Universidad Austral de Chile - CyberTesis UACh - Universidad ...

3ÍNDICERESUMEN ...................................................................................................................................... 6SUMMARY ..................................................................................................................................... 71. INTRODUCCIÓN ...................................................................................................................... 81.1. Salmonicultura ......................................................................................................................... 81.2. Polímeros ................................................................................................................................ 121.3. Polímeros solubles en agua ................................................................................................... 131.4. Interacciones electrostáticas de largo y corto alcance entre polielectrólitos y suscontraiones aromáticos. Interacciones aromáticas-aromáticas ............................................... 141.5. Interacción entre poli(4-estirensulfonato de sodio) y rodamina 6G. ................................ 171.6. Microencapsulación ............................................................................................................... 201.7. Microcápsulas de alginato .................................................................................................... 221.8. Microcápsulas de alginato-quitosano .................................................................................. 282. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA ............................................................................... 322.1. Hipótesis de trabajo ............................................................................................................... 342.2. Objetivo general ..................................................................................................................... 342.3. Objetivos específicos .............................................................................................................. 343. MATERIAL Y MÉTODOS ..................................................................................................... 36

10La exitosa industria salmonera chilena no ha estado exenta de problemas. Debido a la faltade tecnificación del proceso y alta densidad de crianza de peces, se han desarrolladoenfermedades bacterianas, parasitarias y virales que han provocado grandes mortalidades depeces, llevándola en el año 2007 a una gran crisis sanitaria.Por otra parte, la salmonicultura ha provocado diferentes impactos en el ambiente marino.La producción intensiva por parte de la industria salmonera provoca una introducciónconsiderable de materia orgánica al ambiente marino, por medio de las materias fecales de losorganismos en cautiverio y el alimento no ingerido por ellos. Una de las consecuencias de estefenómeno es la eutroficación de la columna de agua, influyendo directamente en el aumento de laperiodicidad e intensidad del florecimiento de algas tóxicas 6 . Otra, es la disminución de labiodiversidad bentónica originada por la falta de oxígeno en el sedimento después de la altarespiración bacteriana 3 .El escape de peces es otro de los problemas no solucionados por la salmonicultura. Lossalmones al ser especies de un alto nivel trófico se alimentan de otras especies de peces,crustáceos moluscos, etc. Soto y col. 7 reportaron entre los años 1995 y 1996 un masivo escape desalmones en las regiones X y XI, encontrando que en los lugares donde se presentaban una mayorcaptura de salmones, al mismo tiempo se presentaron bajas capturas de peces nativos y una bajariqueza de especies. Por otra parte, si los salmones escapados presentan enfermedades tantobacterianas como virales, éstas podrían ser transmitidas a las especies nativas.La alimentación de los salmonideos cultivados es esencialmente en base a harina y aceitede pescado. Para producir un kilo de salmón se necesitan 1,2 kilogramos de pellet, lo queequivale a pescar entre 3 y 4 Kg de peces. No obstante, esta relación puede aumentar hasta 10 Kg

11si se considera que el elemento limitante es el aceite y no la harina de pescado 2 . Por lo tanto, laalta producción salmonera provoca una fuerte presión de pesca sobre los bancos naturales depeces, contribuyendo a la sobreexplotación y agotamiento de ellos.La utilización de antibióticos en la salmonicultura, ya sea con fines preventivos(profilácticos) o como tratamiento directo de los casos activos de enfermedades, trae comoresultado un impacto negativo sobre la comunidad bacteriana que cumple variadas funciones enel ciclo biogeoquímico de la columna de agua y fondo marino. La principal consecuencia es laformación de bacterias resistentes a diversos antibióticos de amplio espectro. Los genes quemedian esta resistencia pueden ser traspasados de bacterias acuáticas a otras que son capaces deproducir infecciones en humanos. Es más, se han encontrado antibióticos residuales en carne desalmón proveniente de cultivos, los que también pueden provocar resistencia en bacterias deambientes muy distintos y que son capaces de producir infecciones en humanos. Por lo tanto, eluso indiscriminado de antibióticos, además de ser perjudicial para el medio ambiente, puede traerconsecuencias graves a la salud de la población humana aumentando la cantidad de infeccionesagudas causadas por bacterias resistentes, trayendo consigo un aumento del gasto público ensalud, debido al elevado costo del tratamiento y prevención de estas patologías 8,9 .La alta producción de la industria salmonera en Chile depende directamente de la buenascondiciones ambientales marinas existes en nuestro país. Entonces, es necesario buscar una formade cultivo que sea sustentable ambientalmente en el tiempo y que tenga la capacidad de noafectar directa o indirectamente el desarrollo de otros sectores productivos marinos.Es por esto que nosotros apuntamos al desarrollo de microestructuras poliméricas quetengan la característica de ser naturales, de bajo precio, biocompatibles y biodegradables, para

12suministrar nutrientes que no necesariamente sean de origen animal, para poder ir reduciendo lapresión pesquera hacia los recursos marinos que son utilizados en la alimentación de peces encautiverio. Además, estas estructuras pueden ser empleadas como vacunas orales para proveerantígenos a los peces en cautiverio con el fin de aumentar su capacidad inmunogénica. De estamanera puede ser posible reducir el uso de antibióticos, lo que a largo o mediano plazo permitirámejorar la sustentabilidad del ambiente marino, y por tanto el desarrollo de esta industria.1.2. PolímerosLos polímeros (del griego poly, muchos; meros, parte, segmento) son moléculas de altopeso molecular constituidas por una cadena de subunidades repetitivas llamadas monómeros, lasque se extienden a lo largo de la cadena otorgando diferentes propiedades fisicoquímicas a lamolécula 10 . Si el polímero está constituido por monómeros del mismo tipo se denominahomopolímero; por el contrario si el polímero está constituido por diferentes monómeros sedenomina copolímero. En estos últimos las unidades repetidas pueden distribuirse de distintasformas, otorgándole las denominaciones de copolímero en bloque, al azar o en forma alternada.Estos polímeros poseerán propiedades intermedias entre las de los homopolímeros que seformarían a partir de cada monómero por separado o podrán presentar propiedades totalmentenuevas 11 .Existen polímeros naturales, semisintéticos y sintéticos. Los polímeros naturalesprovienen directamente del reino vegetal o animal como por ejemplo polisacáridos, proteínas,ácidos nucleicos, etc. Los polímeros semisintéticos, son el resultado de modificaciones de ciertospolímeros naturales mediante procesos químicos como por ejemplo el quitosano que se produce

13mediante la desacetilación de la quitina (elemento estructural del exoesqueleto de los crustáceos).Los polímeros sintéticos son los que se obtienen por procesos de polimerización controlada apartir de materias primas de bajo peso molecular 10 como por ejemplo poli(vinil sulfonato desodio), poli(4-estirensulfonato de sodio), etc.Los polímeros naturales tienen un amplio espectro de utilización debido a su naturaleza,por tanto son más biocompatibles que los polímeros sintéticos y se obtienen fácilmente.Los polisacáridos naturales (como por ejemplo alginato y carragenina) que presentan lahabilidad de gelificar son utilizados ampliamente en biotecnología para encapsular y transportarmoléculas de alto y bajo peso molecular (por ejemplo drogas, plásmidos, DNA, etc.), células yotros componentes biológicos. Son escogidos en muchas aplicaciones debido a subiocompatibilidad y biodegradibilidad 12 .1.3. Polímeros solubles en aguaUn polímero es soluble en agua cuando posee un total de grupos hidrófilos suficientes a lolargo de su cadena principal o lateral. Estos grupos comprenden principalmente aminas,hidroxilos, grupos carboxílicos y grupos sulfatos 13 . Dentro de los polímeros solubles en aguaencontramos a los polielectrólitos. Estos polímeros se pueden ionizar en medio acuoso perdiendosu contraión (especie química que neutraliza una carga eléctrica complementaria). Dependiendodel tipo de carga de los polielectrólitos, estos pueden ser clasificados como aniónicos, catiónicosy zwitteriónicos. Los polímeros aniónicos son aquellos que se encuentran cargadosnegativamente, los catiónicos son aquellos que se encuentran cargados positivamente y los

14zwitteriónicos son eléctricamente neutros, pero presentan cargas parciales positivas y negativasen átomos diferentes 10 . Las propiedades electroquímicas de un polielectrólito pueden serafectadas por las condiciones del medio, sean éstas temperatura, pH, fuerza iónica y naturalezadel solvente 13 .1.4. Interacciones electrostáticas de largo y corto alcance entre polielectrólitos y suscontraiones aromáticos. Interacciones aromáticas-aromáticasLas interacciones electrostáticas son aquellas que involucran la atracción o repulsión dedos especies con carga neta positiva o negativa. Cuando dos moléculas poseen la misma carga seproduce la repulsión entre ambas. Por el contrario, cuando dos moléculas poseen cargascomplementarias se produce su mutua atracción.Los polielectrólitos en solución presentan interacciones electrostáticas de largo alcancecon su contraión. Según la teoría descrita por Gerald Manning, una alta concentración decontraiones hidratados pueden situarse alrededor de la cadena polimérica. Estos contraiones soncapaces de desplazarse sobre la superficie del polímero y por lo tanto la interacción esconsiderada no sitio-específica. Además, debido a su carácter de atracción de largo alcance, estasinteracciones son altamente dependientes a la fuerza iónica presente en el medio que las contiene,ya que los electrólitos tales como sales inorgánicas son capaces de apantallar la interacción 14,15,16 .Sin embargo, cuando se presentan interacciones electrostáticas de corto alcance como porejemplo puentes de hidrogeno, fuerzas de Van Der Wals o interacciones aromáticas-aromáticas,

