(SLP): aplicación del FISH en LLC y MM
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unUniversidad de NavarraDiagnóstico citog<strong>en</strong>éticog<strong>en</strong>ético de <strong>LLC</strong> y <strong>MM</strong>II REUNIONANUAL
unUniversidad de Navarra1. Establecer un protocolo de trabajo para el estudio g<strong>en</strong>ético demuestras de <strong>LLC</strong> al diagnóstico• determinar el tipo de muestra óptimo para el cultivo• desarrollar un <strong>en</strong>sayo multi-<strong>FISH</strong>• optimizar la técnica de detección de mutaciones <strong>en</strong> losg<strong>en</strong>es IgV H
CariotiposSPSP + TPAMOMO + TPA50,0%23,5%32,5%3,0%NuloNormalAlteradounUniversidad de Navarra
unUniversidad de NavarraB.Ensayo Multi-<strong>FISH</strong>CEP 12 DNA Probe KitRP11-199F11 y RP11-241D13(TP53)(ATM)LSI D13S25
Trisomía 12 <strong>del</strong>(11)(q22.3) <strong>del</strong>(13)(q14.3)ABCD E FunUniversidad de Navarra
unUniversidad de NavarraC.Hipermutación somática1. Obt<strong>en</strong>ción de cDNA2. Amplificación g<strong>en</strong>es IgV H3. Purificación PCRVH3+4. Secu<strong>en</strong>ciación 5. Id<strong>en</strong>tificación <strong>del</strong> segm<strong>en</strong>to reord<strong>en</strong>ado yanálisishttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast98% de homología
unUniversidad de NavarraANALISIS GENETICO EN PACIENTES CON <strong>LLC</strong>En la práctica……...
unUniversidad de NavarraNUEVA MUESTRA AL DIAGNÓSTICOMuestra de SP recogidasobre heparinaMuestra de SP recogidasobre EDTACULTIVO DE SPESTIMULADO CON TPAEXTRACCIÓN DE PBLsCARIOTIPODETECCIÓN DE HIPERMUTACIÓNSOMÁTICA GENES IgV HMULTI-<strong>FISH</strong> EN CÉLULAS FIJADASDEL CULTIVO ESTIMULADO
unUniversidad de NavarraINFORME <strong>FISH</strong>SONDAS UTILIZADAS:p53 (17p13.1) (Sonda no comercial)ATM (11q22.3) (Sonda no comercial)CEP 12 (c<strong>en</strong>trómero12) (Vysis)LSI D13S25 (13q14.3) (Vysis)RESULTADOS:200 núcleos <strong>en</strong> interfase de muestra <strong>del</strong> paci<strong>en</strong>te,para cada sonda,<strong>del</strong>(17)(p13) negativo<strong>del</strong>(11)(q22.3) 57% con <strong>del</strong>ecióntrisomía 12 negativo<strong>del</strong>(13)(q14) x2 44% <strong>del</strong>eción homocigótica<strong>del</strong>(13)(q14) 46,5% <strong>del</strong>eción heterocigótica
unUniversidad de NavarraINFORME HIPERMUTACIÓNTÉCNICA:(Hamblin, et al Blood.1999; 94:1848-1854)RESULTADO:MONOCLONALFamilia: 3Segm<strong>en</strong>to: 09Porc<strong>en</strong>taje: 100% de homologíaNO MUTADO
unUniversidad de NavarraINFORME HIPERMUTACIÓNTÉCNICA:(Hamblin, et al Blood.1999; 94:1848-1854)RESULTADO:MONOCLONALFamilia: 4Segm<strong>en</strong>to: 04Porc<strong>en</strong>taje: 90,63% de homologíaMUTADO
unUniversidad de NavarraDiagnóstico g<strong>en</strong>ético <strong>del</strong><strong>MM</strong>
El curso clínico está determinado por ev<strong>en</strong>tosg<strong>en</strong>éticos de las células tumorales……….unUniversidad de NavarraDiagnóstico g<strong>en</strong>ético <strong>del</strong><strong>MM</strong>(por el mom<strong>en</strong>to utilizamoscariotipo y/o <strong>FISH</strong>)El diagnóstico con arraystodavía no es utilizado <strong>en</strong> larutina
Diagnóstico citog<strong>en</strong>ético <strong>del</strong> <strong>MM</strong>MOHeparinaCariotipounUniversidad de Navarra
unUniversidad de NavarraConv<strong>en</strong>tional Chromosome Analysisin Multiple Myeloma
Conv<strong>en</strong>tional Chromosome Analysisin Multiple Myeloma70%Normal karyotypeDepartm<strong>en</strong>t ofG<strong>en</strong>eticsUniversity ofNavarraInstitut fürHumang<strong>en</strong>etikunUniversitätsklinikumKielUniversidad de Navarra
un Universidad de Navarra
unUniversidad de NavarraRecomm<strong>en</strong>dations for <strong>FISH</strong> in multiple myelomaLondon on March 11th 2005• It is recomm<strong>en</strong>ded that all labs should test for <strong>del</strong>etion 13, t(11;14)and t(4;14) and include p53 <strong>del</strong>etion wherever possible.• The use of the Abbott/Vysis 5, 9, 15 probe set is <strong>en</strong>couraged to detecthyperdiploidy.
Diagnóstico citog<strong>en</strong>ético <strong>del</strong> <strong>MM</strong>MOHeparinaCariotipoSegún % CPCP >15-20%<strong>FISH</strong> <strong>MM</strong>13qTP53IGH5, 9, 15 probeunUniversidad de Navarra
Diagnóstico citog<strong>en</strong>ético <strong>del</strong> <strong>MM</strong>MOHeparinaCariotipoSegún % CPCP >15-20%<strong>FISH</strong> <strong>MM</strong>t(11;14)(q13;q32) CCND1t(4;14)(p36;q32) FGFR3/<strong>MM</strong>SETt(14;16)(q32;q23) MAFt(14;20)(q11;q32) MAFBt(6;14)(p21;q32) CCND3t(6;14)(p25;q32) IRF4negativonegativopositivo13qTP53IGH5, 9, 15 probet(8;14)(q24;q32) MYCunUniversidad de Navarra
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CariotipoDiagnóstico citog<strong>en</strong>ético <strong>del</strong> <strong>MM</strong>MOHeparinaSegún % CPMOEDTAMACS CPCP 15-20%FICTIONMACSHiperdiploidia<strong>FISH</strong> <strong>MM</strong>13qTP53t(11;14)(q13;q32) CCND1t(4;14)(p36;q32) FGFR3/<strong>MM</strong>SETt(14;16)(q32;q23) MAFt(14;20)(q11;q32) MAFBt(6;14)(p21;q32) CCND3t(6;14)(p25;q32) IRF4negativopositivoIGH5, 9, 15 probet(8;14)(q24;q32) MYCunUniversidad de Navarra
MACS - magnetic cell sortingunUniversidad de NavarraCD138 (Syndecan-1)MicroBeadsfor Plasma CellIsolation
unUniversidad de NavarraDefinir paci<strong>en</strong>tes alto riesgo: cariotipo, <strong>FISH</strong>, GEF,aCGH, B2m, PCLI,)2008 cambio, realismo ?? FUTUROINMEDIATO (definir paci<strong>en</strong>tes dealto riesgo estimado <strong>en</strong> un 25% depaci<strong>en</strong>tes) Clínica Mayo•<strong>FISH</strong> t(4;14),t(14;16) y<strong>del</strong>(17p)•Cariotipo paramonosomia/<strong>del</strong> 13q ehipodiploidia
un Universidad de Navarra
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