialm<strong>en</strong>te, ya que sólo se pudo realizar un estudio sobre la especie Rhodophialasp. (Alto Pangue), <strong>en</strong> este caso como <strong>en</strong> todos la limitante fue <strong>el</strong> número <strong>de</strong> bulbos. En <strong>el</strong> caso<strong>de</strong> la poscosecha se realizó un <strong>en</strong>sayo con flores <strong>de</strong> R. montana.2.4. Cultivo <strong>de</strong> semillas híbridasSe realizó <strong>el</strong> cultivo <strong>de</strong> semillas prov<strong>en</strong>i<strong>en</strong>tes <strong>de</strong> cruzami<strong>en</strong>tos, actualm<strong>en</strong>te se cu<strong>en</strong>ta con untotal <strong>de</strong> 327 bulbos <strong>de</strong> los difer<strong>en</strong>tes cruzami<strong>en</strong>tos.2.5. Formar una colección <strong>de</strong> especies <strong>de</strong> Rhodophiala a partir <strong>de</strong> bulbosAl finalizar <strong>el</strong> proyecto se cu<strong>en</strong>ta con una colección <strong>de</strong> bulbos <strong>de</strong> difer<strong>en</strong>tes especies <strong>de</strong>Rhodophiala plantados al aire libre <strong>en</strong> la Estación Experim<strong>en</strong>tal Panguilemo.2.6. Evaluación <strong>de</strong> plantas diploi<strong>de</strong>s y poliploi<strong>de</strong>sEste objetivo se cumplió parcialm<strong>en</strong>te. Al final d<strong>el</strong> proyecto es posible contar con gráficos quemuestran la evolución d<strong>el</strong> número <strong>de</strong> hojas <strong>de</strong> las plantas poliploi<strong>de</strong>s cultivadas <strong>en</strong> varios años.Sin embargo, no fue posible evaluar la floración <strong>de</strong> los poliploi<strong>de</strong>s porque no ocurrió.Informe Técnico y <strong>de</strong> Gestión Final 53
Proyecto BID-PI-C-2001-1-A-071“<strong>Aplicaciones</strong> biotecnológicas <strong>en</strong> <strong>el</strong> mejorami<strong>en</strong>to g<strong>en</strong>ético <strong>de</strong> especies <strong>de</strong> Rhodophialachil<strong>en</strong>as3. Aspectos metodológicos.3.1 Descripción <strong>de</strong> la metodología efectivam<strong>en</strong>te utilizada según objetivo.3.1.1 Material Vegetal.Para la realización <strong>de</strong> los estudios y experim<strong>en</strong>tos se utilizaron bulbos <strong>de</strong> R. montana, R.bagnoldii, R. spl<strong>en</strong>d<strong>en</strong>s, R. phyc<strong>el</strong>loi<strong>de</strong>s y R. ananuca, obt<strong>en</strong>idos a partir <strong>de</strong> almácigos.También se utilizaron bulbos <strong>de</strong> Rhodophiala spp. recolectados <strong>en</strong> terr<strong>en</strong>o (Alto Pangue yPutú).3.1.2 Determinar la temperatura óptima para lograr la <strong>en</strong>gorda rápida <strong>de</strong> los bulbos,incluy<strong>en</strong>do protocolo <strong>de</strong> fertilización.3.1.2.1 Estudios <strong>de</strong> crecimi<strong>en</strong>to bajo temperatura controlada <strong>de</strong> sustrato y ambi<strong>en</strong>te.El 18 <strong>de</strong> junio <strong>de</strong> 2007 se com<strong>en</strong>zó un experim<strong>en</strong>to para estudiar <strong>el</strong> crecimi<strong>en</strong>to <strong>de</strong> bulbillos <strong>de</strong>4 especies, bajo condiciones <strong>de</strong> calefacción basal d<strong>el</strong> sustrato a niv<strong>el</strong> <strong>de</strong> las raíces y a niv<strong>el</strong> d<strong>el</strong>as hojas, para medir su efecto principalm<strong>en</strong>te sobre <strong>el</strong> crecimi<strong>en</strong>to <strong>de</strong> los bulbos, medido comoaum<strong>en</strong>to <strong>de</strong> calibre al final <strong>de</strong> la temporada.Materiales.Para lograr las condiciones <strong>de</strong> calefacción d<strong>el</strong> sustrato, se utilizó una cama cali<strong>en</strong>te, ubicada <strong>en</strong><strong>el</strong> inverna<strong>de</strong>ro <strong>de</strong> la E/E Panguilemo, cuyo sustrato a niv<strong>el</strong> <strong>de</strong> raíces se ajustó a 20ºC. Latemperatura d<strong>el</strong> aire se reguló usando un turbov<strong>en</strong>tilador <strong>de</strong> 1800W con termostato y cubri<strong>en</strong>dola cama cali<strong>en</strong>te con polietil<strong>en</strong>o transpar<strong>en</strong>te <strong>de</strong> 0,1 mm <strong>de</strong> grosor sin aditivos, <strong>el</strong> cual se instaló<strong>el</strong> mismo día d<strong>el</strong> inicio d<strong>el</strong> experim<strong>en</strong>to. Se instalaron dos registradores <strong>de</strong> temperatura (Datalogger).Para este <strong>en</strong>sayo, se utilizaron bulbillos prov<strong>en</strong>i<strong>en</strong>tes <strong>de</strong> almácigos realizados <strong>de</strong>s<strong>de</strong> <strong>el</strong> 21 <strong>de</strong>marzo <strong>de</strong> 2007, los cuales se transplantaron a vasos plásticos transpar<strong>en</strong>tes (<strong>de</strong> 12 cm <strong>de</strong> altopor 7 <strong>de</strong> ancho <strong>en</strong> la parte superior) cuando t<strong>en</strong>ían una hoja. Como sustrato se utilizó 1 parte<strong>de</strong> tierra ½ parte <strong>de</strong> turba y ¼ <strong>de</strong> perlas <strong>de</strong> poliestir<strong>en</strong>o. Después d<strong>el</strong> transplante se realizaron2 riegos semanales con agua sola.Metodología.Para obt<strong>en</strong>er las 4 condiciones <strong>de</strong> crecimi<strong>en</strong>to <strong>de</strong> los bulbillos se instalaron los cablescalefactores <strong>en</strong> la mitad a lo largo <strong>de</strong> la superficie <strong>de</strong> la cama cali<strong>en</strong>te, <strong>en</strong> forma transversal seinstaló la estructura para formar un tún<strong>el</strong>. De esta forma se originaron 4 sectores, uno concalefacción d<strong>el</strong> aire y d<strong>el</strong> sustrato, uno sin calefacción, uno con calefacción sólo d<strong>el</strong> aire y otrocon calefacción sólo d<strong>el</strong> sustrato. Los bulbillos se distribuyeron al azar d<strong>en</strong>tro <strong>de</strong> cada sector,quedando <strong>en</strong> cada uno 20 bulbillos <strong>de</strong> cada especie (4 repeticiones <strong>de</strong> 5 bulbillos).El experim<strong>en</strong>to fue conducido con un diseño completam<strong>en</strong>te al azar <strong>en</strong> arreglo factorial 2 x 2dado por 2 temperaturas <strong>en</strong> la parte aérea y 2 temperaturas <strong>en</strong> <strong>el</strong> sustrato.Los tratami<strong>en</strong>tos fueron los sigui<strong>en</strong>tes:Informe Técnico y <strong>de</strong> Gestión Final 54
Proyecto BID-PI-C-2001-1-A-071“<strong>Aplicaciones</strong> biotecnológicas <strong>en</strong> <strong>el</strong> mejorami<strong>en</strong>to g<strong>en</strong>ético <strong>de</strong> especies <strong>de</strong> Rhodophialachil<strong>en</strong>asT1T2T3T0con calefacción <strong>en</strong> sustrato y con calefacción <strong>en</strong> parte aéreacon calefacción <strong>en</strong> sustrato y sin calefacción <strong>en</strong> parte aéreasin calefacción <strong>en</strong> sustrato y con calefacción <strong>en</strong> parte aéreasin calefacción <strong>en</strong> sustrato y sin calefacción <strong>en</strong> parte aérea3.1.3 Realizar estudios pr<strong>el</strong>iminares sobre control <strong>de</strong> floración y poscosecha <strong>de</strong> lasespecies..3.1.3.1 Estudios <strong>de</strong> crecimi<strong>en</strong>to y floración.Se realizó un experim<strong>en</strong>to para <strong>de</strong>terminar <strong>el</strong> efecto <strong>de</strong> 3 fechas <strong>de</strong> plantación y 3 temperaturas<strong>de</strong> <strong>de</strong>sarrollo d<strong>el</strong> Cultivo sobre la fecha <strong>de</strong> emerg<strong>en</strong>cia, floración y aum<strong>en</strong>to d<strong>el</strong> diámetro d<strong>el</strong>bulbo <strong>en</strong> las especies Rhodophiala aff. chil<strong>en</strong>sis, R. montana y R. spl<strong>en</strong>d<strong>en</strong>s.Materiales.Para obt<strong>en</strong>er las tres temperaturas se confeccionó d<strong>en</strong>tro d<strong>el</strong> inverna<strong>de</strong>ro <strong>de</strong> la E/EPanguilemo un Tún<strong>el</strong> <strong>de</strong> Gradi<strong>en</strong>te Térmico <strong>de</strong> 12 m <strong>de</strong> largo, 1 m <strong>de</strong> ancho y 0,6 m <strong>de</strong> alto(Figura 3.1), <strong>el</strong> cual consta <strong>de</strong> una estructura rígida semicircular formada por arcos <strong>de</strong> acerofijados al su<strong>el</strong>o cada 80 cm y cubierto <strong>de</strong> polietil<strong>en</strong>o transpar<strong>en</strong>te <strong>de</strong> 0.1 mm sin aditivos. Enuno <strong>de</strong> los extremos se colocó una fu<strong>en</strong>te <strong>de</strong> calor, que correspon<strong>de</strong> a una estufa <strong>el</strong>éctrica(turbov<strong>en</strong>tilador) <strong>de</strong> 1800W con termostato, <strong>el</strong> otro extremo se <strong>de</strong>jó abierto. El su<strong>el</strong>o se cubriócon una capa <strong>de</strong> planchas <strong>de</strong> poliestir<strong>en</strong>o expandido <strong>de</strong> 15 mm <strong>de</strong> espesor. D<strong>en</strong>tro d<strong>el</strong> tún<strong>el</strong> seinstalaron 3 registradores <strong>de</strong> temperatura (Data logger) a 1, 4 y 8 m <strong>de</strong>s<strong>de</strong> <strong>el</strong> inicio (estufa), con<strong>el</strong> fin <strong>de</strong> registrar las temperaturas diarias, para posteriorm<strong>en</strong>te graficar <strong>el</strong> comportami<strong>en</strong>to d<strong>el</strong>as mismas.Para este <strong>en</strong>sayo, se utilizaron bulbos florales <strong>de</strong> la especie Rhodophiala aff. chil<strong>en</strong>sisrecolectados <strong>en</strong> abril <strong>de</strong> 2006 <strong>en</strong> la localidad <strong>de</strong> Putú, bulbillos <strong>de</strong> R. spl<strong>en</strong>d<strong>en</strong>s (clones d<strong>el</strong>g<strong>en</strong>otipo S363), prov<strong>en</strong>i<strong>en</strong>tes <strong>de</strong> cultivo in vitro <strong>de</strong> la U. Austral y bulbos <strong>de</strong> R. montana concalibre floral cultivado <strong>en</strong> <strong>el</strong> inverna<strong>de</strong>ro <strong>de</strong> la E/E Panguilemo <strong>de</strong> la Universidad <strong>de</strong> Talca.Los bulbos fueron colocados <strong>en</strong> bolsas plásticas negras <strong>de</strong> 15x20 cm con un sustratocompuesto por turba y perlas <strong>de</strong> poliestir<strong>en</strong>o expandido <strong>en</strong> proporción 2:1 <strong>el</strong> cual fuepreviam<strong>en</strong>te hume<strong>de</strong>cido. Previo a la plantación, <strong>de</strong>spués <strong>de</strong> <strong>el</strong>iminar las hojas, los bulbosfueron sumergidos durante 10 min <strong>en</strong> una solución <strong>de</strong> Captan al 0,1% p/v.Informe Técnico y <strong>de</strong> Gestión Final 55
Proyecto BID-PI-C-2001-1-A-071“<strong>Aplicaciones</strong> biotecnológicas <strong>en</strong> <strong>el</strong> mejorami<strong>en</strong>to g<strong>en</strong>ético <strong>de</strong> especies <strong>de</strong> Rhodophialachil<strong>en</strong>asFigura 3.1Tún<strong>el</strong> <strong>de</strong> gradi<strong>en</strong>te térmico, <strong>en</strong> <strong>el</strong>inverna<strong>de</strong>ro <strong>de</strong> la E/E PanguilemoMetodología.Los bulbos recolectados fueron calibrados, pesados y se registró <strong>el</strong> número <strong>de</strong> hojas, lapres<strong>en</strong>cia <strong>de</strong> raíces y <strong>de</strong> tallos florales <strong>en</strong> cada uno. Posteriorm<strong>en</strong>te se les <strong>el</strong>iminaron las hojasa todos y se repartieron <strong>en</strong> 3 grupos (para realizar plantaciones <strong>en</strong> tres fechas distintas)t<strong>en</strong>i<strong>en</strong>do la precaución <strong>de</strong> <strong>de</strong>jar bulbos <strong>de</strong> todos los calibres <strong>en</strong> cada uno. Posteriorm<strong>en</strong>te, cadagrupo se subdividió aleatoriam<strong>en</strong>te <strong>en</strong> 3 subgrupos (1 para cada niv<strong>el</strong> <strong>de</strong> temperatura d<strong>en</strong>trod<strong>el</strong> tún<strong>el</strong>). Estos bulbos fueron mant<strong>en</strong>idos <strong>en</strong> bolsas <strong>de</strong> polietil<strong>en</strong>o con aserrín húmedo atemperatura ambi<strong>en</strong>te, hasta <strong>el</strong> mom<strong>en</strong>to <strong>de</strong> iniciado <strong>el</strong> experim<strong>en</strong>to.El <strong>en</strong>sayo se estableció <strong>el</strong> día 25 <strong>de</strong> mayo <strong>de</strong> 2006 con la plantación d<strong>el</strong> primer grupo <strong>de</strong>bulbos. Un tercio <strong>de</strong> <strong>el</strong>los se colocó <strong>en</strong> la zona cercana al inicio d<strong>el</strong> tún<strong>el</strong> (subgrupo1), otrotercio <strong>en</strong> <strong>el</strong> medio (subgrupo 2) y <strong>el</strong> tercio restante (subgrupo 3) al final. Los bulbos <strong>de</strong> los otrosdos grupos se mantuvieron refrigerados hasta <strong>el</strong> mom<strong>en</strong>to <strong>de</strong> la plantación.La segunda plantación se realizó <strong>el</strong> día 24 <strong>de</strong> julio y la tercera se realizó <strong>el</strong> día 25 <strong>de</strong> agosto. Elexperim<strong>en</strong>to fue conducido con un diseño completam<strong>en</strong>te al azar con <strong>el</strong> factor fecha <strong>de</strong>plantación y bajo 3 temperaturas distintas. A<strong>de</strong>más contó con 4 repeticiones por tratami<strong>en</strong>tos<strong>de</strong> 5 bulbos cada repetición. Los tratami<strong>en</strong>tos fueron los sigui<strong>en</strong>tes:T1T2T3T4T5T6T7T8T9Primera plantación, inicio d<strong>el</strong> tún<strong>el</strong>Primera plantación, medio d<strong>el</strong> tún<strong>el</strong>Primera plantación, final d<strong>el</strong> tún<strong>el</strong>Segunda plantación, inicio d<strong>el</strong> tún<strong>el</strong>Segunda plantación, medio d<strong>el</strong> tún<strong>el</strong>Segunda plantación, final d<strong>el</strong> tún<strong>el</strong>Tercera plantación, inicio d<strong>el</strong> tún<strong>el</strong>Tercera plantación, medio d<strong>el</strong> tún<strong>el</strong>Tercera plantación, final d<strong>el</strong> tún<strong>el</strong>Los bulbos florales <strong>de</strong> R. montana que se <strong>en</strong>contraban <strong>en</strong> cont<strong>en</strong>edores plásticos <strong>en</strong> <strong>el</strong>inverna<strong>de</strong>ro <strong>de</strong> la E/E, también fueron separados <strong>en</strong> tres grupos y se estableció un grupo alcomi<strong>en</strong>zo d<strong>el</strong> tún<strong>el</strong>, un grupo <strong>en</strong> medio d<strong>el</strong> tún<strong>el</strong> y otro grupo al final, esto se realizó <strong>en</strong> unasola fecha, ya que <strong>el</strong> número <strong>de</strong> bulbos florales es bajo.Informe Técnico y <strong>de</strong> Gestión Final 56