15el panorama general de las interacciones entre los polielectrólitos y sus contraiones puedecambiar considerablemente.Para que se produzca una interacción aromática deben estar presentes moléculas queposean grupos aromáticos. Estas moléculas son sistemas con dobles enlace conjugados quecumplen con la regla de Hückel de 4n+2 electrones π (n siendo igual a un número entero), planasy con forma de anillo. La molécula que mejor ejemplifica la estructura de una moléculaaromática y sus tipos de interacciones es el benceno (C 6 H 6 ). Esta molécula es plana, rígida y suestructura es soportada por un esqueleto de enlaces sigma y electrones π que sufre continuoscambios sobre la posición de los dobles enlaces entre carbonos. Por lo tanto, los dobles enlacesdel anillo aromático en realidad no existen, más bien existe una nube de electrones (nube π) quese deslocaliza continuamente entre ambas caras del anillo 13 .Las interacciones aromáticas se pueden producir entre dos moléculas aromáticasgenerándose interacciones tipo π-π (nube pi), o bien entre una molécula aromática y un grupofuncional de otra molécula 10 . Este tipo de interacciones son importantes en el control de laestructura y propiedades de ensamblajes supramoleculares. Son una de las principales fuerzas nocovalentes que gobiernan el reconocimiento molecular y la estructura molecular demacromoléculas biológicas. Son importantes en la estabilización del ADN y su asociación conintercaladores, en la estabilización proteica y funcionalidad proteica como en enzimas y canalestransmembrana 14,15,17,18 .Como ha sido mencionado, las interacciones aromáticas se pueden producir entre dosmoléculas aromáticas mediante interacciones entre nubes π, pero además puede estar involucradoel esqueleto sigma de cada una de las moléculas. En su conjunto se encuentran involucradas dos

16fuerzas: una hidrofóbica y otra electrostática. La interacción de tipo hidrofóbica se produce por larepulsión que la molécula ejerce sobre el agua que la rodea. Por lo tanto, en solucionessuficientemente concentradas las moléculas tienden a agruparse consigo mismas desplazandofinalmente el volumen de agua restante entre ambas. Por otra parte, la interacción de tipoelectrostática se produce entre el esqueleto σ (que posee una carga neta positiva) de una moléculay el orbital π (que posee una carga neta negativa) de la otra lo que permite estabilizar lageometría final de la interacción entre ambas 11 .Los polielectrólitos que poseen grupos funcionales ionizados en solución, como grupossulfonato o maleato, generan interacciones electrostáticas de largo alcance con su contraiónaromático. Debido a que la interacción electrostática de largo alcance permite la movilidad delcontraión sobre el polielectrólito es posible que se produzca la autoagregación de los contraionesaromáticos sobre regiones no específicas del polielectrólito, como es el caso de los tintesxanténicos 14 . Por el contrario, los polielectrólitos que poseen grupos funcionales ionizadossoportados por grupos aromáticos promueven interacciones tipo π-π de corto alcance y laestabilización de pares iónicos con su contraión aromático, produciéndose una interacción muchomás estable sobre lugares específicos de la cadena polimérica, lo que por un lado, produce unamayor dispersión de los contraiones aromáticos (como por ejemplo tintes xanténicos) sobre lasuperficie del polielectrólito, y por otro son más resistencia al efecto de apantallamientoproducido por la fuerza iónica 15 .La dispersión de contraiones aromáticos sobre la superficie de polímeros que presentancaracterísticas de polianión aromático, dependen directamente de la densidad lineal aromática delpolímero (definida como cantidad de grupos aromáticos por unidad de longitud de la cadena

17polimérica), de la flexibilidad del polímero y la concentración relativa entre los contraiones y elpolímero. En una concentración lo suficientemente mayor del polianión aromático encomparación a su contraión aromático, el polímero exhibe una alta habilidad dispersante,produciendo una distribución azarosa de los contraiones 14 . Como ejemplo podemos mencionar elcaso de azul de metileno que en concentraciones mayores a 10 -5 en solución acuosa se presentaprincipalmente como dímeros o agregados de alto orden, mientras que en presencia de 100 vecesmás polímero PSS, éste se desagrega situándose sobre lugares específicos de la superficie delpolímero debido a interacciones ar-ar de corto alcance entre ambas moléculas 16 .1.5. Interacción entre poli(4-estirensulfonato de sodio) y rodamina 6GEl polímero poli(4-estirensulfonato de sodio) (PSS) (Figura 3) es un polielectrólitosintético derivado del petróleo con grupos aromáticos que penden de su cadena principal ysoluble en agua gracias a los grupos sulfonato que penden de cada anillo 10 . Cuando se encuentraen solución, puede interaccionar con moléculas de bajo peso molecular o polímeros con cargasopuestas, con los cuales puede formar complejos interpoliméricos. Una característica importantede este polímero es que puede formar interacciones aromático-aromático de corto alcance concontraiones aromáticos. Este hecho le confiere una alta capacidad para dispersar contraionesaromáticos como los tintes xanténicos una vez que existe un exceso del polímero en la soluciónque los contiene. La consiguiente interacción es de carácter fuerte y es capaz de resistir suapantallamiento o ruptura en presencia de altas concentraciones de fuerza iónica 14,16,18 .

18Figura 3. Polímero sintético poli(4-estirensulfonato de sodio) (PSS).El tinte rodamina 6G (R6G) (Figura 4) es un derivado xanténico de bajo peso molecular 13 ,posee grupos aromáticos, y a pH neutro tiene carga positiva 16 . Su espectro de UV-vis presenta 2bandas: una a los 527 nm llamada banda del monómero; y otra a las 500 nm llamada banda deldimero 18,14 .Figura 4. Tinte xanténico rodamina 6G (R6G).

19Debido a su estructura, el tinte R6G tiende a formar autoagregados en solventes polares.Por tanto, mientras más concentrado se encuentre en solución, mayor será su autoagregación loque provoca la disminución de su fluorescencia. Por otra parte, en solventes orgánicos el tintepermanece desagregado manifestando su máxima capacidad lumínica 13 .La formación de agregados de R6G también se puede observar cuando se produceninteracciones electrostáticas de largo alcance entre él y polianiones. Este es el caso de lainteracción que se produce entre poli(acrilato de sodio) un típico polianión y el tinte. Moreno-Villoslada y col. 18 reportaron que a medida que aumenta la concentración del polímero aumentala formación de agregados del tinte en la superficie del polímero, y por consiguiente ladisminución de su fluorescencia. Además, la interacción que se produce entre el tinte y elpolímero es fácilmente apantallada en presencia de fuerza iónica. Estos mismo autores reportaronel caso contrario cuando este tinte interacciona con PSS que presenta un típico comportamientopolianión aromático. La interacción que se produce entre el polímero y el tinte es aromáticaaromáticade corto alcance, por lo tanto es resistente frente a fuerza iónica, y además cuandoexiste un exceso del polímero (100 veces más concentrado que el tinte) el tinte se distribuyeazarosamente en la superficie del polímero previniendo su autoagregación.Este tinte ha sido utilizado ampliamente en distintas áreas, como por ejemplo en elrevelado forense de huellas dactilares, marcaje celular en técnicas de biología molecular, comomedicamento en la cura del cáncer, en ensayos para la detección de metales pesados en medioacuoso, etc 13 .

201.6. MicroencapsulaciónLa microencapsulación puede ser definida como el proceso de atrapamiento de moléculas,gotas de líquidos o gases dentro de una cubierta inerte para su aislamiento y protección delambiente externo. Esta tecnología es principalmente utilizada para la inmovilización, protección,liberación controlada, estructuración y funcionalización de moléculas con fines específicos 19-21 .El producto resultante del proceso de microencapsulación es denominado microcápsula.En las microcápsulas el principio activo se encuentra incluido en una especie de reservorio(núcleo) recubierto por una membrana compuesta por el material de recubrimiento. Talescápsulas son de tamaño micrométrico, y dependiendo principalmente del material del núcleo ydel proceso de depositación de la cubierta pueden tener forma esférica o irregular. Estasmicrocápsulas pueden ser clasificadas en base a su morfología como microcápsulasmononucleares o polinucleares. Las microcápsulas mononucleares contienen la cubiertaalrededor de un único núcleo, mientras que las polinucleares tienen muchos núcleos al interior dela cubierta 20,22 .Otra de las estructuras utilizadas para la inmovilización de sustancias son lasmicroesferas, en éstas el principio activo se encuentra altamente disperso en una matriz formadapor el material de recubrimiento 20,22 .De aquí en adelante a estos dos tipos de estructuras (microcápsulas o cápsulas ymicroesferas o esferas) se les denominarán microcápsulas.

