TP Cinetica Enzimatica

Química Biológica I TP: Determinación del Km y Vmax de la sacarasa de levaduraObjetivos:Que el alumno aprenda a seleccionar las condiciones para estudiar la cinética de una reacciónenzimática.Determinar Km y Vmax. de la reacción enzimática.Parte ExperimentalPara hallar los valores de Km y Vamx debemos construir una curva 1/V vs 1/S.La sacarasa es una enzima que cataliza la hidrólisis de la sacarosa en glucosa y fructosa. Lavelocidad de reacción se expresa como concentración de sustrato hidrolizado por minuto, ypara conocer la concentración de sacarosa hidrolizada mediremos la concentración deglucosa liberada.Pesar 0,1 g de levadura, homogeneizarla con 25 ml de solución de EDTA al 1%.Centrifugar el homogenato 5 min. A 3.000 rpm recogiendo el sobrenadante que constituye elextracto enzimático.Preparar el experimento según el siguiente esquema:Tubo Ez AcNa EDTA(ml) (ml) (ml)SACAROSA ml0,2 M 0,15 M 0,1 M 0,05 M 0,025 M 0,01 Mbco ------ 1,5 1,5 --- --- --- --- --- ---1 0,5 1,5 --- 1 --- --- --- --- ---2 0,5 1,5 --- --- 1 --- --- --- ---3 0,5 1,5 --- --- --- 1 --- --- ---4 0,5 1,5 --- --- --- --- 1 --- ---5 0,5 1,5 --- --- --- --- --- 1 ---6 0,5 1,5 --- --- --- --- --- --- 1AcNa: buffer acetato de sodio 0,1 M pH 4,7¨Preparar un estándar de forma similar al blanco más 20 ul de una solución de glucosa 1 g/lDejar los tubos 10 minutos a 25 °C y luego agregar 2 ml de reactivo de trabajo paracuantificar glucosa.Incubar en baño a 37°C por 15 minutos y leer a 505 nm llevando a cero con el reactivo detrabajo.El fundamento de la reacción se ejemplifica en la siguiente reacción:Glucosa + O2 + H2O -----GOD----- Acido glucónico + H2O2

2 H2O2 + fenol + 4-AF -----POD----- quinoneimina + 4 H2OLa quinoneimina ES um cromógeno rojo com um pico máximo de absorción a 505 nm.El reactivo de trabajo es una mezcla de las enzimas GOD y POD, 4- aminofenazona, fenol yun buffer fosfato pH 7.