Proyecto BID-PI-C-2001-1-A-071“<strong>Aplicaciones</strong> biotecnológicas <strong>en</strong> <strong>el</strong> mejorami<strong>en</strong>to g<strong>en</strong>ético <strong>de</strong> especies <strong>de</strong> Rhodophialachil<strong>en</strong>asLos bulbillos <strong>de</strong> R. spl<strong>en</strong>d<strong>en</strong>s <strong>de</strong> cultivo in vitro también se separaron <strong>en</strong> tres, estableciéndosecada uno <strong>en</strong> un sector d<strong>el</strong> tún<strong>el</strong>, <strong>en</strong> una sola fecha, la misma que para R. montana, <strong>el</strong> 18 <strong>de</strong>mayo <strong>de</strong> 2006.3.1.3.2 Estudios <strong>de</strong> f<strong>en</strong>ología.Se com<strong>en</strong>zó un experim<strong>en</strong>to <strong>de</strong> almac<strong>en</strong>aje a difer<strong>en</strong>tes temperaturas <strong>de</strong> una especie <strong>de</strong>amarilidácea, la cual fue recolectada <strong>en</strong> un predio particular d<strong>el</strong> sector Alto Pangue, <strong>en</strong> la riberanorte d<strong>el</strong> Río Claro, <strong>en</strong> receso vegetativo. Después <strong>de</strong> su floración se <strong>de</strong>terminó que era unaespecie <strong>de</strong> Rhodophiala.Para <strong>el</strong> experim<strong>en</strong>to se utilizaron bulbos con calibre floral, consi<strong>de</strong>rándose 6/7 como <strong>el</strong> mínimo,ya que a partir <strong>de</strong> la disección realizada a un bulbo calibre 5/6 no se <strong>en</strong>contraron estructurasflorales visibles y al disectar uno <strong>de</strong> calibre 6/7 se observaron 3 órganos difer<strong>en</strong>ciados <strong>en</strong> <strong>el</strong>c<strong>en</strong>tro d<strong>el</strong> bulbo. Por su pequeño tamaño no se distinguieron estructuras florales d<strong>en</strong>tro <strong>de</strong>cada uno, pero como eran 3 se asumió que uno era <strong>el</strong> meristema vegetativo y los otros 2 eranprimordios florales.A<strong>de</strong>más <strong>de</strong> recolectar bulbos se recogió tierra d<strong>el</strong> mismo sector para ser utilizada <strong>en</strong> laposterior plantación. Se <strong>en</strong>vió una muestra para análisis <strong>de</strong> su<strong>el</strong>o.La plantación se realizó <strong>en</strong> bot<strong>el</strong>las plásticas <strong>de</strong>sechables <strong>de</strong> 600 cc, las cuales se utilizaron <strong>en</strong>forma invertida, <strong>el</strong>iminándose la base <strong>de</strong> las mismas y realizando perforaciones <strong>en</strong> la zona másangosta y <strong>en</strong> la tapa para facilitar <strong>el</strong> escurrimi<strong>en</strong>to d<strong>el</strong> agua <strong>de</strong> riego y permitir una a<strong>de</strong>cuadaaireación d<strong>el</strong> sustrato.Figura 3.1 Bulbos recolectadosFigura 3.2 Bot<strong>el</strong>las <strong>de</strong>sechables <strong>en</strong>proceso <strong>de</strong> ll<strong>en</strong>arse consustrato para proce<strong>de</strong>r a laplantaciónEl día 9 <strong>de</strong> <strong>en</strong>ero <strong>de</strong> 2007 se estableció un experim<strong>en</strong>to para estudiar la respuesta <strong>de</strong> losbulbos a 6 condiciones <strong>de</strong> almac<strong>en</strong>aje. Los tratami<strong>en</strong>tos fueron los sigui<strong>en</strong>tes:T0 Control o Testigo, plantación <strong>el</strong> día <strong>de</strong> establecimi<strong>en</strong>to d<strong>el</strong> experim<strong>en</strong>toT1 1 mes <strong>de</strong> almac<strong>en</strong>aje a 5ºCInforme Técnico y <strong>de</strong> Gestión Final 57
Proyecto BID-PI-C-2001-1-A-071“<strong>Aplicaciones</strong> biotecnológicas <strong>en</strong> <strong>el</strong> mejorami<strong>en</strong>to g<strong>en</strong>ético <strong>de</strong> especies <strong>de</strong> Rhodophialachil<strong>en</strong>asT2 2 meses <strong>de</strong> almac<strong>en</strong>aje a 5ºCT3 3 meses <strong>de</strong> almac<strong>en</strong>aje a 5ºCT4 1 mes <strong>de</strong> almac<strong>en</strong>aje a 18-20ºCT5 2 meses <strong>de</strong> almac<strong>en</strong>aje a 18-20ºCT6 3 meses <strong>de</strong> almac<strong>en</strong>aje a 18-20ºCSe utilizaron 6 bulbos por tratami<strong>en</strong>toEl almac<strong>en</strong>aje a 5ºC se realizó <strong>en</strong> <strong>el</strong> refrigerador d<strong>el</strong> Laboratorio <strong>de</strong> Hortalizas. Los bulbosalmac<strong>en</strong>ados a 18-20ºC se mantuvieron <strong>en</strong> la bo<strong>de</strong>ga d<strong>el</strong> mismo laboratorio.Se evaluó fecha <strong>de</strong> emerg<strong>en</strong>cia, número <strong>de</strong> hojas m<strong>en</strong>sualm<strong>en</strong>te y número total <strong>de</strong> hojas,fecha <strong>de</strong> floración, porc<strong>en</strong>taje <strong>de</strong> floración, características florales.3.1.3.3 Estudios <strong>de</strong> poscosecha.Se realizaron dos experim<strong>en</strong>tos <strong>de</strong> poscosecha <strong>en</strong> la especie R. montana. Uno <strong>de</strong> pulsado <strong>en</strong>soluciones con difer<strong>en</strong>tes conc<strong>en</strong>traciones <strong>de</strong> sacarosa y uno <strong>de</strong> mant<strong>en</strong>ción <strong>en</strong> soluciones condifer<strong>en</strong>tes conc<strong>en</strong>traciones <strong>de</strong> sacarosa.Experim<strong>en</strong>to <strong>de</strong> pulsado.Las flores recién cosechadas, se colocaron <strong>en</strong> tubos, los cuales cont<strong>en</strong>ían soluciones condifer<strong>en</strong>tes conc<strong>en</strong>traciones <strong>de</strong> sacarosa y se mantuvieron <strong>en</strong> la nevera hasta su llegada allaboratorio. Una vez <strong>en</strong> éste, se sacaron los tubos con flores <strong>de</strong> la nevera y se <strong>de</strong>jaron atemperatura ambi<strong>en</strong>te durante toda la noche. Al día sigui<strong>en</strong>te las flores se sacaron <strong>de</strong> lasolución <strong>de</strong> pulsado y se colocaron <strong>en</strong> una caja d<strong>en</strong>tro d<strong>el</strong> refrigerador durante un día.Trascurrido este tiempo se sacaron d<strong>el</strong> refrigerador y se colocaron <strong>en</strong> tubos <strong>de</strong> <strong>en</strong>sayo conagua <strong>de</strong>stilada. Las soluciones se prepararon utilizando agua <strong>de</strong>stilada y sacarosa, <strong>el</strong> pH seajustó con ac. cítrico. Los tratami<strong>en</strong>tos utilizados fueron los sigui<strong>en</strong>tes:T0 agua <strong>de</strong>stilada, pH 3,5-4T1 6% sacarosa, pH 3,5-4T2 12% sacarosa, pH 3,5-4T3 18% sacarosa, pH 3,5-4T4 24% sacarosa, pH 3,5-4Se utilizaron 4 flores por tratami<strong>en</strong>to.Experim<strong>en</strong>to <strong>de</strong> soluciones <strong>de</strong> mant<strong>en</strong>ción.Las flores recién cosechadas fueron colocadas <strong>en</strong> tubos con agua <strong>de</strong>stilada pura y colocadas<strong>en</strong> la nevera. Al llegar al laboratorio se sacaron <strong>de</strong> los tubos con agua y se colocaron <strong>en</strong> unacaja <strong>de</strong> cartón <strong>en</strong> la parte baja d<strong>el</strong> refrigerador. Se mantuvieron 2 días <strong>en</strong> estas condiciones.Transcurrido este tiempo se sacaron d<strong>el</strong> refrigerador y se colocaron <strong>en</strong> tubos con soluciones <strong>de</strong>mant<strong>en</strong>ción, las cuales t<strong>en</strong>ían difer<strong>en</strong>tes conc<strong>en</strong>traciones <strong>de</strong> azúcar. Las soluciones seprepararon utilizando agua <strong>de</strong>stilada y sacarosa, <strong>el</strong> pH se ajustó con ac. cítrico. Los tratami<strong>en</strong>toutilizados fueron los sigui<strong>en</strong>tes:T0 Agua <strong>de</strong>stiladaT1 Agua <strong>de</strong>stilada, pH 3,5-4,0T2 5% azúcar, pH 3,5-4,0T3 10% azúcar pH 3,5-4,0T4 15% azúcar pH 3,5-4,0Informe Técnico y <strong>de</strong> Gestión Final 58
Proyecto BID-PI-C-2001-1-A-071“<strong>Aplicaciones</strong> biotecnológicas <strong>en</strong> <strong>el</strong> mejorami<strong>en</strong>to g<strong>en</strong>ético <strong>de</strong> especies <strong>de</strong> Rhodophialachil<strong>en</strong>asSe utilizaron 5 flores por tratami<strong>en</strong>toPara ambos experim<strong>en</strong>tos las flores se mantuvieron <strong>en</strong> una nevera durante todo <strong>el</strong> transporte(<strong>de</strong>s<strong>de</strong> cosecha hasta llegada al laboratorio), registrándose la temperatura interna. Ambosexperim<strong>en</strong>tos se realizaron <strong>en</strong> una salta con iluminación acondicionada especialm<strong>en</strong>te paraesto. En ambos casos se evaluaron: Días a apertura <strong>de</strong> la primera flor Vida útil (50% <strong>de</strong> florecillas s<strong>en</strong>esc<strong>en</strong>tes) Absorción <strong>de</strong> solución Florecillas abortadas por vara.3.1.4 Cultivo <strong>de</strong> híbridos.Todos los bulbos prov<strong>en</strong>i<strong>en</strong>tes <strong>de</strong> cruzami<strong>en</strong>tos se mantuvieron d<strong>en</strong>tro d<strong>el</strong> inverna<strong>de</strong>ro, seregaron con las misma frecu<strong>en</strong>cia que los <strong>de</strong>más, al final d<strong>el</strong> proyecto se separaron acont<strong>en</strong>edores <strong>de</strong> difer<strong>en</strong>tes tamaños separados por <strong>el</strong> cruzami<strong>en</strong>to d<strong>el</strong> híbrido. Los queestaban <strong>en</strong> mayor cantidad se colocaron <strong>en</strong> cont<strong>en</strong>edores más gran<strong>de</strong>s y viceversa, y cadacont<strong>en</strong>edor se id<strong>en</strong>tificó con una placa que indica los padres, <strong>el</strong> año <strong>de</strong> siembra y <strong>el</strong> número <strong>de</strong>bulbos. Se espera que algunos <strong>de</strong> los que ti<strong>en</strong><strong>en</strong> 3 años florezcan durante la temporada 2008-2009.3.1.5 Formar una colección <strong>de</strong> especies <strong>de</strong> Rhodophiala a partir <strong>de</strong> bulbos.Se trasladaron a la Estación Experim<strong>en</strong>tal Panguilemo todos los bulbos y se colocaron <strong>en</strong> <strong>el</strong>su<strong>el</strong>o <strong>en</strong> un lugar cedido por <strong>el</strong> ger<strong>en</strong>te d<strong>el</strong> campo. Se utilizaron 2 cajones <strong>de</strong> 9 m <strong>de</strong> largo por1 <strong>de</strong> ancho y 6 cajones <strong>de</strong> 2,7 m <strong>de</strong> largo por 1 <strong>de</strong> ancho. Se preparó <strong>el</strong> su<strong>el</strong>o <strong>el</strong> su interior yse aplicó glifosato para <strong>el</strong> control <strong>de</strong> malezas, posteriorm<strong>en</strong>te com<strong>en</strong>zaron a trasladarse losbulbos. Se instaló un sistema <strong>de</strong> riego automático por microaspersores, para facilitar <strong>el</strong>cuidado <strong>de</strong> las plantas y todos los cajones se cercaron con malla hexagonal <strong>de</strong> 80 cm <strong>de</strong>aLura, para prev<strong>en</strong>ir que los conejos dañ<strong>en</strong> las plantas. Los híbridos serán mant<strong>en</strong>idos d<strong>en</strong>trod<strong>el</strong> inverna<strong>de</strong>ro <strong>en</strong> macetas, al igual que las plantas tetraploi<strong>de</strong>s. A todas las macetas se lesinstaló una placa acrílica con <strong>el</strong> nombre <strong>de</strong> la especie, su proced<strong>en</strong>cia y año <strong>de</strong> plantación, losbulbos que quedaron al exterior también llevan placas acrílicas con los datos m<strong>en</strong>cionadosanteriorm<strong>en</strong>te.3.1.6 Evaluación <strong>de</strong> plantas diploi<strong>de</strong>s y poliploi<strong>de</strong>s.Se registró <strong>el</strong> número <strong>de</strong> hojas, no fue posible evaluar la floración <strong>en</strong> la plantas poliploi<strong>de</strong>s,consist<strong>en</strong>tes <strong>en</strong> una planta <strong>de</strong> R. spl<strong>en</strong>d<strong>en</strong>s y tres <strong>de</strong> R. montana.3.1.7 Otras activida<strong>de</strong>s.3.1.7.1 Estudios <strong>de</strong> la pres<strong>en</strong>cia <strong>de</strong> micorrizas.Se analizaron las raíces <strong>de</strong> dos especies, para esto se recolectaron bulbos <strong>de</strong>s<strong>de</strong> su hábitatnatural y se trasladaron al laboratorio para su estudio.Los bulbos se extrajeron cuidadosam<strong>en</strong>te para no dañar las raíces finas y se colocaron <strong>en</strong>toallas <strong>de</strong> pap<strong>el</strong> hume<strong>de</strong>cido o <strong>en</strong> su<strong>el</strong>o d<strong>el</strong> mismo lugar don<strong>de</strong> se realizó la extracción d<strong>el</strong>bulbo.Informe Técnico y <strong>de</strong> Gestión Final 59