21Dentro de estas estructuras es posible encapsular desde moléculas pequeñas a moléculasmuy complejas como por ejemplo péptidos, drogas, ADN. También es posible encapsular unamezcla de estás, o estructuras complejas como virus, protoplasma o incluso células biológicascompletas 19 .La abundancia de polímeros naturales y artificiales (por ejemplo etilcelulosa, hidroxipropilmetil celulosa, carboxi metil celulosa de sodio, alginato de sodio, gelatina, poliésteres,quitosano, etc.) proporciona una amplia gama de elección de materiales para las cápsulas. Éstaspuede ser permeable, semipermeable o impermeable. Las cápsulas permeables son usadas paraaplicaciones de liberación, mientras que las cápsulas semipermeables son impermeables almaterial encapsulado, pero permeables a las moléculas de bajo peso molecular que se encuentranen el medio que contiene a las microcápsulas. Las cápsulas impermeables protegen del medioexterno al material encapsulado. En éstas la liberación del material encapsulado debe serrealizada por medio de la ruptura de la cápsula a través de una presión externa, disuelta en undisolvente, o degradada bajo la influencia de la luz 20,21 .La microencapsulación puede ser realizada para 19,21 :Proteger sustancias sensibles al ambiente externo. Cuando se incorporan en lasmicrocápsulas, pueden ser protegidas en cierta medida de las sustancias químicas,acción enzimática, y de las condiciones físico-químicas y mecánicas.Ocultar las propiedades organolépticas de la sustancia como el color, sabor y olor.Obtener una liberación controlada y selectiva de una droga o principio activo. Laencapsulación puede tener el objetivo de limitar la liberación, o en algunos casos paraque sea disponible más rápidamente.

22Aumentar la bioadhesión de sistemas medicamentosos.El manejo seguro de materiales tóxicos.Existen numerosos métodos de microencapsulación. De forma general, podrían serclasificados en químicos, físico-químicos y físico-mecánicos. Como métodos químicos se puedennombrar: polimerización interfacial, polimerización in situ y poli-condensación. Entre losmétodos físicos-químicos se encuentran: coacervación, separación de fase, encapsulación sol-gely microencapsulación supercrítica asistida con CO 2 . Y como físco-mecánicos: secado poratomización y congelación, encapsulación por lecho fluidificado 20,21,22 .1.7. Microcápsulas de alginatoEl alginato (Figura 5) es un polisacárido hidrofílico, de origen natural, que se obtienedesde las algas pardas 23,24 principalmente de Laminaria hyperborean, Ascophyllum nodosum yMacrocystis pyrifera 25 . Otras fuentes incluyen Laminaria japonica, Eclonia máxima, Lesonianegrescens 26 . Posee la característica de ser un copolímero lineal compuesto de β-D-ácidomanurónico (M) y α-L-ácido gulurónico (G) ligados mediante uniones (1,4) 27 . Tiene un grupocarboxilato en cada unidad M o G. Presenta un rango de ionización entre 3.4 a 4.4 dependiendodel tipo de alginato y la sal presente en la mezcla 24 . Es un polielectrólito altamente cargadonegativamente a pH neutro o básico 28 . Es utilizado como ingrediente en productos alimenticios,cosméticos, formulación de fármacos, como agente desintengrante en tabletas, como agenteespesante en geles solubles en agua, y como estabilizador para emulsiones 29,26 .

23Figura 5. Polímero natural alginato (ALG).La gelificación de los alginatos se basa en la afinidad de ellos con ciertos cationesdivalentes 25,27,28 . Cationes monovalentes y Mg 2+ no inducen gelificación 25,26 . La gelificación seproduce por la reacción de los cationes divalentes (por ejemplo calcio) con los gruposcarboxílicos de las cadenas de gulurónico formando una conformación en forma de caja dehuevos (Figura 6), dejando las cadenas de manurónico intactas 27,29,30,31 . Los cationes divalentesse unen a los bloques de acido α-L-gulurónico de manera altamente cooperativa. El tamaño de launidad cooperativa puede ser mayor que 20 monómeros 25 . En sistemas donde el alginato es másrico en ácido gulurónico se forman geles más rígidos que son menos propensos a la hinchazón yerosión 23,27,32 . Son más porosos en comparación con los geles formados con una mayor cantidadde ácido manurónico, y cuando aumenta la concentración de calcio en el medio de formaciónaumenta su porosidad 33 . En sistemas donde el alginato es más rico en ácido manurónico los gelesse comportan de una manera más lábil, son más elásticos, menos porosos y se disuelven másfácilmente 23 .

24Figura 6. Conformación caja de huevos.En microcápsulas de alginato de calcio, las asociaciones intercadena pueden sertemporales o permanentes dependiendo de la cantidad de calcio presente en el sistema. Con bajosniveles de calcio se obtienen asociaciones temporales; al contrario, con altos niveles de calcio seobtienen asociaciones permantes 25 .Las microcápsulas de alginato de calcio son ampliamente estudiadas comotransportadores para la inmovilización de células, enzimas, ADN, proteínas, y para control de laliberación de drogas 23,32,34 , debido a que el alginato es de origen natural, biocompatible, no tóxicoy de relativo bajo costo 23,35 .Cabe destacar, que en administraciones de alginato a través de vía oral no se hanobservado respuestas inmunes. Por lo tanto, el alginato no es tóxico cuando es administrado poresta vía. Sin embargo, en administraciones intravenosas, investigaciones demuestran que ha

25inducido reacciones ante un cuerpo extraño y fibrosis. Por otra parte, cuando el alginato ha sidopurificado mediante electroforesis de flujo libre, no provoca inmunorespuestas. Entonces, lasinmunorespuestas provocadas bajo administraciones intravenosas pueden haber sido provocadaspor impurezas en el alginato 25 .Otras ventajas que presenta el método de encapsulación son: se puede realizar a bajastemperaturas; las microcápsulas poseen la cualidad de presentar un ambiente acuoso inerte dentrode la matriz; en la fabricación no se utiliza solventes orgánicos; se obtienen matrices con una altaporosidad que permite la difusión de macromoléculas y moléculas de bajo peso molecular; lahabilidad de controlar esta porosidad con simples procedimientos de protección; la disolución ybiodegradación de los sistemas bajo condiciones fisiológicas normales 26,32 .Los sistemas de difusión de moléculas de bajo peso molecular (como por ejemplo lasdrogas) basados en alginato pueden ser divididos en dos principales categorías 23 :Sistema de membrana polimérica (microcápsula) donde la droga es encapsuladadentro de un reservorio recubierto por una película de material. La liberación de ladroga es controlada por la membrana polimérica de encapsulación que tiene unapermeabilidad específica. La liberación es más baja cuando la membrana es másgruesa.Sistema de matriz polimérica (microesfera), donde la droga es homogéneamentedispersada en la matriz polimérica. Cuando este sistema es expuesto a un medio dedifusión, la liberación de la droga es modulada por difusión a través de unhinchamiento de la matriz y erosión de la periferia.

26Las moléculas de bajo peso molecular altamente solubles en agua son liberadas desde lamatriz mediante difusión de moléculas disueltas; contrariamente las moléculas de bajo pesomolecular que son pobremente solubles en agua son liberadas predominantemente pormecanismos de erosión 24 .Las macromoléculas (como por ejemplo proteínas) que son encapsuladas en matrices dealginato de calcio son liberadas de ellas por dos mecanismos: difusión a través de los poros de lamatriz polimérica y por la degradación de ésta 34,30 . Para la liberación controlada de este tipo demoléculas es mejor el mecanismo de difusión, ya que por medio de la degradación de la matriz laliberación se produce rápidamente 25 .La interacción química que se produzca entre las moléculas de bajo peso molecular o lasmacromoléculas con los grupos carboxílicos del alginato es relevante para la liberación de ellasdesde las matrices de alginato. Moléculas de bajo peso molecular con carga positiva muestranuna liberación más baja comparadas con moléculas de bajo peso molecular con carga negativa,debido a la interacción electrostática que se produce entre la carga positiva de la molécula y lacarga negativa del grupo carboxílico del polímero 36 . En este mismo sentido, macromoléculas concarga positiva exhiben una inhibición de la difusión de ellas desde las matrices 36,25 .Otro de los puntos importantes en la liberación de moléculas de alto o bajo pesomolecular encapsuladas en microcápsulas de alginato de calcio, es la remoción de los iones Ca 2+por agentes quelantes como lactato, citrato, etc. 26 , o su desplazamiento por altas concentracionesde cationes univalentes (por ejemplo Na + ) o por Mg 2+ . Esto se traduce en el rompimiento de lainteracción entre los grupos carboxílicos de los bloque G y el calcio, lo que provoca un proceso

27paulatino de erosión y desintegración de las microcápsulas 28,31,32 , y por lo tanto un aceleramientoen la tasa de liberación de las moléculas encapsuladas 31 .Prolongar el tiempo de residencia gástrica en sistemas de liberación de drogas puede serun objetivo para mejorar la biodisponibilidad y la eficacia terapéutica de drogas 25,37,38 . Esbeneficioso para drogas que son absorbidas en la parte proximal del tracto gastrointestinal ydrogas que son menos solubles o degradadas a pH básico 25 . Además, es de gran utilidad paradrogas que tienen como sitio específico de acción el estómago y partes proximales del intestinodelgado 37,39 .Para prolongar el tiempo de residencia de los sistemas de liberación de drogas se hanutilizado varias técnicas: flotabilidad, mucoadhesión, hinchamiento, etc 37,39 .La mucoadhesión se puede producir mediante uniones covalentes, electrostáticas,hidrofóbicas, o puentes de hidrógeno. Se ha reportado que polímeros iónicos poseen una mayoradhesión que polímeros neutros, y a medida que se incrementa la densidad de carga pueden sermás mucoadhesivos. Esto está ligado directamente a las características de la cubierta gel mucosainsoluble que recubre al tracto gastrointestinal. Ésta consiste principalmente en glicoproteínasque contienen grupos éter sulfato y ácido siálico, los que le otorgan la característica de seraltamente negativa 38 .El alginato es un polianión mucoadhesivo. Estudios han mostrado que tiene una mayorfuerza de adhesión en comparación con polímeros como por ejemplo carboximetilcelulosa.Además, en presencia de quitosano ha mostrado tener excelentes propiedades bioadhesivas, lascuales han manifestado una fuerte afinidad por la mucosa gástrica 26 . Esta característica delalginato puede ser de gran utilidad para sistemas de liberación de drogas en tejidos mucosos

28como por ejemplo el tracto gastrointestinal, y también permite aumentar el tiempo de residenciaen las superficies de absorción de drogas, mejorando su biodisponibilidad y efectividad 25 .1.8. Microcápsulas de alginato-quitosanoComo expusimos anteriormente, una de las ventajas de la microencapsulación demoléculas activas en microcápsulas de alginato de calcio es que el procedimiento se realiza encondiciones moderadas 34 , lo que permite mantener la actividad de moléculas biológicas 40 . Sinembargo, estas microcápsulas tienen la limitación de ser muy porosas, presentado una bajacapacidad de retención de las moléculas encapsuladas cuando son expuestas en medios deliberación o en el proceso de formación de las microcápsulas 25,40 , y de sobre manera si éstas sonde bajo peso molecular. Además, estas microcápsulas son inestables en presencia de cationesunivalentes provocando su rompimiento y la liberación de las sustancias encapsuladasrápidamente, y además son susceptibles a la erosión. Para limitar la perdida de materialencapsulado y proteger a las microcápsulas de los fenómenos ya nombrados, éstas pueden serrecubiertas con un policatión para formar una membrana en la superficie 31,34,40 .Microcápsulas que poseen el centro o núcleo de alginato y una membrana de policatiónhan sido ampliamente investigadas como inmovilizadores de enzimas 35 , sistemas de liberación dedroga 41 , para la protección de proteínas del ambiente gástrico 42 , etc.Uno de los policationes candidatos para formar una membrana alrededor de unamicrocápsula con centro de alginato puede ser el polímero quitosano (Figura 7), el cual es unpolisacárido lineal, hidrofílico, derivado del polímero natural quitina, compuesto de cadenas

29distribuidas aleatoriamente de D-glucosamina y N-acetil-glucosamina ligadas mediante unionesβ-(1-4) 43 . Además, es biodegradable, no es tóxico y no causa efectos secundariosindeseables 34,44,25,45 .Figura 7. Polímero quitosano (QUIT)La quitina es un componente estructural del exoesqueleto de los crustáceos, y tambiénpuede ser encontrado en otras especies como moluscos, insectos y hongos. En el proceso depreparación del quitosano, las conchas molidas son desproteinizadas y desmineralizadas a travésde tratamientos secuenciales con sustancias ácidas y básicas. Después de extraída, la quitina esdesacetilada a quitosano mediante hidrólisis alcalina a alta temperatura 25 .Otra de las buenas características del quitosano es su capacidad de adherirse en la mucosagástrica (mucoadhesión). Esta característica puede ser utilizada para prolongar el tiempo deresidencia de sistemas de liberación de drogas en sitios específicos, como por ejemplo en elestómago, intestino delgado y mucosa bucal, y también para aumentar el tiempo de residencia enlugares de absorción, aumentando de esta forma la biodisponibilidad y efectividad de las drogas.Los principales mecanismos de mucoadhesión del quitosano son: las interacciones electrostáticas

30entre las cargas positivas de los grupos aminos y la carga negativa de la capa mucosa, y lospuentes de hidrógeno. Las interacciones electrostáticas se pueden hacer más fuertes con elaumento de la cantidad de grupos aminos libres, el aumento del grado de desacetilación yaumento del peso molecular del quitosano 25 .El quitosano también puede actuar como un potenciador para la permeabilidad del epiteliointestinal mediante la abertura de las uniones estrechas, permitiendo de esta forma mejorar laabsorción de grandes compuestos hidrofílicos. Este mecanismo se basa en la interacción de lascargas positivas del polímero con la membrana celular, resultando en una reorganizaciónestructural de las proteínas asociadas a las uniones estrechas 25,45 .Microcápsulas compuestas de alginato y quitosano, donde el centro está compuesto poralginato y la membrana por quitosano, se pueden formar por dos métodos.Uno de estos métodos consiste en la formación de la microcápsula alginato-quitosano endos etapas. Primero se forma de la matriz de alginato de calcio mediante el goteo de una soluciónde alginato en una solución gelificante que contenga iones calcio, y posterior a ello lasmicrocápsulas formadas son transferidas a una solución de quitosano para formar una membranaen su superficie. La otra metodología consiste en una sola etapa. El goteo de la solución dealginato se realiza en una solución gelificante que contenga iones calcio y quitosano, por lo tantolos iones calcio interactúan con el alginato formando el centro y el quitosano lo recubre 33,46 .En la formación de microcápsulas de alginato-quitosano en dos etapas, es necesario teneren cuenta el peso molecular de este último. Moléculas de quitosano con un bajo peso molecular(7.300 Da, 12.000 Da y 18.000 Da) poseen la capacidad de penetrar en el interior de las matrices.Mientras que en moléculas de mayor tamaño (con un peso molecular 61.000 Da), se unen

31principalmente en la superficie de las matrices. Además, cuando se aumenta la porosidad de lasmatrices de alginato, debido al aumento de calcio en el medio de formación de las matrices,también aumenta el grado de penetración del quitosano 33,46 . En este tipo de microcápsulas si seaumenta el tiempo de permanencia de las matrices de alginato en la solución de quitosanoaumenta la penetrabilidad del quitosano en el interior de la matriz 46 .En la formación de microcápsulas alginato-quitosano en una etapa, se formainstantáneamente una membrana compuesta por quitosano y alginato. Ésta no permite la entradade quitosano al interior de las matrices, sin embargo a medida que aumenta la cantidad de calcioen el medio de formación, este interacciona con el alginato aumentando la porosidad de lasmatrices, y por lo tanto posibilita la penetración de moléculas de quitosano en el interior de lasmatrices de alginato. Sin embargo, con esta metodología siempre la cantidad de quitosano unidoa las matrices de alginato es menor comparado con las microcápsulas formadas en dos etapas,debido a su menor porosidad y la membrana que se forma en la superficie 33,46 .Otra de las diferencias importantes entre estas dos metodologías es la resistencia alrompimiento que presentan estas microcápsulas. Gasserod 46 para observar la resistencia alrompimiento de cápsulas de alginato-quitosano formadas por los dos métodos antes nombrados,incubó las microcápsulas por 15 minutos en una solución salina y luego las traspasó a aguadesionizada para que se produzca una alta presión osmótica en el interior de la microcápsula. Lasmicrocápsulas formadas en una sola etapa son bastante débiles (rompiéndose el 85% en losprimeros minutos), comparadas con las realizadas en dos etapas donde sólo el 28% se rompieron.Es más, cuando las matrices de alginato de calcio son incubadas en la solución de quitosano enpresencia de calcio aumenta aun más su resistencia, permaneciendo intactas el 90%.