Proyecto BID-PI-C-2001-1-A-071“<strong>Aplicaciones</strong> biotecnológicas <strong>en</strong> <strong>el</strong> mejorami<strong>en</strong>to g<strong>en</strong>ético <strong>de</strong> especies <strong>de</strong> Rhodophialachil<strong>en</strong>asR. bagnoldii se recolectó <strong>en</strong> un sector ubicado aproximadam<strong>en</strong>te 50 km al sur <strong>de</strong> La Ser<strong>en</strong>a,don<strong>de</strong> se <strong>en</strong>contraban <strong>en</strong> gran cantidad, se recolectaron 5 bulbos. R. spl<strong>en</strong>d<strong>en</strong>s, se recolectó<strong>en</strong> la VI Región camino a Termas d<strong>el</strong> Flaco, <strong>en</strong> un predio particular d<strong>en</strong>ominado “La Polcura”.También se recolectaron 5 bulbos. Una vez tomadas las muestras se colocaron <strong>en</strong> bolsaspláticas d<strong>en</strong>tro <strong>de</strong> neveras para evitar la <strong>de</strong>shidratación <strong>de</strong> los bulbos y la pérdida <strong>de</strong> calidad d<strong>el</strong>as muestras.Una vez que las muestras <strong>de</strong> raíces obt<strong>en</strong>idas <strong>en</strong> terr<strong>en</strong>o fueron lavadas cuidadosam<strong>en</strong>te,quitando todas las partículas <strong>de</strong> su<strong>el</strong>o u otros <strong>el</strong>em<strong>en</strong>tos in<strong>de</strong>seables, se procedió a las<strong>el</strong>ección <strong>de</strong> raíces factibles <strong>de</strong> ser analizadas bajo <strong>el</strong> microscopio. Éstas correspondieron araíces más finas o fibrosas (raicillas), evitando las más oscuras, viejas y gruesas, pues nopres<strong>en</strong>tan micorrizas y si las ti<strong>en</strong><strong>en</strong> son difíciles <strong>de</strong> visualizar.Como no se sabía <strong>de</strong> antemano si se <strong>en</strong>contrarían micorrizas <strong>en</strong> Rhodophiala y mucho m<strong>en</strong>os<strong>el</strong> tipo <strong>de</strong> micorrizas si es que ev<strong>en</strong>tualm<strong>en</strong>te existían; se utilizaron para su estudio técnicas <strong>de</strong>observación e id<strong>en</strong>tificación que se usan <strong>en</strong> g<strong>en</strong>eral para todas las especies. Esto es posible yaque aunque los tipos <strong>de</strong> micorrizas son distintos, las raíces micorrizadas ti<strong>en</strong><strong>en</strong> <strong>en</strong> comúnalgunos caracteres macroscópicos y microscópicos, como por ejemplo, la pres<strong>en</strong>cia <strong>de</strong>arbúsculos y vesículas <strong>en</strong> VAM; vaina, red <strong>de</strong> Hartig, color, ramificación, etc.Para favorecer la visualización <strong>de</strong> las hifas, vesículas y arbúsculos d<strong>el</strong> hongo micorrízico, sesometieron las raíces a un proceso <strong>de</strong> aclarado con una solución <strong>de</strong> KOH cali<strong>en</strong>te al 10%durante 10 minutos (más tiempo si éstas son gruesas o ti<strong>en</strong><strong>en</strong> muchos taninos, ya qu<strong>en</strong>ecesitarán un mayor aclarado). Una vez <strong>en</strong>friadas se <strong>el</strong>iminó la solución y se lavaron lasraíces con agua <strong>de</strong>stilada.Luego, se cubrieron con una solución <strong>de</strong> HCl (0,1 N) por 5 minutos para neutralizar <strong>el</strong> KOHresidual que hubiera quedado <strong>en</strong> las raíces y luego se <strong>el</strong>iminó <strong>el</strong> sobr<strong>en</strong>adante. Si las raíces noquedaban blancas (por ejemplo, mant<strong>en</strong>ían colores amarill<strong>en</strong>tos) se repetía <strong>el</strong> proceso <strong>de</strong>aclarado, <strong>de</strong>jando actuar más tiempo al KOH. Posterior a esto las muestras se tiñeron concolorante Azul Tripan 0,05% <strong>en</strong> lactoglicerol. De esta forma quedaron preparadas para suobservación microscópica.3.1.7.2 Salidas a terr<strong>en</strong>oEl 25 <strong>de</strong> abril <strong>de</strong> 2006 se realizó una recolección <strong>de</strong> material vegetal <strong>en</strong> la localidad <strong>de</strong> Putú,con <strong>el</strong> fin <strong>de</strong> realizar un estudio sobre <strong>el</strong> <strong>de</strong>sarrollo, crecimi<strong>en</strong>to y floración <strong>de</strong> esta especie adifer<strong>en</strong>tes temperaturas. Se <strong>el</strong>igió esta especie, ya que es la que muestra mejor adaptación altransplante, es <strong>de</strong>cir su floración se ve afectada <strong>en</strong> m<strong>en</strong>or proporción que otras especies <strong>de</strong>Rhodophiala, a<strong>de</strong>más <strong>el</strong> sitio <strong>de</strong> recolección es <strong>de</strong> uso agrícola, por lo tanto, esta especie estási<strong>en</strong>do <strong>el</strong>iminada por las prácticas <strong>de</strong> manejo utilizadas <strong>en</strong> <strong>el</strong> cultivo.Se recogió una gran cantidad <strong>de</strong> material vegetal para que <strong>el</strong> experim<strong>en</strong>to contara con unabu<strong>en</strong>a cantidad <strong>de</strong> repeticiones por cada tratami<strong>en</strong>to. Los bulbos fueron levantados d<strong>el</strong> terr<strong>en</strong>ocon picota o palta, y se colocaron <strong>en</strong> bolsas <strong>de</strong> plástico. Se trasladaron al Laboratorio <strong>de</strong>Hortalizas <strong>de</strong> la Facultad <strong>de</strong> Ci<strong>en</strong>cias Agrarias don<strong>de</strong> fueron mant<strong>en</strong>idos a temperaturaambi<strong>en</strong>te <strong>en</strong> bolsas <strong>de</strong> polietil<strong>en</strong>o con aserrín húmedo. Posteriorm<strong>en</strong>te fueron separados segúncalibre, <strong>el</strong>igiéndose para <strong>el</strong> <strong>en</strong>sayo todos aqu<strong>el</strong>los <strong>de</strong> calibre superior a 6/7, consi<strong>de</strong>rando que<strong>el</strong> mínimo floral <strong>de</strong> la especie es 4/5.Informe Técnico y <strong>de</strong> Gestión Final 60
Proyecto BID-PI-C-2001-1-A-071“<strong>Aplicaciones</strong> biotecnológicas <strong>en</strong> <strong>el</strong> mejorami<strong>en</strong>to g<strong>en</strong>ético <strong>de</strong> especies <strong>de</strong> Rhodophialachil<strong>en</strong>asAl recorrer <strong>el</strong> sector <strong>de</strong> Alto Pangue <strong>en</strong> diciembre <strong>de</strong> 2006 se observó que algunas plantaspres<strong>en</strong>taban frutos similares a las d<strong>el</strong> género Rhodophiala y Phyc<strong>el</strong>la, los cuales cont<strong>en</strong>íansemillas también similares. Al sacar los bulbos d<strong>el</strong> terr<strong>en</strong>o, observamos que éstos eran muyparecidos a los <strong>de</strong> las especies antes m<strong>en</strong>cionadas. Otra particularidad fue que los bulbosextraídos eran florales (t<strong>en</strong>ían restos <strong>de</strong> tallo floral) y sus calibres no eran muy gran<strong>de</strong>s, yfinalm<strong>en</strong>te la razón que nos motivó a sacar bulbos para estudio fue que éstos se <strong>en</strong>contraban<strong>en</strong> pl<strong>en</strong>o receso vegetativo, con aus<strong>en</strong>cia total <strong>de</strong> follaje y sin crecimi<strong>en</strong>to <strong>de</strong> raíces, lo que s<strong>en</strong>otó al extraer los bulbos d<strong>el</strong> terr<strong>en</strong>o ya que éstos no ofrecían mayor resist<strong>en</strong>cia, por <strong>el</strong>contrario, era muy fácil sacarlos. Al verlos nos dimos cu<strong>en</strong>ta <strong>de</strong> que no t<strong>en</strong>ían raíces <strong>en</strong> estaépoca.El 9 <strong>de</strong> <strong>en</strong>ero se realizó la recolección d<strong>el</strong> material vegetal <strong>en</strong> Alto Pangue, para estudiar sucomportami<strong>en</strong>to <strong>en</strong> almac<strong>en</strong>aje. Utilizando pala y picota, se extrajeron bulbos <strong>de</strong> difer<strong>en</strong>tessectores, t<strong>en</strong>i<strong>en</strong>do la precaución <strong>de</strong> no sacar la totalidad <strong>de</strong> los bulbos que se <strong>en</strong>contraban <strong>en</strong>cada sector y <strong>de</strong>jando <strong>el</strong> su<strong>el</strong>o lo más parecido posible a como estaba antes <strong>de</strong> extraer losbulbos. Los bulbos se colocaron <strong>en</strong> bolsas <strong>de</strong> pap<strong>el</strong> y fueron trasladados hasta <strong>el</strong> Laboratorio<strong>de</strong> Hortalizas.El 15 <strong>de</strong> <strong>en</strong>ero <strong>de</strong> 2007 se realizó una excursión a Laguna d<strong>el</strong> Maule, para recolectar flores <strong>de</strong>R. montana, las cuales se utilizarían posteriorm<strong>en</strong>te <strong>en</strong> experim<strong>en</strong>tos <strong>de</strong> poscosecha, se<strong>de</strong>finió como estado <strong>de</strong> madurez <strong>de</strong> cosecha <strong>el</strong> estado <strong>en</strong> que la vaina comi<strong>en</strong>za a abrirse y seempieza a ver la flor. Las flores cosechadas fueron colocadas <strong>en</strong> tubos <strong>de</strong> <strong>en</strong>sayo con agua<strong>de</strong>stilada o con las soluciones indicadas según <strong>el</strong> tratami<strong>en</strong>to correspondi<strong>en</strong>te y se conservaron<strong>en</strong> una nevera hasta la llegada al Laboratorio. Durante todo <strong>el</strong> traslado se registró latemperatura d<strong>en</strong>tro <strong>de</strong> la nevera.El 30 <strong>de</strong> agosto <strong>de</strong> 2007 se realizó una excursión al predio La Polcura ubicado <strong>en</strong> la VI región,camino a Termas d<strong>el</strong> Flaco, con <strong>el</strong> fin <strong>de</strong> recolectar bulbos <strong>de</strong> R. spl<strong>en</strong>d<strong>en</strong>s para los estudios<strong>de</strong> pres<strong>en</strong>cia <strong>de</strong> micorrizas, se recorrió <strong>el</strong> lugar y se <strong>en</strong> la parte baja d<strong>el</strong> predio cercana al RíoTinguiririca <strong>en</strong>contró una pequeña población <strong>de</strong> la especie. Se recolectaron 5 bulbos, t<strong>en</strong>i<strong>en</strong>domucha precaución para no dañar las raicillas que posteriorm<strong>en</strong>te serían examinadas.El 9 <strong>de</strong> septiembre <strong>de</strong> 2007 se realizó una nueva excursión, esta vez hacia <strong>el</strong> norte, con <strong>el</strong> fin<strong>de</strong> recolectar otras especies <strong>de</strong> Rhodophiala también para los estudios sobre pres<strong>en</strong>cia <strong>de</strong>micorrizas. Durante dos días se recorrieron varios lugares y se recolectaron bulbos <strong>de</strong> R.bagnoldii al norte <strong>de</strong> la Ser<strong>en</strong>a (aprox. 50 km) y <strong>de</strong> R. phyc<strong>el</strong>loi<strong>de</strong>s <strong>en</strong> Caleta Horno.El 15 <strong>de</strong> <strong>en</strong>ero <strong>de</strong> 2008 se realizó una excursión a La Polcura, esta vez para recolectar florespara realizar un experim<strong>en</strong>to <strong>de</strong> poscosecha, lam<strong>en</strong>tablem<strong>en</strong>te, la floración fue muy baja y yaestaba terminando, por lo cual no se pudo recolectar. En vista <strong>de</strong> esto ese mismo día subimoshasta Radal 7 tazas con <strong>el</strong> mismo fin pero <strong>en</strong> este sector la floración también estabaterminando. Lam<strong>en</strong>tablem<strong>en</strong>te no se pudo realizar <strong>el</strong> experim<strong>en</strong>to <strong>de</strong> poscosecha que estabaprevisto.El 22 <strong>de</strong> Enero viajamos a Santiago para visitar <strong>el</strong> Laboratorio <strong>de</strong> Resonancia Magnética <strong>de</strong> laP. Universidad Católica <strong>de</strong> Chile, con <strong>el</strong> fin <strong>de</strong> someter algunos bulbos a este procedimi<strong>en</strong>topara observar si existían yemas florales <strong>en</strong> su interior sin <strong>de</strong>struirlos. Se llevaron varios bulbos<strong>en</strong>tre <strong>el</strong>los 2 tetraploi<strong>de</strong>s, uno <strong>de</strong> R. montana y uno <strong>de</strong> R. spl<strong>en</strong>d<strong>en</strong>s, pero no fue posibleobt<strong>en</strong>er imág<strong>en</strong>es claras <strong>de</strong> <strong>el</strong>los.Informe Técnico y <strong>de</strong> Gestión Final 61
Proyecto BID-PI-C-2001-1-A-071“<strong>Aplicaciones</strong> biotecnológicas <strong>en</strong> <strong>el</strong> mejorami<strong>en</strong>to g<strong>en</strong>ético <strong>de</strong> especies <strong>de</strong> Rhodophialachil<strong>en</strong>as3.1.7.3 Acondicionami<strong>en</strong>to salta <strong>de</strong> <strong>en</strong>sayosDurante los meses <strong>de</strong> octubre y noviembre <strong>de</strong> 2007 se realizaron los trabajos paraacondicionar una salta con <strong>el</strong> equipami<strong>en</strong>to necesario para realizar los estudios <strong>de</strong>poscosecha, se instalaron tubos fluoresc<strong>en</strong>tes y un equipo <strong>de</strong> aire acondicionado.3.1.7.4 Recu<strong>en</strong>to <strong>de</strong> número <strong>de</strong> hojasSe continuó con <strong>el</strong> recu<strong>en</strong>to <strong>de</strong> número <strong>de</strong> hojas sobre los bulbos <strong>de</strong> tres especies.3.2 Principales problemas metodológicos <strong>en</strong>fr<strong>en</strong>tados3.2.1 Id<strong>en</strong>tificar y caracterizar 8 especies <strong>de</strong> RhodophialaNo hubo problemas al respecto.3.2.2 Determinar la temperatura óptima para lograr la <strong>en</strong>gorda rápida <strong>de</strong> los bulbos,incluy<strong>en</strong>do protocolo <strong>de</strong> fertilización.Como <strong>en</strong> ocasiones anteriores <strong>el</strong> principal problema metodológico fue la falta <strong>de</strong> bulbos <strong>de</strong>calibre homogéneo y número a<strong>de</strong>cuado para realizar los experim<strong>en</strong>tos, por lo que <strong>de</strong>bieronusarse plántulas para realizar este estudio.Otro problema que incidió <strong>en</strong> <strong>el</strong> <strong>de</strong>sarrollo d<strong>el</strong> experim<strong>en</strong>to <strong>de</strong> Cultivo con calefacción fue qu<strong>el</strong>as altas temperaturas primaverales asociada tal vez a algún patóg<strong>en</strong>o provocaron la muerte <strong>de</strong>muchas plántulas, con lo cual los resultados <strong>de</strong> ese experim<strong>en</strong>to fueron afectados.En <strong>el</strong> caso <strong>de</strong> Cultivo <strong>en</strong> tún<strong>el</strong> <strong>de</strong> gradi<strong>en</strong>te tuvieron que modificarse los tratami<strong>en</strong>tos porque se<strong>de</strong>tectó un problema con <strong>el</strong> número <strong>de</strong> repeticiones <strong>de</strong> uno <strong>de</strong> los factores.3.2.3 Realizar estudios pr<strong>el</strong>iminares sobre control <strong>de</strong> floración y poscosecha <strong>de</strong> lasespecies.La principal limitante fue <strong>el</strong> número <strong>de</strong> bulbos <strong>en</strong> <strong>el</strong> caso d<strong>el</strong> experim<strong>en</strong>to <strong>de</strong> control <strong>de</strong>floración. En <strong>el</strong> caso <strong>de</strong> la poscosecha sólo se realizó un <strong>en</strong>sayo <strong>en</strong> R. montana, como sem<strong>en</strong>cionó anteriorm<strong>en</strong>te, al salir a terr<strong>en</strong>o para recolectar flores <strong>de</strong> R. spl<strong>en</strong>d<strong>en</strong>s la floraciónestaba concluy<strong>en</strong>do y no se <strong>en</strong>contraron sufici<strong>en</strong>tes varas florales.3.2.4 Cultivo <strong>de</strong> híbridos.No se <strong>de</strong>tectaron problemas.3.2.5 Formar una colección <strong>de</strong> especies <strong>de</strong> Rhodophiala a partir <strong>de</strong> bulbos.No se <strong>de</strong>tectaron problemas.3.2.6 Evaluación <strong>de</strong> plantas diploi<strong>de</strong>s y poliploi<strong>de</strong>s.No fue posible evaluar la floración <strong>de</strong> los poliploi<strong>de</strong>s.3.2.7 Adaptaciones o modificaciones introducidas durante la ejecución d<strong>el</strong> proyecto yexplicación <strong>de</strong> estas modificaciones.En <strong>el</strong> experim<strong>en</strong>to <strong>de</strong> cultivo <strong>en</strong> tún<strong>el</strong> <strong>de</strong> gradi<strong>en</strong>te térmico se modificaron los tratami<strong>en</strong>tosoriginales, quedando <strong>el</strong> experim<strong>en</strong>to conducido <strong>en</strong> un diseño completam<strong>en</strong>te al azar con unfactor, la fecha <strong>de</strong> plantación, <strong>en</strong> tres niv<strong>el</strong>es. Finalm<strong>en</strong>te se evaluó <strong>el</strong> efecto <strong>de</strong> la fecha <strong>de</strong>plantación sobre características <strong>de</strong> floración y <strong>de</strong>sarrollo <strong>de</strong> las plantas.Informe Técnico y <strong>de</strong> Gestión Final 62