32En este sentido, la estabilidad de las microcápsulas de alginato-quitosano, formadas porestas dos diferentes metodologías, presentan diferencias significativas en un largo tiempo.Cuando las microcápsulas fueron incubadas en una solución salina (0.154 M NaCl), lasmicrocápsulas formadas en un solo paso presentaron una durabilidad de dos días, mientras quelas microcápsulas formadas en 2 etapas recubiertas con quitosano con un peso molecular de62.000 Da presentaron una durabilidad de una semana. Cuando son recubiertas con quitosano conun peso molecular de 15.000 Da y además se incluye calcio en la solución de quitosano, suestabilidad es de 198 días 46 .Otra de las características de las microcápsulas de alginato-quitosano es sumucoadhesividad. Gaserod y col. 38 reportaron que este tipo de microcápsulas, independiente desu metodología de formación, presentan una mayor mucoadhesividad en comparación con lasmicrocápsulas de alginato de calcio en tejidos de estómago y esófago de chancho. Esteincremento de la adhesión es debido probablemente a las interacciones electrostáticas que seproducen entre las cargas positivas del quitosano y las cargas negativas de la mucosa delestómago o de las células epiteliales del esófago.2. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMADurante el desarrollo de la industria salmonera chilena se ha utilizado una gran cantidadde antibióticos para controlar las enfermedades virales, bacterianas y parasitarias, que sepresentan en los centros de cultivo. El uso indiscriminado de éstos ha traído impactos negativos

33al medio ambiente marino. Por lo tanto, la utilización de microcápsulas de alginato de calcio parasuministrar antígenos y antibióticos de forma controlada podría apuntar a la mitigación de losimpactos negativos que en la actualidad la salmonicultura ha provocado.Las microcápsulas de alginato de calcio presentan la desventaja de ser bastante porosas.Esta característica no permite una retención eficiente de moléculas de bajo y alto peso molecular,debido a la difusión de ellas a través de los poros. Además, la poca eficiencia de retención de estetipo de moléculas por parte de microcápsulas de alginato de calcio, se debe también a lainestabilidad que presentan a condiciones tales como presión osmótica y soluciones quecontienen cationes monovalentes, los que provoca la erosión de las microcápsulas.Para poder solucionar la baja retención de moléculas de bajo peso molecular enmicrocápsulas de alginato de calcio, éstas podrían formar complejos estables con moléculas dealto peso molecular. Además, la utilización microcápsulas de alginato-quitosano formadas en unao dos etapas podría solucionar el problema de la baja retención de moléculas de bajo pesomolecular, a través del aumento de la estabilidad de la microcápsulas ante las condiciones yanombradas.El propósito de esta investigación es la encapsulación de rodamina 6G, como moléculamodelo, en microcápsulas de alginato de calcio y microcápsulas de alginato-quitosano,previamente complejada con poli(4-estiresulfonato de sodio), aprovechando las interaccionesaromáticas-aromáticas de naturaleza de corto alcance.

342.1. Hipótesis de trabajoEs posible la encapsulación de moléculas aromáticas de bajo peso molecular enmicrocápsulas de alginato de calcio, previamente complejadas con polímeros que portan anillosaromáticos.2.2. Objetivo generalEvaluar la encapsulación de rodamina 6G (R6G) en microcápsulas de alginato de calcioen presencia de polianiones que posean o no grupos aromáticos.2.3. Objetivos específicosEvaluar la formación de complejos entre rodamina 6G y los polímeros poli(4-estirensulfonato de sodio) y poli(vinil sulfonato de sodio).Evaluar el porcentaje de encapsulación del tinte rodamina 6G en microcápsulas dealginato de calcio.Evaluar el porcentaje de encapsulación del tinte rodamina 6G, en presencia de poli(4-estirensulfonato de sodio), en microcápsulas de alginato de calcio .

35Evaluar el porcentaje de encapsulación del tinte rodamina 6G, en presencia de poli(vinilsulfonato de sodio), en microcápsulas de alginato de calcio .Evaluar el porcentaje de encapsulación del tinte rodamina 6G en presencia de poli(4-estirensulfonato de sodio), en microcápsulas de alginato-quitosano.Evaluar la liberación del complejo rodamina 6G-poli(4-estirensulfonato de sodio) desdelas microcápsulas de alginato de calcio cuando éstas son incubadas en agua desionizada.Evaluar la liberación del complejo rodamina 6G-poli(4-estirensulfonato de sodio) desdelas microcápsulas de alginato de calcio cuando éstas son incubadas en agua con fuerzaiónica, a diferentes temperaturas y a diferentes pH.Evaluar la liberación del complejo rodamina 6G-poli(4-estirensulfonato de sodio) desdelas microcápsulas de alginato de calcio, recubiertas con quitosano a diferentesconcentraciones, cuando éstas son incubadas en agua con fuerza iónica a diferentes pH.

363. MATERIALES Y MÉTODO3.1. Materiales3.1.1. ReactivosMoléculas de bajo peso molecular: rodamina 6G (Aldrich), NaCl (Merck), NaOH(Sudelab), HCl (Fisherchemicals), cloruro de calcio (Merck).Polímeros: alginato de sodio (EncapBioSystems), quitosano (Novamatrix), poli(4-estirensulfonato de sodio) (Aldrich), poli(vinil sulfonato de sodio) (Aldrich).Solvente: H 2 O desionizada.Las moléculas utilizadas en esta investigación son posibles observarlas en la Figura 8.

Figura 8. Moléculas utilizadas en la investigación.37

383.1.2. EquiposLa concentración de rodamina 6G fue medida mediante espectroscopía UV-vis en unespectrofotómetro Helios . El pH fue medido en los pHmetros DENVERinstruments modeloUB10 y CORNING Scholar 425. La microencapsulación de R6G se realizó con un encapsuladorBIOTECH cuarta generación. Las fotografías de luz visible y de fluorescencia se realizaron conun microscopio de fluorescencia (Leica DM 2500).3.2. Procedimiento3.2.1. Análisis mediante espectrofotometría de UV-vis de interacciones entre moléculas derodamina 6G y la formación de complejos rodamina 6G – poli(vinil sulfonato de sodio)y rodamina 6G – poli(4-estirensulfonato de sodio)Para analizar la interacción entre moléculas de R6G, y la formación de complejos entre eltinte y los polímeros poli(vinil sulfonato de sodio) y poli(4-estirensulfonato de sodio) serealizaron diferentes soluciones ajustadas a pH 5 (ver tabla 1). Éstas fueron evaluadas medianteespectrofotometría UV-vis para visualizar el efecto de agregamiento del tinte y el desplazamientode las bandas del tinte hacia menores o mayores niveles de energía.

39Tabla 1. Soluciones preparadas para el análisis de interacciones entre moléculas de rodamina 6Gy la formación de complejos rodamina 6G – poli(vinil sulfonato de sodio) y rodamina 6G –poli(4-estirensulfonato de sodio).Solución Constituyentes pH1.1 R6G 1 x 10 -4 M. 51.2 R6G 1 x 10 -5 M. 51.3 R6G 3.7 x 10 -6 M. 51.4 R6G 3.7 x 10 -6 M CaCl 2 0.1 M. 51.5 R6G 1 x 10 -4 M, PSS 1 x 10 -2 M. 51.6 R6G 1 x 10 -4 M, PVS 1 x 10 -2 M. 51.7 R6G 3.7 x 10 -6 M, PSS 3.7 x 10 -4 M. 51.8 R6G 3.7 x 10 -6 M, PSS 3.7 x 10 -4 M, CaCl 2 0.1 M. 51.9 R6G 3.7 x 10 -6 M, PVS 3.7 x 10 -4 M. 51.10 R6G 3.7 x 10 -6 M, PVS 3.7 x 10 -4 M, CaCl 2 0.1 M. 53.2.2. Encapsulación de rodamina 6G en microcápsulas de alginato de calcioSe inyectaron 7.4 mL de solución (ver tabla 2), mediante una jeringa, en unmicroencapsulador. La microencapsulación se realizó con una boquilla de 200 µM, a unafrecuencia de 940 Hz, con un flujo de 4,4 mL/min, a 20ºC. La lluvia de gotas, producto de lavibración del instrumento, fue recibida en un matraz con 200 ml de cloruro de calcio 0.1 M

40a pH 5, para la gelificación de las microcápsulas de alginato (Figura 9). Mediante espectroscopíaUV-vis, se midió la concentración de R6G en el sobrenadante de las soluciones que contenían lasmicrocápsulas de alginato de calcio para poder cuantificar la encapsulación de R6G. Paraobservar la forma de las microcápsulas y la encapsulación de R6G se sacaron fotografías de luzvisible y fluorescencia.Tabla 2. Soluciones preparadas para la microencapsulación de rodamina 6G en microcápsulas dealginato de calcio.Solución Constituyentes pH2.1 R6G 1 x 10 -4 M, ALG 0.75 M. 52.2 R6G 1 x 10 -4 M, ALG 0.75 M, PVS 0.01 M. 52.3 R6G 1 x 10 -4 M, ALG 0.75 M, PSS 0.01 M. 5