Proyecto BID-PI-C-2001-1-A-071“<strong>Aplicaciones</strong> biotecnológicas <strong>en</strong> <strong>el</strong> mejorami<strong>en</strong>to g<strong>en</strong>ético <strong>de</strong> especies <strong>de</strong> Rhodophialachil<strong>en</strong>as4. Descripción <strong>de</strong> las activida<strong>de</strong>s y tareas ejecutadasObj Activida<strong>de</strong>spe N°1 1Descripción2006Programada Ejecutada2 1 Cultivar los bulbos <strong>en</strong> siSicondiciones <strong>de</strong> temperaturacontrolada (sustrato yambi<strong>en</strong>tal).2 2 Experim<strong>en</strong>tos <strong>de</strong> fertilización si no En exp. previo nose <strong>en</strong>contrarondifer<strong>en</strong>cias3 1 Experim<strong>en</strong>tos <strong>de</strong> exposición al siSifrío3 2 Experim<strong>en</strong>tos <strong>de</strong> aplicación <strong>de</strong>ácido giberélico3 3 Experim<strong>en</strong>tos <strong>de</strong> poscosecha sí sí4 1 Cultivo <strong>de</strong> semillas sísíprov<strong>en</strong>i<strong>en</strong>tes <strong>de</strong> cruzami<strong>en</strong>tos5 1 Recolección <strong>de</strong> bulbos flores e sísíinformación5 2 Establecimi<strong>en</strong>to <strong>de</strong> los bulbos<strong>en</strong> <strong>el</strong> lugar <strong>de</strong>finido6 1 Evaluación <strong>de</strong> poliploi<strong>de</strong>s sí sí6 2 Registro <strong>de</strong> número <strong>de</strong> hojas sí sísí no Por baja cantidad<strong>de</strong> bulbos floralessí no No estaba <strong>de</strong>finido<strong>el</strong> lugarObj Activida<strong>de</strong>sp N°1 12007Descripción Programada Ejecutada2 1 Cultivar los bulbos <strong>en</strong> condiciones <strong>de</strong> sínotemperatura controlada (sustrato yambi<strong>en</strong>tal), aplicando protocolo <strong>de</strong>fertilización3 1 Experim<strong>en</strong>tos <strong>de</strong> exposición al frío sí sí3 2 Experim<strong>en</strong>to <strong>de</strong> aplicación <strong>de</strong> ácidogiberélicosi no Por bajacantidad <strong>de</strong>bulbosflorales3 3 Experim<strong>en</strong>tos <strong>de</strong> poscosecha si no Se ad<strong>el</strong>antóla floraciónInforme Técnico y <strong>de</strong> Gestión Final 63
Proyecto BID-PI-C-2001-1-A-071“<strong>Aplicaciones</strong> biotecnológicas <strong>en</strong> <strong>el</strong> mejorami<strong>en</strong>to g<strong>en</strong>ético <strong>de</strong> especies <strong>de</strong> Rhodophialachil<strong>en</strong>as4 1 Cultivo <strong>de</strong> híbridos si si5 1 Recolección <strong>de</strong> bulbos y flores si si5 2 Establecimi<strong>en</strong>to <strong>de</strong> los bulbos <strong>en</strong> lugar sisi<strong>de</strong>finido6 1 Evaluación <strong>de</strong> poliploi<strong>de</strong>s si si6 2 Registro <strong>de</strong> número <strong>de</strong> hojas si sinofloreshubo5. Resultados d<strong>el</strong> proyecto5.1 Determinar la temperatura óptima para lograr la <strong>en</strong>gorda rápida <strong>de</strong> los bulbos,incluy<strong>en</strong>do protocolo <strong>de</strong> fertilización.5.1.1 Estudios <strong>de</strong> crecimi<strong>en</strong>to bajo temperatura controlada <strong>de</strong> sustrato y ambi<strong>en</strong>te.En la figura 4.1 se observa la evolución <strong>en</strong> <strong>el</strong> número <strong>de</strong> hojas durante los meses <strong>de</strong> duraciónd<strong>el</strong> experim<strong>en</strong>to para la especie R. ananuca. En los cuatro tratami<strong>en</strong>tos se registró uncomportami<strong>en</strong>to similar, las plantas alcanzaron un máximo número <strong>de</strong> hojas durante los meses<strong>de</strong> junio y julio, luego este valtor <strong>de</strong>creció <strong>en</strong> forma constante, las plantas sin calefacciónretuvieron por mayor tiempo <strong>el</strong> follaje.2,521,51calor aéreo y basalsin calor aéreo con calorbasalcon calor aéreo y sincalor basalsin calefacción0,5011/6/0725/6/079/7/0723/7/076/8/0720/8/073/9/07Fecha17/9/071/10/0715/10/0729/10/07Figura 5.1. Evolución <strong>en</strong> <strong>el</strong> número <strong>de</strong> hojas <strong>en</strong> plantas <strong>de</strong> R. ananuca cultivadasbajo difer<strong>en</strong>tes condiciones térmicasEn <strong>el</strong> caso <strong>de</strong> R. spl<strong>en</strong>d<strong>en</strong>s <strong>en</strong> número <strong>de</strong> hojas se mantuvo constante durante la temporadaevaluada para todos los tratami<strong>en</strong>tos con calefacción. En <strong>el</strong> caso <strong>de</strong> las plantas que nocontaron con calor basal ni aéreo, <strong>el</strong> número <strong>de</strong> hojas se redujo llegando a un mínimo <strong>en</strong>trejulio y agosto cercano a 0,2 hojas por planta (Figura 4.2). Hacia <strong>el</strong> final <strong>de</strong> la temporada todoslos tratami<strong>en</strong>tos mostraron un comportami<strong>en</strong>to similar, pero siempre <strong>el</strong> número <strong>de</strong> hojas fuem<strong>en</strong>or <strong>en</strong> las plantas sin calefacción.Informe Técnico y <strong>de</strong> Gestión Final 64
Proyecto BID-PI-C-2001-1-A-071“<strong>Aplicaciones</strong> biotecnológicas <strong>en</strong> <strong>el</strong> mejorami<strong>en</strong>to g<strong>en</strong>ético <strong>de</strong> especies <strong>de</strong> Rhodophialachil<strong>en</strong>as1,61,41,210,80,6calor aéreo y basalsin calor aéreo con calor basalCon calor aéreo y sin calor basalsin calefacción0,40,2011/6/0725/6/079/7/0723/7/076/8/0720/8/073/9/0717/9/071/10/0715/10/0729/10/07FechaFigura 5.2. Evolución <strong>en</strong> <strong>el</strong> número <strong>de</strong> hojas <strong>en</strong> plantas <strong>de</strong> R. spl<strong>en</strong>d<strong>en</strong>s cultivadasbajo difer<strong>en</strong>tes condiciones térmicasLa especie R. bagnoldii mostró un comportami<strong>en</strong>to similar a R. ananuca, con un máximo <strong>de</strong>producción <strong>de</strong> hojas al principio <strong>de</strong> la temporada <strong>de</strong> medición y un posterior <strong>de</strong>sc<strong>en</strong>so. Al igualque R. ananuca, las plantas sin calefacción mantuvieron su área foliar por un periodo <strong>de</strong>tiempo mayor que <strong>el</strong> resto <strong>de</strong> los tratami<strong>en</strong>tos2,521,51calor aéreo y basalsin calor aéreo con calor basalCon calor aéreo y sin calor basalsin calefacción0,5011/6/0725/6/079/7/0723/7/076/8/0720/8/073/9/0717/9/071/10/0715/10/0729/10/07FechaFigura 5.3. Evolución <strong>en</strong> <strong>el</strong> número <strong>de</strong> hojas <strong>en</strong> plantas <strong>de</strong> R. bagnoldii cultivadasbajo difer<strong>en</strong>tes condiciones térmicasAl analizar estadísticam<strong>en</strong>te los pesos y diámetros finales <strong>de</strong> los cuatro tratami<strong>en</strong>tos, se<strong>en</strong>contraron difer<strong>en</strong>cias significativas <strong>en</strong>tre <strong>el</strong>los sólo para diámetro <strong>en</strong> la especie R. spl<strong>en</strong>d<strong>en</strong>s,<strong>el</strong> cual fue mayor para los tratami<strong>en</strong>tos con calefacción basal o aérea, <strong>en</strong> los otros parámetrosno hubo difer<strong>en</strong>cias esto se pue<strong>de</strong> atribuir a la época <strong>en</strong> que se realizó <strong>el</strong> experim<strong>en</strong>toInforme Técnico y <strong>de</strong> Gestión Final 65
Proyecto BID-PI-C-2001-1-A-071“<strong>Aplicaciones</strong> biotecnológicas <strong>en</strong> <strong>el</strong> mejorami<strong>en</strong>to g<strong>en</strong>ético <strong>de</strong> especies <strong>de</strong> Rhodophialachil<strong>en</strong>asCuadro 4.1 Efecto <strong>de</strong> los tratami<strong>en</strong>tos sobre <strong>el</strong> peso y diámetro a cosecha <strong>de</strong> tresespecies <strong>de</strong> RhodophialaTratami<strong>en</strong>toEspecieR. ananuca R. spl<strong>en</strong>d<strong>en</strong>s R. bagnoldiiDiámetro Peso Diámetro Peso(mm) (g) (mm) (g)Peso(g)Diámetro(mm)Con calefacción aérea y basal 0,45 4,6 1,67 4,89 0,53 4,88Sólo calefacción basal 0,45 4,98 1,07 5,18 0,46 4,95Sólo calefacción aérea 0,51 4,86 0,83 5,28 0,56 5,09Sin calefacción 0,57 4,64 0,68 4,89 0,71 4,85Significancia n. s. n. s. n. s. n. s. n. s.Valores seguidos por la misma letra <strong>en</strong> las columnas, no difier<strong>en</strong> estadísticam<strong>en</strong>te <strong>en</strong>tre si(LSD, p0,05)5.2.Realizar estudios pr<strong>el</strong>iminares sobre control <strong>de</strong> floración y poscosecha <strong>de</strong> lasespecies.5.2.1 Estudios <strong>de</strong> crecimi<strong>en</strong>to y floración.En <strong>el</strong> cuadro 4.2 se muestran los resultados obt<strong>en</strong>idos <strong>en</strong> <strong>el</strong> <strong>en</strong>sayo <strong>de</strong> cultivo <strong>en</strong> tún<strong>el</strong> <strong>de</strong>gradi<strong>en</strong>te para las variables días a emerg<strong>en</strong>cia y días a floración. Se <strong>en</strong>contraron difer<strong>en</strong>ciassignificativas <strong>en</strong> los días a emerg<strong>en</strong>cia <strong>en</strong> los sectores más cerca y más lejos <strong>de</strong> la estufasi<strong>en</strong>do m<strong>en</strong>ores los días a emerg<strong>en</strong>cia para las fechas <strong>de</strong> plantación más tempranas <strong>en</strong> <strong>el</strong>sector al inicio d<strong>el</strong> tún<strong>el</strong>, <strong>el</strong> caso d<strong>el</strong> sector final, un m<strong>en</strong>or número <strong>de</strong> días a emerg<strong>en</strong>cia seregistró con la segunda fecha <strong>de</strong> plantación.Para la variable días a primera flor se obtuvieron difer<strong>en</strong>cias significativas <strong>en</strong> <strong>el</strong> sector inicial,si<strong>en</strong>do m<strong>en</strong>ores los días a primera flor para la plantación más tardía. En los sectores medio yfinal también los días a primera flor fueron m<strong>en</strong>ores para las plantaciones más tardías, <strong>en</strong> estoscasos las difer<strong>en</strong>cias fueron altam<strong>en</strong>te significativas.Figura 4.4aFloración <strong>de</strong>Rhodophiala sp.(Putú)Figura 4.4bFloración <strong>de</strong>Rhodophiala sp.(Putú)Informe Técnico y <strong>de</strong> Gestión Final 66
Proyecto BID-PI-C-2001-1-A-071“<strong>Aplicaciones</strong> biotecnológicas <strong>en</strong> <strong>el</strong> mejorami<strong>en</strong>to g<strong>en</strong>ético <strong>de</strong> especies <strong>de</strong> Rhodophialachil<strong>en</strong>asCuadro 4.2 Días a emerg<strong>en</strong>cia y días a floraciónFecha <strong>de</strong> plantación Días a emerg<strong>en</strong>cia Días a primera florSI SM SF SI SM SF25/05/06 22,9 a 21,5 36,7 183,7 b 200 194,2 bbb24/06/06 23 a 33,9 16,7 a 166,4 ab 170,7 166 aa21/07/06 42,3 b 36,6 37,2 150,5 a 152,5 166,9 abaSignificancia n.s. Valores seguidos por la misma letra <strong>en</strong> las columnas, no difier<strong>en</strong> estadísticam<strong>en</strong>te <strong>en</strong>tre si(LSD, p0,05)SI=sector más cerca <strong>de</strong> la estufa, SM=sector d<strong>el</strong> medio, SF=sector más lejos <strong>de</strong> la estufaAl analizar características florales como <strong>el</strong> largo <strong>de</strong> vara, se <strong>en</strong>contraron difer<strong>en</strong>ciasestadísticas altam<strong>en</strong>te significativas <strong>en</strong>tre las tres fechas <strong>de</strong> plantación si<strong>en</strong>do más largas las<strong>de</strong> la primera y segunda fecha <strong>en</strong> <strong>el</strong> sector inicial d<strong>el</strong> tún<strong>el</strong>, <strong>en</strong> los otros sectores no hubodifer<strong>en</strong>cias significativas.Para las otras características florales medidas no se <strong>en</strong>contraron difer<strong>en</strong>cias significativas <strong>en</strong>tr<strong>el</strong>os tratami<strong>en</strong>tos. Otra característica interesante que muestra esta especie es que <strong>el</strong> color <strong>de</strong> lasflores pue<strong>de</strong> variar <strong>de</strong>s<strong>de</strong> <strong>el</strong> rojo al naranjo claro, como se observa <strong>en</strong> las figuras 4.4a y 4.4b.Cuadro 4.3 Características florales.Largo <strong>de</strong> la vara Longitud <strong>de</strong> Cantidad <strong>de</strong> Cantidad <strong>de</strong>Fecha <strong>de</strong>(cm)tépaltos (cm) varas florales florecillas por varaplantaciónSI SM SF SI SM SF SI SM SF SI SM SF25/05/06 20,1 18,1 19,5 4,5 4,3 4,4 1,0 0,9 0,85 1,6 1,4 1,39a24/06/06 21,3 13,5 18,1 5,1 3,5 4,1 1,0 0,7 0,9 1,56 1,2 1,54a21/07/06 16,7 15,6 21,4 4,3 4,1 4,3 0,6 0,9 0,7 1,1 1,0 1,16b5Significancia n. s. n. s. n. s. n. s. n. s. n. s.n.s.n. s. n. s. n. s. n. s.En la figura 4.5 se muestra la evolución <strong>en</strong> <strong>el</strong> número <strong>de</strong> hojas <strong>en</strong> la especie R. montana <strong>en</strong>cada uno <strong>de</strong> los sectores d<strong>el</strong> tún<strong>el</strong>, si<strong>en</strong>do T1 la zona más cercana a la estufa, al comi<strong>en</strong>zo d<strong>el</strong><strong>en</strong>sayo, <strong>en</strong> los meses invernales <strong>el</strong> <strong>de</strong>sarrollo <strong>de</strong> hojas fue levem<strong>en</strong>te superior <strong>en</strong> la zona máscercana a la estufa, al transcurrir la temporada las plantas ubicadas <strong>en</strong> <strong>el</strong> sector contiguo a laestufa siempre mostraron un valor superior al igual que aqu<strong>el</strong>las ubicadas <strong>en</strong> la zonaintermedia. A partir <strong>de</strong> noviembre, se observa que <strong>el</strong> número <strong>de</strong> hojas comi<strong>en</strong>za a <strong>de</strong>crecer <strong>en</strong>aqu<strong>el</strong>las plantas que están más cercanas a la fu<strong>en</strong>te <strong>de</strong> calor. Por <strong>el</strong> contrario, las plantas d<strong>el</strong>sector más alejado (T3) continuaron aum<strong>en</strong>tando su área foliar hasta llegar a 3 hojas por plantacomo promedio.Informe Técnico y <strong>de</strong> Gestión Final 67
Proyecto BID-PI-C-2001-1-A-071“<strong>Aplicaciones</strong> biotecnológicas <strong>en</strong> <strong>el</strong> mejorami<strong>en</strong>to g<strong>en</strong>ético <strong>de</strong> especies <strong>de</strong> Rhodophialachil<strong>en</strong>asFigura 4.5 Evolución d<strong>el</strong> número <strong>de</strong> hojas por planta <strong>de</strong> R. montana, mant<strong>en</strong>idas <strong>en</strong> tún<strong>el</strong><strong>de</strong> gradi<strong>en</strong>te térmico <strong>de</strong>s<strong>de</strong> mayo <strong>de</strong> 2006.Promedio <strong>de</strong> número <strong>de</strong> hojas3,532,521,510,50Jul-06 Ago-06 Sep-06 Oct-06 Nov-06 Dic-06 Ene-07 Feb-07FechaT1 T2 T3Al analizar la floración <strong>de</strong> las plantas <strong>en</strong> los difer<strong>en</strong>tes sectores no se obtuvieron difer<strong>en</strong>ciassignificativas estadísticam<strong>en</strong>te, aunque <strong>el</strong> porc<strong>en</strong>taje <strong>de</strong> plantas que florecieron fue mayor <strong>en</strong> <strong>el</strong>sector más alejado <strong>de</strong> la fu<strong>en</strong>te <strong>de</strong> calor. Con r<strong>el</strong>ación a los días a floración tampoco seregistraron difer<strong>en</strong>cias estadísticam<strong>en</strong>te significativas, esto probablem<strong>en</strong>te <strong>de</strong>bido a que eranpocas plantas <strong>en</strong> evaluación.Cuadro 4.4 Días y porc<strong>en</strong>taje <strong>de</strong> floración <strong>en</strong> plantas <strong>de</strong> R. montana mant<strong>en</strong>idas <strong>en</strong> tún<strong>el</strong><strong>de</strong> gradi<strong>en</strong>te térmico <strong>de</strong>s<strong>de</strong> mayo <strong>de</strong> 2006.Días a floración Floración (%)Tratami<strong>en</strong>toSector 1 215 14Sector 2 153 14Sector 3 177 57Significancia n. s. n. s.n. s. : No significativo5.2.2 Estudios <strong>de</strong> f<strong>en</strong>ología.En la figura 4.6 se observa la evolución d<strong>el</strong> área foliar para los difer<strong>en</strong>tes tratami<strong>en</strong>tos. Lasplantas que se mantuvieron almac<strong>en</strong>adas a 5ºC <strong>de</strong>sarrollaron <strong>en</strong> g<strong>en</strong>eral una m<strong>en</strong>or área foliarque <strong>el</strong> testigo (color ver<strong>de</strong>) y que los tratami<strong>en</strong>tos <strong>de</strong> almac<strong>en</strong>aje a 20ºC. Las plantasalmac<strong>en</strong>adas por 3 meses a 5ºC y a 20ºC emergieron <strong>en</strong> fechas similares, sin embargo, lasplantas mant<strong>en</strong>idas a 20ºC alcanzaron más <strong>de</strong> 3 hojas por planta, y las almac<strong>en</strong>adas a 5ºCalcanzaron 2.Informe Técnico y <strong>de</strong> Gestión Final 68
Proyecto BID-PI-C-2001-1-A-071“<strong>Aplicaciones</strong> biotecnológicas <strong>en</strong> <strong>el</strong> mejorami<strong>en</strong>to g<strong>en</strong>ético <strong>de</strong> especies <strong>de</strong> Rhodophialachil<strong>en</strong>as43,532,521,510,5Control5ºC 1 mes5ºC 2 meses5ºC 3 meses20ºC 1 mes20ºC 2 meses20ºC 3 meses09/4/0716/4/0723/4/0730/4/077/5/0714/5/0721/5/0728/5/074/6/0711/6/0718/6/0725/6/072/7/079/7/0716/7/0723/7/0730/7/076/8/0713/8/0720/8/0727/8/073/9/0710/9/0717/9/0724/9/071/10/078/10/0715/10/0722/10/0729/10/075/11/0712/11/07Figura 4.6 Evolución d<strong>el</strong> número <strong>de</strong> hojas por planta para los difer<strong>en</strong>tes tratami<strong>en</strong>tos <strong>en</strong>Rhodophiala sp. recolectada <strong>en</strong> sector Alto Pangue.El almac<strong>en</strong>aje <strong>en</strong> frío también podría afectar la floración, como se observa <strong>en</strong> <strong>el</strong> cuadro 4.5.Ninguno <strong>de</strong> los bulbos almac<strong>en</strong>ados a 5ºC por 3 meses floreció, y al analizar la fecha <strong>de</strong>floración se observa que los bulbos almac<strong>en</strong>ados a 20ºC florecieron casi un mes antes que losbulbos almac<strong>en</strong>ados <strong>en</strong> frío y que <strong>el</strong> testigo plantado <strong>el</strong> mismo día d<strong>el</strong> inicio d<strong>el</strong> experim<strong>en</strong>to.Cuadro 4.5 Registro <strong>de</strong> floración <strong>en</strong> bulbos <strong>de</strong> Rhodophiala sp. Alto Pangue condifer<strong>en</strong>tes tratami<strong>en</strong>tos <strong>de</strong> almac<strong>en</strong>aje.Tratami<strong>en</strong>toFecha <strong>de</strong> floración y (Nº <strong>de</strong> Nº <strong>de</strong> bulbos conbulbos)flor totalesControl 5/10/07 (1) 1 <strong>de</strong> 65ºC 1 mes 5/10/07(1) 1 <strong>de</strong> 65ºC 2 meses 5/10/07 (1); 12/10/07 (1) 2 <strong>de</strong> 65ºC 3 meses 0 <strong>de</strong> 620ºC 1 mes 14/9/07 (1); 28/09/07 (3) 4 <strong>de</strong> 620ºC 2 meses 14/9/07 (1) 1 <strong>de</strong> 620ºC 3 meses 14/9/07 (1); 5/10/07 (1) 2 <strong>de</strong> 6Al analizar estadísticam<strong>en</strong>te los diámetros finales y al aum<strong>en</strong>to <strong>en</strong> <strong>el</strong> diámetro durante latemporada <strong>de</strong> crecimi<strong>en</strong>to, no se obtuvieron difer<strong>en</strong>cias significativas, por lo tanto no es posible<strong>de</strong>terminar si alguno <strong>de</strong> los tratami<strong>en</strong>tos afectó o favoreció <strong>el</strong> <strong>de</strong>sarrollo d<strong>el</strong> bulbo.Cuadro 4.6 Diámetro <strong>de</strong> los bulbos a cosecha e increm<strong>en</strong>to <strong>en</strong> <strong>el</strong> diámetro <strong>en</strong>Rhodophiala sp. Alto Pangue.Tratami<strong>en</strong>to Diámetro final Aum<strong>en</strong>to <strong>en</strong> <strong>el</strong> diámetro(mm)(mm)1 mes almac<strong>en</strong>aje a 5ºC 27,77 2,672 meses almac<strong>en</strong>aje a 5ºC 27,78 2,683 meses almac<strong>en</strong>aje a 5ºC 27 1,861 mes almac<strong>en</strong>aje a 20ºC 29,52 3,412 meses almac<strong>en</strong>aje a 20ºC 26,97 2,23 meses almac<strong>en</strong>aje a 20ºC 31,23 3,8significancia n. s. n. s.n. s. : No significativoInforme Técnico y <strong>de</strong> Gestión Final 69
Proyecto BID-PI-C-2001-1-A-071“<strong>Aplicaciones</strong> biotecnológicas <strong>en</strong> <strong>el</strong> mejorami<strong>en</strong>to g<strong>en</strong>ético <strong>de</strong> especies <strong>de</strong> Rhodophialachil<strong>en</strong>asLa figura 4.7 muestra <strong>el</strong> <strong>de</strong>sarrollo que experim<strong>en</strong>taron las raíces durante <strong>el</strong> almac<strong>en</strong>aje. Tantoa 5ºC como a 20ºC se observó un abundante <strong>de</strong>sarrollo <strong>de</strong> raíces, no así la emerg<strong>en</strong>cia <strong>de</strong>hojas, las que sólo aparecieron <strong>de</strong>spués <strong>de</strong> plantar; 1 y 2 meses <strong>de</strong>spués <strong>de</strong> la emerg<strong>en</strong>cia d<strong>el</strong>testigo <strong>en</strong> bulbos a 5ºC y 0 y 1 meses <strong>de</strong>spués <strong>de</strong> la emerg<strong>en</strong>cia d<strong>el</strong> testigo <strong>en</strong> bulbos a 20ºC.Figura 4.7 Desarrollo <strong>de</strong> raícesdurante <strong>el</strong> almac<strong>en</strong>aje <strong>en</strong>Rhodophiala sp.(Alto Pangue)Figura 4.8Floración <strong>en</strong> Rhodophialasp. (Alto Pangue)Como está especie se recolectó <strong>en</strong> estado <strong>de</strong> receso no t<strong>en</strong>íamos claro como serían las flores,p<strong>en</strong>sábamos que serían más gran<strong>de</strong>s que las <strong>de</strong>más Rhodophiala basados <strong>en</strong> <strong>el</strong> tamaño d<strong>el</strong>os frutos que vimos cuando visitamos Alto Pangue <strong>en</strong> diciembre <strong>de</strong> 2006, <strong>en</strong> la Figura 4.8 seobserva la vistosa floración <strong>de</strong> esta especie, <strong>el</strong> diámetro aproximado d<strong>el</strong> perigonio es <strong>de</strong> 10 cm.Revisando las claves disponibles con <strong>el</strong> botánico P. Peñailillo, Esta especie podría serRhodophiala colona.5.2.3 Estudios <strong>de</strong> poscosecha.Experim<strong>en</strong>to con solución <strong>de</strong> mant<strong>en</strong>ción.Las varas florales se mantuvieron durante dos días almac<strong>en</strong>adas <strong>en</strong> seco <strong>en</strong> una caja <strong>de</strong>cartón d<strong>en</strong>tro d<strong>el</strong> refrigerador, al sacarlas luego <strong>de</strong> este tiempo, se observó que habían perdidoturgor, sin embargo, al colocarlas <strong>en</strong> tubos con las respectivas soluciones las varasrecuperaron la firmeza. En <strong>el</strong> Cuadro 4.7 se resum<strong>en</strong> los resultados <strong>de</strong> la mant<strong>en</strong>ción <strong>de</strong> flores<strong>de</strong> R. montana <strong>en</strong> varios tipos <strong>de</strong> soluciones. En la variable número <strong>de</strong> días a apertura <strong>de</strong> laprimera flor no se obtuvieron difer<strong>en</strong>cias estadísticam<strong>en</strong>te significativas, y este tiempo fluctuó<strong>en</strong>tre 1 y 1,2 días. Para la variable vida útil los resultados mostraron que utilizando solucionescon azúcar, in<strong>de</strong>p<strong>en</strong>di<strong>en</strong>tem<strong>en</strong>te <strong>de</strong> la conc<strong>en</strong>tración se logra mayor vida útil <strong>de</strong> las varas,alcanzando 5,8 a 6,4 días. Al parecer, <strong>el</strong> uso <strong>de</strong> soluciones con pH <strong>en</strong>tre 3,5 y 4 tambiéncontribuye a lograr una mayor vida <strong>de</strong> florero. En la variable, absorción <strong>de</strong> solución, no seobtuvieron difer<strong>en</strong>cias estadísticam<strong>en</strong>te significativas y esta varió <strong>en</strong>tre 3,62 y 5,2 mL. En <strong>el</strong>caso <strong>de</strong> la variable aborto <strong>de</strong> flores no se obtuvieron difer<strong>en</strong>cias significativas estadísticam<strong>en</strong>te,pero <strong>en</strong> todos los tratami<strong>en</strong>tos se registraron flores abortadas.Informe Técnico y <strong>de</strong> Gestión Final 70
Proyecto BID-PI-C-2001-1-A-071“<strong>Aplicaciones</strong> biotecnológicas <strong>en</strong> <strong>el</strong> mejorami<strong>en</strong>to g<strong>en</strong>ético <strong>de</strong> especies <strong>de</strong> Rhodophialachil<strong>en</strong>asTratami<strong>en</strong>toCuadro 4.7 Resultados d<strong>el</strong> experim<strong>en</strong>to <strong>de</strong> mant<strong>en</strong>ción.Días aapertura <strong>de</strong>primera florVida útil(días)Absorción <strong>de</strong>solución(mL)Aborto <strong>de</strong> flores(%)Agua <strong>de</strong>stilada pura 1 4.8 c 3.62 13Agua <strong>de</strong>stilada pH 3.5 a 4 1 5 bc 3.52 205% azúcar pH 3.5 a 4 1.2 5.8 ab 5.2 1010% azúcar pH 3.5 a 4 1 6.4 a 4.92 615% azúcar pH 3.5 a 4 1 5.8 ab 3.72 9significancia n. s. ** n. s. n. s.n. s. : No significativo; * : significativo p0,05; **: altam<strong>en</strong>te significativo p0,01 Valores <strong>en</strong> unamisma columna seguidos <strong>de</strong> letras distintas indican difer<strong>en</strong>cias estadísticas según Test <strong>de</strong>DuncanExperim<strong>en</strong>to <strong>de</strong> pulsado.Se había planificado que <strong>de</strong>spués d<strong>el</strong> pulsado las varas se almac<strong>en</strong>arían <strong>en</strong> frío durante 2 díasy posteriorm<strong>en</strong>te <strong>de</strong> colocarían <strong>en</strong> florero, sin embargo, esto no fue posible ya que <strong>de</strong>spués <strong>de</strong>24 hrs <strong>de</strong> pulsado la mayoría <strong>de</strong> las varas pres<strong>en</strong>taban flores abiertas, esto explica los Valoresque aparec<strong>en</strong> <strong>en</strong> la columna días a apertura <strong>de</strong> primera flor d<strong>el</strong> Cuadro 4.8. Para la variablevida útil, no se obtuvieron difer<strong>en</strong>cias estadísticam<strong>en</strong>te significativas, las flores que recibieronpulsado com<strong>en</strong>zaron a abrir muy rápidam<strong>en</strong>te y duraron (<strong>en</strong> tubos con agua <strong>de</strong>stilada) <strong>en</strong>tre4,25 y 5,5 días, la absorción <strong>de</strong> pulsado también fue similar <strong>en</strong>tre los difer<strong>en</strong>tes tratami<strong>en</strong>tos.En <strong>el</strong> caso <strong>de</strong> la variable aborto <strong>de</strong> flores no hubieron difer<strong>en</strong>cias estadísticam<strong>en</strong>tesignificativas, y <strong>en</strong> g<strong>en</strong>eral <strong>el</strong> aborto <strong>de</strong> flores fue nulo <strong>en</strong> todos los tratami<strong>en</strong>tos, excepto <strong>en</strong> <strong>el</strong>tratami<strong>en</strong>to con 12% <strong>de</strong> azúcar <strong>en</strong> que 2 botones florales abortaron.Tratami<strong>en</strong>toCuadro 4.8 Resultados d<strong>el</strong> experim<strong>en</strong>to <strong>de</strong> pulsado.Días aapertura<strong>de</strong> primeraflorVida útil(días)Absorción <strong>de</strong>solución(mL)Aborto <strong>de</strong>flores(%)Agua <strong>de</strong>stilada pura pH 3,5 a 0.5 4.25 0.55 046% azúcar pH 3,5 a 4 0.25 5.25 0.625 012% azúcar pH 3,5 a 4 0.5 4 0.6 2018% azúcar pH 3,5 a 4 0.25 5.5 0.65 024% azúcar pH 3,5 a 4 0.5 4.75 0.6 0significancia n. s. n.sn. s. : No significativo; * : significativo p0,05; **: altam<strong>en</strong>te significativo p0,01 Valores <strong>en</strong> unamisma columna seguidos <strong>de</strong> letras distintas indican difer<strong>en</strong>cias estadísticas según Test <strong>de</strong>DuncanInforme Técnico y <strong>de</strong> Gestión Final 71