41Figura 9. Diagrama del proceso de encapsulación en un microencapsulador Biotech, cuartageneración.3.2.3. Encapsulación de rodamina 6G en microcápsulas de alginato-quitosanoSe procedió de la misma manera que para la formación de las microcápsulas de alginato decalcio, con la diferencia que en la solución de cloruro de calcio 0.1 M contenía quitosano. Seprepararon soluciones de la solución 2.3 (ver tabla 2). Éstas fueron inyectadas, mediante unajeringa, en un microencapsulador. La microencapsulación se realizó con una boquilla de 200 µM,a una frecuencia de 940 Hz, con un flujo de 4,4 mL/min, a 20ºC. La lluvia de gotas, producto dela vibración del instrumento, fue recibida en un matraz con 200 ml de cloruro de calcio 0.1 M con

42quitosano a diferentes concentraciones. El pH de la solución fue ajustado a 5. Se realizaron 4experimentos a diferentes concentraciones de quitosano: QUIT 5.6 x 10 -4 M, QUIT 1.4 x 10 -3 M,QUIT 2.8 x 10 -3 M, QUIT 5.6 x 10 -3 M. Mediante espectroscopía UV-vis, se midió laconcentración de R6G en el sobrenadante de las soluciones que contienen las microcápsulas dealginato-quitosano para poder cuantificar la encapsulación de rodamina 6G. Para observar laforma de las microcápsulas y la encapsulación de R6G se sacaron fotografías de luz visible yfluorescencia.3.2.4. Evaluación del comportamiento de las microcápsulas de alginato de calcio cuandoson expuestas a diferentes condiciones fisicoquímicasLas microcápsulas luego de su formación y medición del porcentaje de encapsulación derodamina 6G, fueron filtradas de la solución de cloruro de calcio y lavadas con agua desionizada.Para evaluar el efecto de la presión osmótica, las microcápsulas fueron incubadas en 50 mL deagua desionizada, ajustada a pH 5. Dependiendo de la duración del experimento, a cada ciertointervalo de tiempo se fue midiendo el sobrenadante mediante espectrofotometría de UV-vis, conel fin de cuantificar la rodamina 6G liberada desde la micropartículas. El sobrenadante despuésde ser medido fue vertido nuevamente en la solución que contenía a las micropartículas. Esteexperimento fue realizado a temperatura ambiente.Para observar el efecto de NaCl en las microcápsulas se procedió como fue descritoanteriormente con la diferencia que en vez de ser incubadas en agua destilada las microcápsulasfueron incubadas en agua destilada con NaCl 0.1 M a pH 5.

43Para observar la influencia de la temperatura en la liberación de R6G se realizó el mismoprocedimiento para evaluar la presión osmótica en las microcápsulas de alginato de calcio, con ladiferencia que se efectuó en presencia de NaCl 0.1 M. Se evaluaron 5 temperaturas (7°C, 20°C,30°C, 45°C, 60°C), controladas mediante un baño termoregulado. La duración de losexperimentos fue de 7 horas.Para observar la influencia del pH en la liberación de R6G se realizó el mismoprocedimiento para evaluar la presión osmótica en las microcápsulas de alginato de calcio, con ladiferencia que se efectuó en presencia de NaCl 0.1 M. Se evaluaron siete pH diferentes (2, 3, 4, 5,6, 7 y 8), a 30°C, en un rango de 7 horas.3.2.5. Evaluación del comportamiento de las microcápsulas de alginato de calciorecubiertas con quitosano cuando son expuestas a diferentes condicionesfisicoquímicasLas microcápsulas luego de su formación y medición del porcentaje de encapsulación derodamina 6G, fueron filtradas de la solución de cloruro de calcio y lavadas con agua desionizada.Luego, las microcápsulas fueron incubadas por 12 horas en soluciones de quitosano: 2.8 x 10 -4M; 5.6 x 10 -4 M; 1.4 x 10 -3 M; 2.8 x 10 -3 M; 5.6 x 10 -3 M. Las soluciones de quitosano seajustaron a pH 5. Nuevamente, las microcápsulas ahora recubiertas por quitosano, fueron filtradase incubadas en 50 mL de agua con NaCl 0.1 M, a pH 5. La temperatura se mantuvo a 30°Cmediante un baño termoregulado, por 7 horas. Se realizaron mediciones del sobrenadante,

44mediante espectroscopía de UV-vis, para observar la cinética de liberación de R6G de lasmicrocápsulas.También se evaluó el efecto del pH en la liberación de R6G desde las microcápsulas dealginato de calcio recubiertas con quitosano. Se procedió de la misma forma que mencionamosanteriormente. Los pH fueron 2, 3, 4 y 5.4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN4.1. Análisis mediante espectrofotometría de UV-vis de interacciones entre moléculas derodamina 6G y la formación de complejos rodamina 6G – poli(vinil sulfonato de sodio)y rodamina 6G – poli(4-estirensulfonato de sodio)El tinte xanténico R6G exhibe dos máximos de absorbancia en el espectro UV-vis, querepresentan los estados de monomerización (527 nm) y dimerización (500 nm). Enconcentraciones no más altas que 1 x 10 -5 M el tinte se presenta en un estado monomérico 13 ,como se observa en la Figura 10b. No obstante, a medida que aumenta la concentración del tintemayor es la probabilidad de cercanía entre las moléculas, y por lo tanto la formación de dímeros,trímeros y agregados de alto orden 18 . Este hecho lo constatamos con el aumento de laconcentración del tinte a 10 -4 M (Figura 10a) produciéndose un aumento de la intensidad de labanda del dímero (500 nm) en comparación cuando el tinte estuvo a una concentración 10 -5 M(Figura 10b).

45dabcFigura 10. Espectros UV-vis normalizados de R6G. a) R6G 1 x 10 -4 M. b) R6G 1 x 10 -5 M. c) R6G 1 x 10 -4 M enpresencia de PSS 1 x 10 -2 M. d) R6G 1 x 10 -4 M en presencia de PVS 1 x 10 -2 M.Las características luminiscentes de R6G se pueden modular en presencia de polímerossolubles en agua que contienen o no grupos aromáticos.En presencia de PVS (100 veces más concentrado que el tinte), acontece laautoagregación de moléculas de R6G en lugares no específicos de la cadena del polímero. Estaautoagregación del tinte se observa con el aumento de la intensidad de la banda en los 474 nm delespectro UV-vis (Figura 10d ), dando cuenta la polimerización del tinte mediante contactos tipo-H 13 . Esta situación se debe a que el polímero PVS presenta un comportamiento de un típicopolielectrólito, por lo tanto la interacción que prima entre el polímero y el tinte es de tipoelectrostáticas de largo alcance 18,14 . Contrariamente, en presencia de PSS (100 veces másconcentrado que el tinte) es posible observar una disminución notable de la banda del dímero y

46aumento de la banda del monómero (Figura 10c), con un desplazamiento de la banda delmonómero en 8 nm a bajas energías 18,13 . El PSS al presentar un comportamiento de un típicopolianión aromático 14 , interacciona con el tinte mediante interacciones aromáticas-aromáticas decorto alcance entre el grupo xanténico del tinte y benceno sulfonato del polímero. Por lo tanto, lainteracción entre ambas especies es sitio específica, lo que permite una mejor distribución deltinte sobre el polímero.Diluyendo a concentraciones usadas en los experimentos de encapsulación de R6G seobserva, en presencia de exceso de PVS (100 veces más concentrado que el tinte), laautoagregación de moléculas de R6G en lugares no específicos de la cadena del polímero (Figura11c). Sin embargo, las interacciones electrostáticas de largo alcance son débiles ante la presenciade fuerza iónica. Esto fue comprobado en presencia CaCl 2 0.1 M, observándose la recuperaciónde la banda del monómero (Figura 11b banda punteada de color naranjo). Por otra parte, lainteracción que se produce entre el tinte y PSS (aromática-aromática de naturaleza electrostáticade corto alcance) es resistente a la fuerza iónica 18 , por lo tanto fue posible observar elmantenimiento del corrimiento de la banda del monómero en 8 nm a bajas energía en presenciade CaCl 2 0.1 M (Figura 11d). Esto nos indica que entre el tinte R6G y el polímero PSS se formaun complejo estable.