Proyecto BID-PI-C-2001-1-A-071“<strong>Aplicaciones</strong> biotecnológicas <strong>en</strong> <strong>el</strong> mejorami<strong>en</strong>to g<strong>en</strong>ético <strong>de</strong> especies <strong>de</strong> Rhodophialachil<strong>en</strong>as5.3 Cultivo <strong>de</strong> híbridos.El cuadro 4.9 muestra <strong>el</strong> número <strong>de</strong> bulbos híbridos que se <strong>en</strong>cu<strong>en</strong>tran actualm<strong>en</strong>te <strong>en</strong> Cultivo<strong>en</strong> <strong>el</strong> inverna<strong>de</strong>ro <strong>de</strong> la Estación Experim<strong>en</strong>tal.Cuadro 4.9 Híbridos <strong>en</strong> cultivo.Cruzami<strong>en</strong>to Edad (años) Nº <strong>de</strong> bulbosR. phyc<strong>el</strong>loi<strong>de</strong>s x R. bagnoldi 2 22R. phyc<strong>el</strong>loi<strong>de</strong>s x R. bagnoldii 2 29R. Las trancas x R. montana 2 27R. Caleu x R. spl<strong>en</strong>d<strong>en</strong>s 2 34R. Las trancas x R. montana 2 21R. Las trancas x R. montana 2 30R. montana x R. spl<strong>en</strong>d<strong>en</strong>s 2 17R. montana x R. spl<strong>en</strong>d<strong>en</strong>s 2 12R. spl<strong>en</strong>d<strong>en</strong>s x R. montana 2 11R. phyc<strong>el</strong>loi<strong>de</strong>s x R. spl<strong>en</strong>d<strong>en</strong>s 2 10spl<strong>en</strong>d<strong>en</strong>s x R. Montana 2 16R. spl<strong>en</strong>d<strong>en</strong>s x R. ananuca 2 3R. montana x R. ananuca 2 7R. montana x R. ananuca 2 3R. spl<strong>en</strong>d<strong>en</strong>s x R. ananuca 2 5R. montana x R. ananuca 2 10R. spl<strong>en</strong>d<strong>en</strong>s x R. adv<strong>en</strong>a 2 11R. phyc<strong>el</strong>loi<strong>de</strong>s x R. ananuca 2 3R. montana x R. Las trancas 2 10R. montana x R. spl<strong>en</strong>d<strong>en</strong>s 2 1R. spl<strong>en</strong>d<strong>en</strong>s x R. Putú 3 20R. spl<strong>en</strong>d<strong>en</strong>s x R. Putú 3 5R. montana x R. spl<strong>en</strong>d<strong>en</strong>s 3 13R phyc<strong>el</strong>loi<strong>de</strong>s x R bagnoldii 3 2R. montana x R. bagnoldii 3 3R. phyc<strong>el</strong>loi<strong>de</strong>s x R. bagnoldii 3 25.4 Formación <strong>de</strong> una colección <strong>de</strong> especies <strong>de</strong> Rhodophiala a partir <strong>de</strong> bulbos.Se trasladaron a un sector al aire libre d<strong>en</strong>tro <strong>de</strong> la Estación Experim<strong>en</strong>tal Panguilemo todoslos bulbos exist<strong>en</strong>tes recolectados durante la ejecución d<strong>el</strong> proyecto, las especies quequedarán <strong>en</strong> esta colección son R. montana, R. spl<strong>en</strong>d<strong>en</strong>s, R. bagnoldii, R. ananuca, R.phyc<strong>el</strong>loi<strong>de</strong>s, R. aff. chil<strong>en</strong>sis (Putú), Rhodophiala sp. (Alto Pangue) y Rhodophiala sp.(Cobquecura).Informe Técnico y <strong>de</strong> Gestión Final 72
Proyecto BID-PI-C-2001-1-A-071“<strong>Aplicaciones</strong> biotecnológicas <strong>en</strong> <strong>el</strong> mejorami<strong>en</strong>to g<strong>en</strong>ético <strong>de</strong> especies <strong>de</strong> Rhodophialachil<strong>en</strong>as5.5 Evaluación <strong>de</strong> plantas diploi<strong>de</strong>s y poliploi<strong>de</strong>s.5.5.1 Registro d<strong>el</strong> número <strong>de</strong> hojas <strong>en</strong> bulbos poliploi<strong>de</strong>s y mixoploi<strong>de</strong>s.En <strong>el</strong> caso <strong>de</strong> R. spl<strong>en</strong>d<strong>en</strong>s poliploi<strong>de</strong> se observa que <strong>el</strong> número máximo <strong>de</strong> hojas se registródurante los meses <strong>de</strong> octubre y noviembre, similar a temporadas anteriores, llegando a unmáximo <strong>de</strong> 4 hojas por planta. Durante este último periodo, se ha observado un mínimo <strong>de</strong> 0hojas, a partir <strong>de</strong> las evaluaciones <strong>de</strong> marzo, lo que podría indicar que esta especie ha <strong>en</strong>trado<strong>de</strong> receso, lo cual también se asocia con bulbos más gran<strong>de</strong>s <strong>de</strong> calibre floral. Sin embargo, nose registró floración <strong>de</strong> esta planta tampoco durante la última temporada (2006-2007). En <strong>el</strong>caso <strong>de</strong> R. spl<strong>en</strong>d<strong>en</strong>s mixoploi<strong>de</strong> también se ha observado un aum<strong>en</strong>to <strong>en</strong> <strong>el</strong> máximo número<strong>de</strong> hojas con respecto a temporadas anteriores, a<strong>de</strong>más, estas plantas han mostrado unperiodo <strong>de</strong> receso que comi<strong>en</strong>za aproximadam<strong>en</strong>te <strong>en</strong> marzo <strong>de</strong>s<strong>de</strong> hace 2 temporadas. R.montana, mixoploi<strong>de</strong>, <strong>en</strong> cambio, ha mostrado un máximo 3 hojas, muy similar a los periodosanteriores, y también ha mostrado periodos <strong>de</strong> receso invernal <strong>de</strong>s<strong>de</strong> hace 3 temporadas,tampoco se ha registrado floración <strong>en</strong> <strong>el</strong> caso <strong>de</strong> las plantas mixoploi<strong>de</strong>s. Al observar <strong>el</strong>comportami<strong>en</strong>to <strong>de</strong> los tres tipos <strong>de</strong> planta, se podría <strong>de</strong>cir que la poliploi<strong>de</strong> ha pres<strong>en</strong>tado unperiodo juv<strong>en</strong>il más largo y está <strong>en</strong>trando <strong>en</strong> una fase adulta. Sin embargo, no es posiblepre<strong>de</strong>cir un comportami<strong>en</strong>to <strong>en</strong> cuanto a la floración <strong>de</strong> esta planta, ya que las mixoploi<strong>de</strong>s quehan pres<strong>en</strong>tado <strong>de</strong>s<strong>de</strong> hace varias temporadas, una periodicidad parecida a la que pres<strong>en</strong>tan<strong>en</strong> forma natural, aun así, no han logrado florecer.6Número <strong>de</strong> hojas54321007-11-0307-12-0307-01-0407-02-0407-03-0407-04-0407-05-0407-06-0407-07-0407-08-0407-09-0407-10-0407-11-0407-12-0407-01-0507-02-0507-03-0507-04-0507-05-0507-06-0507-07-0507-08-0507-09-0507-10-0507-11-0507-12-0507-01-0607-02-0607-03-0607-04-0607-05-0607-06-0607-07-0607-08-0607-09-0607-10-0607-11-0607-12-0607-01-0707-02-0707-03-0707-04-0707-05-0707-06-0707-07-0707-08-0707-09-0707-10-0707-11-0707-12-0707-01-0807-02-08FechasR. spl<strong>en</strong>d<strong>en</strong>s poliploi<strong>de</strong> R. spl<strong>en</strong>d<strong>en</strong>s mixoploi<strong>de</strong> R. montana mixoploi<strong>de</strong>Figura 4.9Número <strong>de</strong> hojas por bulbo <strong>en</strong> Rhodophiala spl<strong>en</strong>d<strong>en</strong>s poliploi<strong>de</strong>,mixoploi<strong>de</strong> y Rhodophiala montana mixoploi<strong>de</strong> trasladadas alinverna<strong>de</strong>ro Panguilemo <strong>de</strong>s<strong>de</strong> Valdivia <strong>en</strong> julio <strong>de</strong> 20035.6 Otras activida<strong>de</strong>s.5.6.1 Estudios <strong>de</strong> la pres<strong>en</strong>cia <strong>de</strong> micorrizas.El análisis microscópico mostró la exist<strong>en</strong>cia <strong>de</strong> raíces micorrizadas casi <strong>en</strong> <strong>el</strong> 100% <strong>de</strong> lasmuestras y para todas las especies estudiadas (Cuadro 4.11). Esto podría explicar <strong>en</strong> parteque cuando los bulbos son sacados <strong>de</strong> su hábitat y cultivado <strong>en</strong> mezclas <strong>de</strong> su<strong>el</strong>o corri<strong>en</strong>tes,que se usan para cualquier tipo <strong>de</strong> cultivo, podrían afectase algunas <strong>de</strong> sus característicasfisiológicas, incluso su floración.Informe Técnico y <strong>de</strong> Gestión Final 73
Proyecto BID-PI-C-2001-1-A-071“<strong>Aplicaciones</strong> biotecnológicas <strong>en</strong> <strong>el</strong> mejorami<strong>en</strong>to g<strong>en</strong>ético <strong>de</strong> especies <strong>de</strong> Rhodophialachil<strong>en</strong>asCuadro 4.11 Análisis <strong>de</strong> raíces.Especie/ Lugar <strong>de</strong> recolecciónNº <strong>de</strong>bulbosmuestreadosNº total <strong>de</strong>raícesNº <strong>de</strong> raícess<strong>el</strong>eccionadasRaícesmicorrizadas(%)R. phyc<strong>el</strong>lio<strong>de</strong>sValle Hurtado 4 62 34 95R.BagnoldiiRuta Norte <strong>de</strong> Ovalle Km 440 6 69 32 100R.BagnoldiiTongoy 7 100 45 98.6R. phyc<strong>el</strong>lio<strong>de</strong>sCaleta Horno 4 56 25 100Figura 4.10 a,b,c y d. Fotografías <strong>de</strong> raíces micorrizadas (vesículas) observadas amicroscopio óptico (40X)Informe Técnico y <strong>de</strong> Gestión Final 74
Proyecto BID-PI-C-2001-1-A-071“<strong>Aplicaciones</strong> biotecnológicas <strong>en</strong> <strong>el</strong> mejorami<strong>en</strong>to g<strong>en</strong>ético <strong>de</strong> especies <strong>de</strong> Rhodophialachil<strong>en</strong>as5.6.2 Registro <strong>de</strong> número <strong>de</strong> hojas.Rhodophiala spl<strong>en</strong>d<strong>en</strong>sDurante este periodo <strong>el</strong> comportami<strong>en</strong>to ha sido similar que <strong>en</strong> los anteriores, las plantas hanmostrado una disminución <strong>en</strong> la producción <strong>de</strong> hojas durante los meses <strong>de</strong> verano y <strong>de</strong>invierno, pero sin llegar a 0 hojas. El máximo número <strong>de</strong> hojas se ha registrado <strong>en</strong> <strong>el</strong> mes <strong>de</strong>octubre, si<strong>en</strong>do este valor m<strong>en</strong>or <strong>en</strong> bulbos <strong>de</strong> calibres más pequeños (Figura 4.11).4,003,503,002,502,001,501,000,500,0012/03/0726/03/0709/04/0723/04/0707/05/0721/05/0704/06/0718/06/0702/07/0716/07/0730/07/0713/08/0727/08/0710/09/0724/09/07Fecha08/10/0722/10/0705/11/0719/11/0703/12/0717/12/0731/12/0714/01/0828/01/0811/02/0825/02/0810/03/08Figura 4.11. Promedio <strong>de</strong> número <strong>de</strong> hojas <strong>en</strong> bulbos <strong>de</strong> R. spl<strong>en</strong>d<strong>en</strong>sCalibres 2/3, 3/4 y 4/5Calibres 5/6, 6/7 y 7/8Rhodophiala montanaLas plantas <strong>de</strong> esta especie también continúan mostrando la periodicidad <strong>de</strong> temporadasanteriores, <strong>en</strong> <strong>el</strong> caso <strong>de</strong> los bulbos <strong>de</strong> tamaños más pequeños, <strong>el</strong> máximo número <strong>de</strong> hojas seregistró <strong>en</strong> noviembre y alcanzó <strong>en</strong> promedio 2,3 hojas, lo que es mejor a los máximosregistrados <strong>en</strong> temporadas anteriores los bulbos más gran<strong>de</strong>s produjeron <strong>en</strong> promedio unmáximo <strong>de</strong> 3.5 hojas. La mínima producción <strong>de</strong> hojas se registró <strong>en</strong> febrero y julio, al igual que<strong>en</strong> R. spl<strong>en</strong>d<strong>en</strong>s los bulbos <strong>de</strong> calibres pequeños y gran<strong>de</strong>s sigu<strong>en</strong> <strong>el</strong> mismo patrón <strong>de</strong>comportami<strong>en</strong>to, sólo con difer<strong>en</strong>cias <strong>en</strong> <strong>el</strong> número <strong>de</strong> hojas producidas (Figura 4.12).4,003,503,002,502,001,501,000,500,0012/3/0726/3/079/4/0723/4/077/5/0721/5/074/6/0718/6/072/7/0716/7/0730/7/0713/8/0727/8/0710/9/0724/9/078/10/0722/10/075/11/0719/11/073/12/0717/12/0731/12/0714/1/0828/1/0811/2/08FechaCalibres 2/3, 3/4, 4/5 y 5/6 Calibres 6/7, 7/8, 8/9 y 9/10Figura 4.12. Promedio <strong>de</strong> número <strong>de</strong> hojas <strong>en</strong> bulbos <strong>de</strong> R. montanaInforme Técnico y <strong>de</strong> Gestión Final 75
Proyecto BID-PI-C-2001-1-A-071“<strong>Aplicaciones</strong> biotecnológicas <strong>en</strong> <strong>el</strong> mejorami<strong>en</strong>to g<strong>en</strong>ético <strong>de</strong> especies <strong>de</strong> Rhodophialachil<strong>en</strong>asRhodophiala bagnoldiiLos bulbos <strong>de</strong> esta especie han ido disminuy<strong>en</strong>do <strong>en</strong> número <strong>de</strong>s<strong>de</strong> que se recolectaron ainicios d<strong>el</strong> proyectó, <strong>en</strong> la mediciones <strong>de</strong> esta temporada ya se contaba con muy pocos bulbosy como pue<strong>de</strong> apreciarse <strong>en</strong> la figura 4.13 los <strong>de</strong> calibre 3/4 y 4/5 no mostraron hojas duranteeste periodo. En <strong>el</strong> caso <strong>de</strong> los bulbos más gran<strong>de</strong>s 5/6 y 6/7 estos sólo alcanzaron un máximo<strong>de</strong> 0,6 hojas por plantas <strong>en</strong> julio disminuy<strong>en</strong>do bruscam<strong>en</strong>te <strong>en</strong> la medición <strong>de</strong> agosto. No sesiguió midi<strong>en</strong>do a partir <strong>de</strong> esta fecha ya que quedaban muy pocos bulbos.0,70,60,50,40,3Calibres 3/4 y 4/5Calibres 5/6 y 6/70,20,10marz-07 abri-07 mayo-07 juni-07 juli-07 agos-07FechaFigura 4.13. Promedio <strong>de</strong> número <strong>de</strong> hojas <strong>en</strong> bulbos <strong>de</strong> R. bagnoldii5.6.5 Cruzami<strong>en</strong>tosDurante la temporada <strong>de</strong> floración 2006-2007 se repitió <strong>el</strong> programa <strong>de</strong> cruzami<strong>en</strong>to <strong>en</strong>tre lasespecies d<strong>el</strong> proyecto, sin embargo, <strong>de</strong>bido a la baja floración se pudo utilizar flores sólo <strong>de</strong> R.montana, R. bagnoldii, R. spl<strong>en</strong>d<strong>en</strong>s, R. phyc<strong>el</strong>loi<strong>de</strong>s y R. aff. chil<strong>en</strong>sis.Informe Técnico y <strong>de</strong> Gestión Final 76
Proyecto BID-PI-C-2001-1-A-071“<strong>Aplicaciones</strong> biotecnológicas <strong>en</strong> <strong>el</strong> mejorami<strong>en</strong>to g<strong>en</strong>ético <strong>de</strong> especies <strong>de</strong> Rhodophialachil<strong>en</strong>asCuadro 4.3. Cruzami<strong>en</strong>tos realizados <strong>en</strong> la temporada 2006-2007 y número <strong>de</strong> semillashíbridas resultantesMacho Hembra Nº <strong>de</strong>Nº total <strong>de</strong>cruzami<strong>en</strong>tos Nº <strong>de</strong> cruzami<strong>en</strong>tos semillasrealizadosexitosos29 4 26R. bagnoldii R. montanaR. bagnoldii R. spl<strong>en</strong>d<strong>en</strong>sR. montana R. spl<strong>en</strong>d<strong>en</strong>sR. bagnoldii R. phyc<strong>el</strong>loi<strong>de</strong>sR. aff. chil<strong>en</strong>sisR. montanaR. aff. chil<strong>en</strong>sis R. bagnoldiiR. spl<strong>en</strong>d<strong>en</strong>s R. montanaR. montana R. phyc<strong>el</strong>loi<strong>de</strong>s2 2 639 5 971 1 6425 9 1312 2 5227 5 741 1 17En g<strong>en</strong>eral, los cruzami<strong>en</strong>tos con la especie R. montana como hembra, fueron m<strong>en</strong>os exitosos,a pesar <strong>de</strong> esto, se obtuvo una gran cantidad <strong>de</strong> semillas híbridas. En las <strong>de</strong>más especies, <strong>de</strong>todos los cruzami<strong>en</strong>tos realizados se obtuvieron semillas.6. Problemas <strong>en</strong>fr<strong>en</strong>tados durante la ejecución d<strong>el</strong> proyectoEl hecho <strong>de</strong> que las plantas nunca pres<strong>en</strong>taran un comportami<strong>en</strong>to “absoluto”, es <strong>de</strong>cir, nuncaestuvieron 100% <strong>en</strong> receso, o pres<strong>en</strong>taran 100% <strong>de</strong> floración, fue un problema <strong>en</strong> todos losexperim<strong>en</strong>tos. En este caso, la unidad experim<strong>en</strong>tal <strong>de</strong>bería ser un número mucho mayor que<strong>el</strong> utilizado normalm<strong>en</strong>te <strong>en</strong> otras especies y mucho mayor que <strong>el</strong> utilizado <strong>en</strong> este proyecto. Elmaterial disponible siempre fue escaso y <strong>de</strong> alta variabilidad g<strong>en</strong>ética.El problema pres<strong>en</strong>tado <strong>en</strong> <strong>el</strong> experim<strong>en</strong>to bajo tún<strong>el</strong>, las plantas <strong>de</strong> R. montana, a difer<strong>en</strong>cia<strong>de</strong> las otras especies murieron apar<strong>en</strong>tem<strong>en</strong>te por exceso <strong>de</strong> calor g<strong>en</strong>erado bajo <strong>el</strong> tún<strong>el</strong> undía <strong>de</strong> sol <strong>en</strong> octubre, esto también podría estar r<strong>el</strong>acionado a una condición g<strong>en</strong>ética (plantas<strong>de</strong> cordillera) o a la pres<strong>en</strong>cia <strong>de</strong> algún patóg<strong>en</strong>o.La imposibilidad <strong>de</strong> florecer <strong>de</strong> los tetraploi<strong>de</strong>s fue <strong>el</strong> principal problema <strong>en</strong>fr<strong>en</strong>tado, y éste notuvo solución.Lam<strong>en</strong>tablem<strong>en</strong>te, no se pudo analizar los bulbos con resonancia magnética. El Laboratorio d<strong>el</strong>a Universidad Católica, altam<strong>en</strong>te especializado, don<strong>de</strong> se veían muestras <strong>de</strong> difer<strong>en</strong>tesespecies animales y vegetales, no obtuvo “señal” <strong>de</strong> bulbo, probando durante varias horas <strong>en</strong> 2oportunida<strong>de</strong>s, una <strong>de</strong> <strong>el</strong>las con <strong>el</strong> equipo d<strong>el</strong> proyecto pres<strong>en</strong>te.Informe Técnico y <strong>de</strong> Gestión Final 77
Proyecto BID-PI-C-2001-1-A-071“<strong>Aplicaciones</strong> biotecnológicas <strong>en</strong> <strong>el</strong> mejorami<strong>en</strong>to g<strong>en</strong>ético <strong>de</strong> especies <strong>de</strong> Rhodophialachil<strong>en</strong>asEl análisis interno d<strong>el</strong> bulbo mediante Resonancia Magnética, era <strong>el</strong> único medio que noshabría servido para ver si se formaban yemas florales d<strong>en</strong>tro <strong>de</strong> los individuos tetraploi<strong>de</strong>s. Laotra forma es abri<strong>en</strong>do los bulbos, pero obviam<strong>en</strong>te se dañan.No se logró realizar <strong>el</strong> último experim<strong>en</strong>to <strong>de</strong> poscosecha con flores <strong>de</strong> R. spl<strong>en</strong>d<strong>en</strong>s, porque lafecha <strong>de</strong> floración se ad<strong>el</strong>antó con respecto a años anteriores, se estimó que si hubiéramos idouna semana antes habríamos <strong>en</strong>contrado sufici<strong>en</strong>te material. Fue una lástima; se recorrió unpredio un predio particular <strong>de</strong> la VI Región y la cercanías <strong>de</strong> Radal 7 tazas, <strong>en</strong> ambos lugaresla floración se ad<strong>el</strong>antó.7. Difusión <strong>de</strong> los resultados obt<strong>en</strong>idosComo una actividad <strong>de</strong> difusión d<strong>el</strong> proyecto se recibió la visita <strong>de</strong> grupos <strong>de</strong> estudiantes <strong>de</strong>difer<strong>en</strong>tes colegios, <strong>de</strong> <strong>en</strong>señanza básica y media.En <strong>el</strong> mes <strong>de</strong> octubre <strong>de</strong> 2006 se recibió la visita <strong>de</strong> alumnos por medio d<strong>el</strong> programa Explora,pert<strong>en</strong>eci<strong>en</strong>tes a los colegios Liceo <strong>de</strong> Yerbas Bu<strong>en</strong>as y ODESSA <strong>de</strong> Camarico.Durante estas visitas (Figura 4.14) se explicó a los alumnos los objetivos y activida<strong>de</strong>s d<strong>el</strong>proyecto, a<strong>de</strong>más se les <strong>en</strong>tregó un impreso a color con un resum<strong>en</strong>, <strong>el</strong> cual se adjunta <strong>en</strong> <strong>el</strong>Anexo 1.Figura 4.14 Alumnos durante visita alInverna<strong>de</strong>ro <strong>de</strong> la estaciónexperim<strong>en</strong>talA fines <strong>de</strong> octubre <strong>de</strong> 2006 <strong>el</strong> equipo técnico d<strong>el</strong> proyecto participó <strong>en</strong> <strong>el</strong> curso “Basesfisiológicas para <strong>el</strong> Cultivo <strong>de</strong> flores bulbosas”, realizado <strong>en</strong> Trailanqui y organizado por INIACarillanca con apoyo <strong>de</strong> la Fundación para la Innovación Agraria. Se pres<strong>en</strong>taron los avances<strong>en</strong> <strong>el</strong> estudio <strong>de</strong> la fisiología <strong>de</strong> las especies <strong>de</strong> Rhodophiala <strong>en</strong> estudio, junto con laspres<strong>en</strong>taciones <strong>de</strong> colegas <strong>de</strong> otras universida<strong>de</strong>s <strong>de</strong> nuestro país.Fue una experi<strong>en</strong>cia muy positiva para <strong>el</strong> equipo d<strong>el</strong> proyecto. Tuvimos la oportunidad <strong>de</strong>interactuar e intercambiar opiniones y experi<strong>en</strong>cias con otros investigadores y sobre todo t<strong>en</strong>erla oportunidad <strong>de</strong> recibir i<strong>de</strong>as <strong>de</strong> parte <strong>de</strong> investigadores tan <strong>de</strong>stacados como August DeHertogh, Marc<strong>el</strong> Le Nard y Rina Kam<strong>en</strong>etski, lo cual es un gran aporte para <strong>el</strong> <strong>de</strong>sarrollo <strong>de</strong>Informe Técnico y <strong>de</strong> Gestión Final 78
Proyecto BID-PI-C-2001-1-A-071“<strong>Aplicaciones</strong> biotecnológicas <strong>en</strong> <strong>el</strong> mejorami<strong>en</strong>to g<strong>en</strong>ético <strong>de</strong> especies <strong>de</strong> Rhodophialachil<strong>en</strong>asnuestra investigación. Cabe <strong>de</strong>stacar la opinión <strong>de</strong> Rina Kanemetski, <strong>en</strong> ord<strong>en</strong> a que <strong>el</strong>laconsi<strong>de</strong>ra que <strong>el</strong> género Rhodophiala ti<strong>en</strong>e un gran pot<strong>en</strong>cial, y que nuestro proyecto, <strong>en</strong>g<strong>en</strong>eral, va muy bi<strong>en</strong> <strong>en</strong>caminado. Señaló que <strong>en</strong> esta etapa <strong>de</strong>beríamos contactar a unaempresa <strong>de</strong> otro país (Holanda, Estados Unidos u otro) que pueda g<strong>en</strong>erar <strong>de</strong>manda <strong>de</strong> bulbospara forzado y eso haría que productores chil<strong>en</strong>os se <strong>en</strong>cargu<strong>en</strong> <strong>de</strong> cultivarlos.En <strong>el</strong> Anexo 2 se pres<strong>en</strong>ta la pres<strong>en</strong>tación d<strong>el</strong> proyecto que fue pres<strong>en</strong>tado durante este curso.En diciembre <strong>de</strong> 2007 se realizó <strong>en</strong> Talca <strong>el</strong> 2º Simposio <strong>de</strong> Horticultura Ornam<strong>en</strong>tal, <strong>en</strong> estaoportunidad la coordinación estuvo a cargo d<strong>el</strong> equipo técnico d<strong>el</strong> proyecto <strong>en</strong>cabezado por laProf. Flavia Schiappacasse, se recibieron trabajos <strong>de</strong> <strong>de</strong>stacados investigadores nacionales yse contó con las confer<strong>en</strong>cias <strong>de</strong> la Prof. Nina Bassuk especialista <strong>en</strong> Agricultura Urbana <strong>de</strong> laUniversidad <strong>de</strong> Corn<strong>el</strong>l, d<strong>el</strong> Prof. Mark Bridg<strong>en</strong>, especialista <strong>en</strong> mejorami<strong>en</strong>to g<strong>en</strong>ético <strong>de</strong>Alstroemeria <strong>de</strong> la Universidad <strong>de</strong> Corn<strong>el</strong>l y Paola Yañez, especialista <strong>en</strong> floricultura <strong>de</strong> laUniversidad <strong>de</strong> Shizuoka. En la oportunidad se pres<strong>en</strong>taron 2 posters cuyos resúm<strong>en</strong>es seadjuntan <strong>en</strong> <strong>el</strong> Anexo 3.APLICACIONES BIOTECNOLÓGICAS EN EL MEJORAMIENTO GENÉTICODE ESPECIES DE RHODOPHIALA CHILENASSchiappacasse, F. 1 , Peñailillo, P. 2 , Basoalto, A. 1 , Seemann, P. 3 , Rieg<strong>el</strong>, R. 3 , Muñoz, M., 3 Jara,G. 3 y Durán, C. 31 Facultad <strong>de</strong> Ci<strong>en</strong>cias Agrarias, Universidad <strong>de</strong> Talca. 2 Instituto <strong>de</strong> Biología Vegetal yBiotecnología.3 Instituto <strong>de</strong> Producción y Sanidad Vegetal, Universidad Austral <strong>de</strong> Chile.IntroducciónLas especies pert<strong>en</strong>eci<strong>en</strong>tes al género Rhodophiala son plantas bulbosas nativas <strong>de</strong> Chile,Bolivia, Arg<strong>en</strong>tina y Uruguay. En nuestro país se distribuy<strong>en</strong> <strong>de</strong>s<strong>de</strong> la III Región a la X Región.Son plantas que produc<strong>en</strong> hermosas flores, <strong>de</strong> colores que van <strong>de</strong>s<strong>de</strong> <strong>el</strong> blanco puro al rojoint<strong>en</strong>so, y pose<strong>en</strong> un órgano <strong>de</strong> almac<strong>en</strong>ami<strong>en</strong>to subterráneo (bulbo), que les permitepermanecer <strong>en</strong> estado <strong>de</strong> dormancia o reposo cuando las condiciones <strong>de</strong> humedad otemperatura no son a<strong>de</strong>cuadas.El gran valor ornam<strong>en</strong>tal que pose<strong>en</strong> estas especies ha llevado a investigadores <strong>de</strong> dosc<strong>en</strong>tros <strong>de</strong> estudios a <strong>de</strong>sarrollar <strong>en</strong> conjunto y con apoyo <strong>de</strong> la Fundación para la InnovaciónAgraria un proyecto para estudiarlas.Durante 6 años se han realizado diversos estudios con <strong>el</strong> fin <strong>de</strong> conocer las característicasg<strong>en</strong>éticas <strong>de</strong> estas especies para iniciar estudios <strong>de</strong> mejorami<strong>en</strong>to. También se han evaluadométodos para <strong>el</strong> crecimi<strong>en</strong>to rápido <strong>de</strong> bulbos y estudios <strong>de</strong> morfología y fisiología <strong>de</strong> lasespecies.Entre los objetivos d<strong>el</strong> proyecto están: <strong>de</strong>terminación <strong>de</strong> cariotipos; <strong>el</strong>aboración <strong>de</strong> un protocolopara inducción <strong>de</strong> poliploidía; evaluación d<strong>el</strong> grado <strong>de</strong> poliploidía logrado; multiplicación <strong>de</strong>material in vitro; evaluación <strong>de</strong> métodos <strong>de</strong> crecimi<strong>en</strong>to rápido <strong>de</strong> bulbos; evaluación <strong>de</strong>poliploi<strong>de</strong>s; fisiología <strong>de</strong> las plantas, receso y morfogénesis floral.Materiales y MétodosBulbos <strong>de</strong> las difer<strong>en</strong>tes especies, prov<strong>en</strong>i<strong>en</strong>tes <strong>de</strong> un proyecto FIA anterior, recolectados <strong>en</strong>terr<strong>en</strong>o, prov<strong>en</strong>i<strong>en</strong>tes <strong>de</strong> almácigos y prov<strong>en</strong>i<strong>en</strong>tes <strong>de</strong> cultivo in vitro, y <strong>de</strong> difer<strong>en</strong>tes calibres,se usaron para probar <strong>el</strong> efecto <strong>de</strong> distintas condiciones ambi<strong>en</strong>tales sobre <strong>el</strong> crecimi<strong>en</strong>to yInforme Técnico y <strong>de</strong> Gestión Final 79