47a,b,cd,eca,bedFigura 11. Espectros UV-Vis normalizados de R6G. a) R6G 3.7 x 10 -6 M. b) R6G x 3.7 x 10 -6 M en presencia dePVS 3.7 x 10 -4 M y de CaCl 2 0.1 M. c) R6G x 3.7 x 10 -6 M en presencia de PVS 3.7 x 10 -4 M. d) R6G 3.7 x 10 -6 Men presencia de PSS 3.7 x 10 -4 M y de CaCl 2 0.1 M. e) R6G 3.7 x 10 -6 M en presencia de PSS 3.7 x 10 -4 M.4.2. Encapsulación de rodamina 6G en microcápsulas de alginato de calcioSe realizaron 3 experimentos de encapsulación de rodamina 6G en microcápsulas dealginato de calcio: R6G sola (solución 2.1, tabla 2); en presencia de PVS (solución 2.2, tabla 2); yen presencia de PSS (solución 2.3, tabla 2). Se buscó constatar si existía alguna diferencia en elporcentaje de encapsulación de R6G cuando éste interacciona con un polianión con gruposaromáticos (PSS) y uno sin grupos aromáticos (PVS).La encapsulación de R6G en las microcápsulas de alginato de calcio en ausencia deaditivos, en presencia de PVS y PSS presenta diferencias significativas. Cuando R6G fue

48encapsulada sin aditivos no fue posible encapsular el tinte, observándose el sobrenadantetotalmente coloreado. En presencia de PVS la encapsulación de R6G es bajísima con tan solo un2%. En presencia de PSS la encapsulación mejoró significativamente, llegando a ser cercana al50%. (Figura 12).cabFigura 12. Encapsulación de rodamina 6G en microcápsulas de alginato de calcio en presencia de PSS, PVS, y enausencia de ellos. a) R6G en ausencia de polímeros. b) R6G en presencia de PVS. c) R6G en presencia de PSS.La diferencia de la cantidad de R6G encapsulada en presencia de PSS, PVS, y en ausenciade ellos, también puede ser demostrada mediante fotografías de microscopía de fluorescencia yluz visible. En ausencia de aditivos, las microcápsulas de alginato de calcio se observantransparentes en la fotografía de luz visible (Figura 13a) y en la fotografía de fluorescencia (13a`)no se observan debido a que el tinte se encuentra en su mayoría en el sobrenadante. En presencia

49de PVS en las fotografía de luz visible (13b) y fotografía de fluorescencia (13b`) se observa elmismo resultado que cuando el tinte fue encapsulado sin aditivos. En presencia de PSS, se puedeobservar claramente las microcápsulas de alginato de calcio de un color rosado en la fotografía deluz visible (13c), y en la fotografía de fluorescencia de un color verde (13c`).

50aa`bb`cc`Figura 13. Encapsulación de R6G en microcápsulas de alginato de calcio. Fotografías de microscopía de luz visible yfluorescencia. a, a` encapsulación de R6G en ausencia de aditivos. b, b` encapsulación de R6G en presencia de PVS.c, c` encapsulación de R6G en presencia de PSS.

51La R6G posee características que se deben tener en cuenta para su encapsulación. Es unamolécula de bajo peso molecular, catiónica y soluble en agua 11,13 . Al presentar carga positivadebiera interactuar electrostáticamente con los grupos carboxilatos libres del alginato,permaneciendo retenida en el interior de las microcápsulas 36 . Sin embargo, el ambiente deformación de las microcápsulas presenta una alta fuerza iónica debido a los contraiones presentesen solución, lo que debe estar promoviendo el apantallamiento de la interacción entre el tinte y elpolímero 14 . En consecuencia, el tinte al no estar interaccionando con el polímero y al ser unamolécula de bajo peso molecular difunde rápidamente desde el interior de las microcápsulas almedio 24 . En este mismo sentido, el comportamiento del polianión PVS es de un típicopolielectrólito, por ende la interacción que se produce entre él y el tinte es de naturalezaelectrostática de largo alcance entre los grupos sulfonatos (carga negativa) del polímero con lacarga positiva del tinte. Como se mencionó anteriormente, estas interacciones son bastantedébiles frente a la fuerza iónica, por lo tanto la fuerza iónica presente en el medio de formaciónde la microcápsulas rompe la interacción entre el polímero y el tinte 14 . En consecuencia el tintequeda libre en la microcápsula produciendo su liberación al medio.Por otra parte, el PSS tiene un típico comportamiento poli-anión-aromático 14 , por ende seproduce una interacción aromática-aromática de naturaleza electrostática de corto alcance entre elPSS y R6G. Estas interacciones tienen la característica de ser bastante resistente a la fuerzaiónica 13,15 ,traduciéndose en la formación permanente de un complejo. La formación delcomplejo favoreció significativamente la retención de R6G en el interior de las microcápsulas dealginato de calcio. Esto se puede deber al impedimento estérico que presenta la matriz de alginatode calcio ante el tamaño del complejo formado entre el tinte y el polímero, ya que al aumentar eltamaño de las moléculas aumenta el porcentaje de retención o de encapsulación en las

52microcápsulas de alginato de calcio 25,30,40 . Además, fue posible observar la liberación, desde lasmicrocápsulas de alginato de calcio, del complejo formado entre el tinte R6G y el polímero PSS,ya que se produjo un corrimiento en 8 nm en la banda del monómero de la R6G 18 (Figura 14c),situación que no se presenta cuando la R6G fue encapsulada sola o en presencia de PVS (Figura14b).abcFigura 14. Espectro UV-vis normalizado de las concentraciones de R6G en los sobrenadantes. a) Espectro UV-visR6G en ausencia de polímeros. b) Espectro UV-vis R6G en presencia de PVS. c) Espectro UV-vis R6G en presenciade PSS.

534.2.1. Encapsulación del complejo rodamina 6G – poli(4-estirensulfonato de sodio) enmicrocápsulas de alginato-quitosanoComo fue posible observar en las figuras 10, 11 y 14 el tinte R6G interacciona con el PSSmediante interacciones aromáticas-aromáticas de naturaleza electrostáticas de corto alcance,produciéndose un complejo entre estas dos moléculas. Por lo tanto, en experimentos deencapsulación de R6G en presencia de PSS, es exacto señalar que se está encapsulando elcomplejo R6G-PSS.Las microcápsulas de alginato-quitosano presentan una mayor encapsulación delcomplejo R6G-PSS en comparación a las microcápsulas de alginato de calcio. A medida queaumenta la concentración de quitosano en la solución de cloruro de calcio, aumenta laencapsulación del complejo. Para una concentración de QUIT 5.6 x 10 -4 M la encapsulación deR6G es cercana al 70%; a una concentración de QUIT 1.4 x 10 -3 M la encapsulación de R6G escercana al 75%; a una concentración de QUIT 2.8 x 10 -3 M la encapsulación de R6G es cercanaal 80%; a una concentración de QUIT 5.6 x 10 -3 M la encapsulación de R6G es cercana al 85%(Figura 15). Cabe destacar que el recubrimiento de las microcápsulas de alginato de calcio conquitosano se realizó en un paso.

54cdefbaFigura 15. Encapsulación de R6G en microcápsulas de alginato de calcio y en microcápsulas de alginato-quitosano.a) R6G en ausencia de aditivos. b) R6G en presencia de PSS. c) R6G en microcápsulas de alginato-quitosano (QUIT5.6 x 10 -4 M). d) R6G en microcápsulas de alginato-quitosano (QUIT 1.4 x 10 -3 M). e) R6G en microcápsulas dealginato-quitosano (QUIT 2.8 x 10 -3 M). f) R6G en microcápsulas de alginato-quitosano (QUIT 5.6 x 10 -3 M).Mediante microscopía de fluorescencia y luz visible se pudo observar también laencapsulación de R6G en las microcápsulas de alginato-quitosano debido a la coloración rosadade éstas (Fotografías 16a, 16b, 16c, 16d), y a su fluorescencia (Fotografías 16a`, 16b`, 16c`,16d`).

55aa`bb`cc`dd`Figura 16. Encapsulación de R6G en microcápsulas de alginato-quitosano. Fotografías de microscopía de luz visible yfluorescencia. a, a` QUIT 5.6 X 10 -4 . b, b` QUIT 1.4 X 10 -3 . c, c` QUIT 2.8 X 10 -3 . d, d` QUIT 5.6 X 10 -3

56La mayor encapsulación de R6G en este tipo de cápsulas se produce por dos fenómenos.La presencia de PSS provoca la complejación de éste con el tinte R6G (explicada anteriormente)aumentando su retención en las microcápsulas de alginato de calcio, y por la presencia dequitosano en el medio de formación de las microcápsulas de alginato de calcio. Este polímero alposeer cargas positivas puede formar interacciones electrostáticas con el alginato, que poseecarga negativa, formándose una membrana externa a la microcápsula 40,23 , disminuyendo así laporosidad de las microcápsulas impidiendo que el complejo PSS-R6G sea liberado 46 , comoocurre cuando el quitosano no está presente en el medio de formación de las microcápsulas(Figura 12).Por otra parte, en presencia de quitosano las microcápsulas presentan unas estructuras quesobresalen de ellas (Fotografías 16a, 16b, 16c, 16d) las que en ausencia de quitosano no sepresentan (13a, 13b, 13c).Según Gasserod y col. 33 en la formación de microcápsulas alginato-quitosano en un solopaso, la membrana externa se forma instantáneamente impidiendo la penetración del quitosano enel interior de la matriz. Sin embargo, cuando se presenta una concentración adecuada de calcioaumenta la porosidad de la matriz, y por lo tanto aumenta la penetración del quitosano en suinterior. Por otra parte, cuando aumenta el grado de desacetilación, y el pH del medio está en losrangos en donde el polímero está altamente cargado, éste se presenta en una conformaciónextendida, desfavoreciendo el ingreso del quitosano en el interior de la matriz de alginato decalcio. Además, si aumenta el peso molecular de éste también influye en la disminución de supenetrabilidad en el interior de las matrices.