Proyecto BID-PI-C-2001-1-A-071“<strong>Aplicaciones</strong> biotecnológicas <strong>en</strong> <strong>el</strong> mejorami<strong>en</strong>to g<strong>en</strong>ético <strong>de</strong> especies <strong>de</strong> Rhodophialachil<strong>en</strong>as<strong>de</strong>sarrollo <strong>de</strong> las plantas. Durante varias temporadas se evaluó <strong>el</strong> efecto <strong>de</strong> la luz, d<strong>el</strong> calorbasal y la temperatura d<strong>el</strong> aire, a<strong>de</strong>más <strong>de</strong> la f<strong>en</strong>ología pres<strong>en</strong>tada <strong>en</strong> cultivo. Anualm<strong>en</strong>teestos bulbos fueron cosechados y calibrados para posteriorm<strong>en</strong>te ser utilizados <strong>en</strong> losexperim<strong>en</strong>tos.Para <strong>de</strong>terminar <strong>el</strong> efecto <strong>de</strong> la luz se cultivaron plantas bajo difer<strong>en</strong>tes regím<strong>en</strong>es <strong>de</strong>iluminación, usando primero (año 2002) ampolletas incan<strong>de</strong>sc<strong>en</strong>tes <strong>en</strong> tratami<strong>en</strong>tos con luznatural, luz natural + artificial, interrupción nocturna y luz suplem<strong>en</strong>taria y posteriorm<strong>en</strong>te (año2003) luces fluoresc<strong>en</strong>tes <strong>en</strong> tratami<strong>en</strong>tos con y sin luz, registrándose <strong>el</strong> diámetro y peso <strong>de</strong> losbulbos al final d<strong>el</strong> periodo.Para <strong>de</strong>terminar <strong>el</strong> efecto <strong>de</strong> la temperatura estival se establecieron bulbos <strong>de</strong> 4 especies ydifer<strong>en</strong>tes tamaños <strong>en</strong> los inverna<strong>de</strong>ros d<strong>el</strong> Campus Lircay (v<strong>en</strong>tilación natural) y <strong>de</strong> la E.E.Panguilemo (<strong>en</strong>friami<strong>en</strong>to d<strong>el</strong> aire <strong>en</strong> verano), registrándose periódicam<strong>en</strong>te <strong>el</strong> número <strong>de</strong>hojas.Para <strong>de</strong>terminar <strong>el</strong> efecto d<strong>el</strong> calor basal, bulbos <strong>de</strong> las difer<strong>en</strong>tes especies fueron cultivados<strong>en</strong> cama cali<strong>en</strong>te durante 6 meses <strong>en</strong> sustrato a 22°C constante y a temperatura ambi<strong>en</strong>te. Alfinal d<strong>el</strong> periodo se registraron diámetro y peso <strong>de</strong> bulbos, y número <strong>de</strong> hojas <strong>de</strong> cada planta.Para realizar los estudios f<strong>en</strong>ológicos, bulbos <strong>de</strong> 4 especies <strong>de</strong> difer<strong>en</strong>tes calibres fueronestablecidos <strong>en</strong> los inverna<strong>de</strong>ros d<strong>el</strong> Campus Lircay y E.E Panguilemo y se registraron fechas<strong>de</strong> aparición <strong>de</strong> hojas, floración e inicio d<strong>el</strong> receso.Se realizaron cruzami<strong>en</strong>tos <strong>en</strong>tre las especies pert<strong>en</strong>eci<strong>en</strong>tes al proyecto e incorporando otrasespecies <strong>de</strong> Rhodophiala y la especie Phyc<strong>el</strong>la australis (<strong>de</strong> la misma familia). Las floresmaduras a punto <strong>de</strong> abrir fueros emasculadas, si<strong>en</strong>do polinizadas al mom<strong>en</strong>to <strong>de</strong> <strong>en</strong>contrarsereceptivo <strong>el</strong> estigma.El pol<strong>en</strong> recolectado fue almac<strong>en</strong>ado a 5°C <strong>en</strong> cápsulas <strong>de</strong> vidrio, si<strong>en</strong>do previam<strong>en</strong>te<strong>de</strong>shidratado con g<strong>el</strong> <strong>de</strong> sílice, <strong>de</strong>bi<strong>en</strong>do ser rehidratado para su utilización.Los estudios <strong>de</strong> morfogénesis floral se realizaron a través <strong>de</strong> la disección periódica <strong>de</strong>bulbos tomados d<strong>el</strong> ambi<strong>en</strong>te natural.ResultadosCon <strong>el</strong> uso <strong>de</strong> luces fluoresc<strong>en</strong>tes <strong>el</strong> año 2003 se logró aum<strong>en</strong>tar <strong>el</strong> diámetro y <strong>el</strong> número <strong>de</strong>hojas <strong>en</strong> R. bagnoldii y <strong>el</strong> peso <strong>de</strong> los bulbos <strong>en</strong> R. spl<strong>en</strong>d<strong>en</strong>s.Con <strong>el</strong> uso <strong>de</strong> calor basal, <strong>el</strong> peso d<strong>el</strong> bulbo aum<strong>en</strong>tó significativam<strong>en</strong>te <strong>en</strong> R. spl<strong>en</strong>d<strong>en</strong>s, R.bagnoldii y R. montana, también se registró un aum<strong>en</strong>to significativo d<strong>el</strong> diámetro <strong>en</strong> R.bagnoldii y R. montana. El número <strong>de</strong> hojas no se afectó significativam<strong>en</strong>te.Los registros <strong>de</strong> f<strong>en</strong>ología <strong>en</strong> <strong>el</strong> ambi<strong>en</strong>te natural, muestran que las especies <strong>de</strong> cordillera (R.montana, R. spl<strong>en</strong>d<strong>en</strong>s y R. rhodolirion) pres<strong>en</strong>tan floración estival <strong>en</strong>tre diciembre y <strong>en</strong>ero, yun receso estival posterior a ésta, reactivándose con las primeras lluvias.Por otra parte las especies d<strong>el</strong> <strong>de</strong>sierto (R. bagnoldii y R. ananuca) pres<strong>en</strong>tan floraciónprimaveral y receso estival.Bajo cultivo, las épocas <strong>de</strong> floración son similares a las d<strong>el</strong> ambi<strong>en</strong>te natural, sin embargo, R.bagnoldii y R. montana han florecido <strong>en</strong> distintas épocas d<strong>el</strong> año.Los estudios morfológicos mostraron que los tallos florales se dispon<strong>en</strong> <strong>en</strong> línea <strong>en</strong> <strong>el</strong> planomedio d<strong>el</strong> bulbo y emerg<strong>en</strong> alternadam<strong>en</strong>te. Todas las escamas son bases <strong>de</strong> hojas y cada 3escamas hay un resto <strong>de</strong> tallo floral protegido por una escama semi<strong>en</strong>vainadora. Se formandos infloresc<strong>en</strong>cias por año, las cuales emerg<strong>en</strong> <strong>en</strong> la temporada sigui<strong>en</strong>te. Los bulbos hijos seforman <strong>en</strong>tre un resto <strong>de</strong> tallo floral y una escama semi<strong>en</strong>vainadoraEn la Universidad Austral <strong>de</strong> Chile se han logrado establecer los cariotipos <strong>de</strong> las especies <strong>en</strong>estudio, a<strong>de</strong>más, se han obt<strong>en</strong>ido plantas tetraploi<strong>de</strong>s <strong>de</strong> R. spl<strong>en</strong>d<strong>en</strong>s y R. montana, que seestán cultivando <strong>en</strong> <strong>el</strong> inverna<strong>de</strong>ro <strong>de</strong> la E/E Panguilemo.Informe Técnico y <strong>de</strong> Gestión Final 80
Proyecto BID-PI-C-2001-1-A-071“<strong>Aplicaciones</strong> biotecnológicas <strong>en</strong> <strong>el</strong> mejorami<strong>en</strong>to g<strong>en</strong>ético <strong>de</strong> especies <strong>de</strong> Rhodophialachil<strong>en</strong>asConclusionesLas plantas pres<strong>en</strong>tan mejor comportami<strong>en</strong>to con temperaturas no extremas y un crecimi<strong>en</strong>tomás rápido con calor basal.La fecha <strong>de</strong> floración no cambia al cultivar las plantas <strong>en</strong> inverna<strong>de</strong>ro, a<strong>de</strong>más R. montana y R.bagnoldii han mostrado distintas fechas <strong>de</strong> floración.Los bulbos florales forman dos yemas florales por añoExiste una alta compatibilidad intraespecífica y con <strong>el</strong> género Phyc<strong>el</strong>la.Informe Técnico y <strong>de</strong> Gestión Final 81
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El bulbo tretraploi<strong>de</strong> <strong>de</strong> R. spl<strong>en</strong>d<strong>en</strong>s que se <strong>en</strong>cu<strong>en</strong>tra <strong>en</strong> la Estación Experim<strong>en</strong>talcontinuó <strong>de</strong>sarrollando hojas <strong>en</strong> forma cíclica al igual que los otros bulbos <strong>de</strong> R.spl<strong>en</strong>d<strong>en</strong>s, pero no floreció a pesar <strong>de</strong> t<strong>en</strong>er calibre floral. Lo mismo sucedió con lostetraploi<strong>de</strong>s <strong>de</strong> R. montana. Se sabe que <strong>en</strong> algunos casos los bulbos tetraploi<strong>de</strong>stardan más tiempo <strong>en</strong> alcanzar la madurez para florecer. En este caso ya llevan dosaños <strong>de</strong> retraso con respecto a plantas diploi<strong>de</strong>s, aproximadam<strong>en</strong>te. Cabe <strong>de</strong>stacar quealgunas especies son <strong>de</strong> cordillera, <strong>en</strong> las cuales incluso la floración <strong>de</strong> plantasdiploi<strong>de</strong>s no se logra pl<strong>en</strong>am<strong>en</strong>te <strong>en</strong> Cultivo. El uso <strong>de</strong> calefacción d<strong>el</strong> sustrato mostró t<strong>en</strong>er un efecto sobre <strong>el</strong> crecimi<strong>en</strong>to <strong>de</strong> losbulbos, <strong>en</strong> experim<strong>en</strong>tos <strong>de</strong>sarrollados <strong>en</strong> la primera parte d<strong>el</strong> proyecto, sin embargo,<strong>en</strong> <strong>el</strong> experim<strong>en</strong>to realizado durante la ext<strong>en</strong>sión, <strong>el</strong> uso <strong>de</strong> difer<strong>en</strong>tes tratami<strong>en</strong>tos <strong>de</strong>calefacción durante <strong>el</strong> Cultivo <strong>de</strong> bulbillos prov<strong>en</strong>i<strong>en</strong>tes <strong>de</strong> semilla, mostró no t<strong>en</strong>er unainflu<strong>en</strong>cia significativa sobre <strong>el</strong> crecimi<strong>en</strong>to <strong>de</strong> los bulbos, medido como aum<strong>en</strong>to <strong>en</strong>calibre y <strong>en</strong> peso, excepto <strong>en</strong> R. spl<strong>en</strong>d<strong>en</strong>s, <strong>en</strong> la cual, se obtuvo mayores diámetros alutilizar calefacción sólo <strong>de</strong> la parte aérea o sólo d<strong>el</strong> sustrato. En Rhodophiala sp. (Putú) con plantaciones más tardías se logró que las plantasflorecieran <strong>en</strong> m<strong>en</strong>os días, indicando que hay un factor ambi<strong>en</strong>tal no estudiado quegatilla la floración, posiblem<strong>en</strong>te largo d<strong>el</strong> día o temperatura o bi<strong>en</strong> la combinación <strong>de</strong>ambos. Las características florales no se vieron afectadas, a excepción d<strong>el</strong> largopromedio <strong>de</strong> vara, que <strong>en</strong> bulbos cultivado cerca <strong>de</strong> la fu<strong>en</strong>te <strong>de</strong> calor fue mayor paralas fechas <strong>de</strong> plantación más tempranas. Las plantas prov<strong>en</strong>i<strong>en</strong>tes <strong>de</strong> cultivo in vitro <strong>de</strong> R. spl<strong>en</strong>d<strong>en</strong>s colocadas <strong>en</strong> tún<strong>el</strong> <strong>de</strong>gradi<strong>en</strong>te térmico no sobrevivieron. En g<strong>en</strong>eral, hubo problemas <strong>de</strong> sobreviv<strong>en</strong>cia d<strong>el</strong>os bulbos prov<strong>en</strong>i<strong>en</strong>tes <strong>de</strong> Cultivo in vitro, aunque hubieran sido aclimatados, <strong>en</strong> todaslas especies. Los <strong>de</strong> mejor comportami<strong>en</strong>to fueron los <strong>de</strong> R. montana, que sobrevivieron<strong>en</strong> alto porc<strong>en</strong>taje e incluso algunos <strong>de</strong> <strong>el</strong>los florecieron. En <strong>el</strong> experim<strong>en</strong>to realizado con bulbos <strong>de</strong> Alto Pangue se vio que <strong>el</strong> único tratami<strong>en</strong>toque no floreció fue aqu<strong>el</strong> <strong>en</strong> que los bulbos fueron almac<strong>en</strong>ados a 5ºC por 3 meses; alparecer, esta especie no requirió frío, florece más con temperatura altas; <strong>el</strong> tratami<strong>en</strong>toque más floreció fue <strong>el</strong> <strong>de</strong> los bulbos tratados a 20ºC por 1 mes. El uso <strong>de</strong> soluciones azucaradas para la mant<strong>en</strong>ción permite alargar la vida útil <strong>de</strong> lasvaras florales <strong>de</strong> R. montana, <strong>en</strong> casi dos días con respecto a conservar las varas sólo<strong>en</strong> agua, <strong>el</strong> uso <strong>de</strong> un acidificante <strong>en</strong> la solución, también ayuda a la conservación d<strong>el</strong>as varas. Los tratami<strong>en</strong>tos <strong>de</strong> pulsado utilizados no tuvieron un efecto claro sobre la vida <strong>de</strong>florero <strong>de</strong> las varas, provocando una rápida apertura <strong>de</strong> las mismas y llegando ésta a unvaltor máximo <strong>de</strong> 5,5 días.Informe Técnico y <strong>de</strong> Gestión Final 83
Proyecto BID-PI-C-2001-1-A-071“<strong>Aplicaciones</strong> biotecnológicas <strong>en</strong> <strong>el</strong> mejorami<strong>en</strong>to g<strong>en</strong>ético <strong>de</strong> especies <strong>de</strong> Rhodophialachil<strong>en</strong>as Con respecto a la floración, <strong>el</strong> comportami<strong>en</strong>to <strong>de</strong> las plantas nunca fue absoluto,, es<strong>de</strong>cir nunca se logró <strong>el</strong> 100% <strong>de</strong> la floración Los bulbos prov<strong>en</strong>i<strong>en</strong>tes <strong>de</strong> cruzami<strong>en</strong>tos realizados durante <strong>el</strong> proyecto han mostradouna bu<strong>en</strong>a sobreviv<strong>en</strong>cia <strong>en</strong> cultivo, se espera que durante la próxima temporadaprimavera-verano puedan florec<strong>en</strong> algunos <strong>de</strong> los que ya ti<strong>en</strong><strong>en</strong> 3 años. En la mayoría <strong>de</strong> las plantas muestreadas <strong>de</strong> R. bagnoldii, R. phyc<strong>el</strong>loi<strong>de</strong>s y R.spl<strong>en</strong>d<strong>en</strong>s se observaron micorrizas, lo cual podría explicar <strong>en</strong> cierto grado sucrecimi<strong>en</strong>to <strong>en</strong> su<strong>el</strong>os pobres como los su<strong>el</strong>os fijadores <strong>de</strong> fósforo <strong>de</strong> la Cordillera <strong>de</strong>Los An<strong>de</strong>s o los su<strong>el</strong>os ar<strong>en</strong>osos d<strong>el</strong> Norte.Informe Técnico y <strong>de</strong> Gestión Final 84