60Cuando las microcápsulas de alginato de calcio fueron filtradas de su solución original(cloruro de calcio 0,1M) y puestos en 50 mL de agua con NaCl 0,1M a pH 5 se presentó unamayor velocidad de liberación del complejo R6G-PSS desde las microcápsulas de alginato decalcio en comparación a las incubadas en agua desionizada, llegando a liberarse cerca de un 65%de la R6G encapsulada (Figura 18).Figura 18. Cinética de liberación del complejo R6G-PSS desde las microcápsulas de alginato de calcio cuando éstasson incubadas en agua desionizada y en una solución salina. • Microcápsulas de alginato de calcio incubadas enNaCl 0.1M. Microcápsulas de alginato de calcio incubadas en agua desionizada.La liberación del complejo R6G-PSS desde las microcápsulas cuando éstas son expuestasen agua desionizada, se puede deber a un proceso de hinchamiento 23 producto de la entrada deagua induciendo una mayor abertura de los poros, lo que posibilita la liberación del complejoPSS-R6G, hasta alcanzar un equilibrio. Por otra parte, cuando las microcápsulas son expuestas a

61una solución salina, ocurre un intercambio iónico entre el Na + y el Ca 2+ que está cumpliendo lafunción de entrecruzador con los grupos carboxilato, principalmente del ácido gulurónico,rompiéndose la conformación caja de huevo. La repulsión electrostática entre los gruposcarboxílicos “libres” produce el hinchamiento de las microcápsulas, y eventualmente facilita suerosión. El resultando es un proceso paulatino de desintegración de las microcápsulas 28,32 . Esteproceso se traduce en una mayor liberación del complejo R6G-PSS en comparación a lasmicrocápsulas expuestas a agua desionizada. Además, durante el proceso de desintegración, laentrada de los iones Na + y Cl - dentro del sistema también puede incrementar la fuerza osmóticaaumentando así el tamaño de los poros 23 , favoreciendo la liberación del complejo R6G-PSS.Se debe tener en cuenta en el proceso de liberación del complejo R6G-PSS la carganegativa que éste posee (debido al exceso de polímero), la que puede estar facilitando suliberación de las microcápsulas de alginato de calcio, debido a la repulsión que debe estarsucediendo entre el complejo y las cargas negativas del alginato. En macromoléculas con cargapositiva se inhibe su liberación debido a la interacción que se produce entre ellas y elalginato 25,26 .4.3.1. Cinética de liberación del complejo rodamina 6G – poli(4-estirensulfonato de sodio)desde las microcápsulas de alginato de calcio cuando son incubadas en NaCl 0.1 M adiferentes temperaturasLa liberación del complejo R6G-PSS fue evaluada en presencia de NaCl 0.1 M adiferentes temperaturas, desde 7°C a 60°C. Se pudo observar que a medida que aumentó la

62temperatura aumentó la cantidad y la velocidad de liberación del complejo R6G-PSS. Además, espreciso remarcar que el aumento de la cantidad y la velocidad de liberación del complejo R6G-PSS llega a un límite de los 45°C (Figura 19).Dentro del rango de temperatura del experimento se pudo observar un cierto grado deestabilidad de las microcápsulas de alginato de calcio, ya que éstas no se desintegraron en elperiodo de tiempo que duró el experimento. Esto se relaciona que los reportado en la literatura,en donde se ha registrado una resistencia hasta los 100°C 26 .Figura 19. Liberación del complejo R6G-PSS desde las microcápsulas de alginato de calcio en presencia de NaCl0.1 M y expuestas a diferentes temperaturas. • 7°C. • 20°C. 30°C. 45°C. 60°C.

634.3.2. Cinética de liberación del complejo rodamina 6G – poli(4-estirensulfonato de sodio)desde las microcápsulas de alginato de calcio cuando son incubadas en agua conNaCl 0.1 M, a 30°C y a diferentes pHEn la Figura 20 observamos la liberación del complejo R6G-PSS desde las microcápsulasde alginato de calcio. Éstas fueron expuestas a una solución salina (NaCl 0.1 M), 30°C y a unrango de pH desde 2 a 8. Observamos que no existen diferencias significativas en la liberacióndel complejo R6G-PSS en el rango de pH establecido.Figura 20. Liberación del complejo R6G-PSS desde las microcápsulas de alginato de calcio en presencia de NaCl0.1 M, a 30 C° y expuestas a pH diferentes. pH 2. • pH 3. pH 4. pH 5. • pH 6. pH 7. pH 8.La liberación de moléculas o complejos moleculares inmovilizados en las microcápsulasde alginato de calcio se basa principalmente en el hinchamiento y degradación de estos sistemas.

64Bajo condiciones ácidas el hinchamiento de las microcápsulas de alginato de calcio apenasocurre 23,25 , por el contrario se produce una contracción de ellas 34 . Bajo condiciones neutras lasmicrocápsulas de alginato de calcio se hinchan 25 , aumentando de esa forma el tamaño de losporos 23,26 .En nuestros resultados no encontramos diferencias significativas en la velocidad deliberación y en la cantidad liberada del complejo R6G-PSS cuando las microcápsulas fueronexpuestas a pH diferentes. Se esperaría por lo mencionado anteriormente una mayor cantidadliberada y velocidad de liberación del complejo liberado en condiciones neutras y básicas 23,25,26,30 .Sin embargo, en nuestras condiciones de liberación la fuerza iónica debe estar jugando un rolimportante dentro del hinchamiento y la degradación 28,32 de las microcápsulas de alginato decalcio, predominando ante el efecto del pH en la liberación del complejo R6G-PSS.4.4. Cinética de liberación del complejo rodamina 6G – poli(4-estirenesulfonato de sodio)desde las microcápsulas de alginato de calcio recubiertas con quitosano cuando sonincubadas en NaCl 0.1 M, a 30°C y a diferentes pHPara mejorar la retención del complejo R6G desde las microcápsulas de alginato decalcio, éstas fueron recubiertas a diferentes concentraciones de quitosano (QUIT 5.6 x 10 -3 M,QUIT 2.8 x 10 -3 M, QUIT 1.4 x 10 -3 M, QUIT 5.6 x 10 -4 M, 2,8 x 10 -4 M). Éstas fueron evaluadasen un rango de pH entre 2 y 5, en presencia de NaCl 0.1 M, a 30C°, durante 420 minutos.Las cápsulas recubiertas mostraron una retención significativamente mayor del complejoR6G-PSS (Figura 21, 22, 23, 24, 25) en comparación con las cápsulas no recubiertas, expuestas a

65las mismas condiciones (Figura 20). No obstante, al incubar las microcápsulas en quitosano 2.8 x10 -4 M (un orden de magnitud menor que la concentración de alginato) se presenta una liberaciónmayor del complejo R6G-PSS en comparación a las otras concentraciones de quitosano (QUIT5.6 x 10 -3 M, QUIT 2.8 x 10 -3 M, QUIT 1.4 x 10 -3 M, QUIT 5.6 x 10 -4 M) (Figura 25). Sinembargo, sigue presentado una retención mayor en comparación cuando las microcápsulas no soncubiertas por quitosano (Figura 20). Murata y col. 31 reportaron la misma tendencia, obteniendoun aumento en la retención de azul brillante cuando las microcápsulas de alginato de calciofueron incubadas en quitosano, siendo proporcional al aumento de la concentración de quitosano.Figura 21. Liberación del complejo R6G-PSS desde microcápsulas de alginato de calcio recubiertas por quitosano(QUIT 5.6 x 10 -3 M) pH 2. • pH 3. pH 4. pH 5.

66Figura 22. Liberación del complejo R6G-PSS desde microcápsulas de alginato de calcio recubiertas por quitosano(QUIT 2.8 x 10 -3 M) pH 2. • pH 3. pH 4. pH 5.Figura 23. Liberación del complejo R6G-PSS desde microcápsulas de alginato de calcio recubiertas por quitosano(QUIT 1.4 x 10 -3 M) pH 2. • pH 3. pH 4. pH 5.

67Figura 24. Liberación del complejo R6G-PSS desde microcápsulas de alginato de calcio recubiertas por quitosano(QUIT 5,6 x 10 -4 M) pH 2. • pH 3. pH 4. pH 5.Figura 25. Liberación del complejo R6G-PSS desde microcápsulas de alginato de calcio recubiertas por quitosano(QUIT 2.8 x 10 -4 M) pH 2. • pH 3. pH 4. pH 5.

68Al incubar las microcápsulas de alginato de calcio en quitosano (QUIT 5.6 x 10 -3 M,QUIT 2.8x 10 -3 M, QUIT 1.4 x 10 -3 M, QUIT 5.6 x 10 -4 M) se debe formar una membrana porcomplejación electrostática entre el quitosano (policatión) y el alginato (polianión), la que debeestar recubriendo el centro formado por el gel de alginato de calcio 33,43,44,46 . Ésta debe estarprotegiendo a la microcápsulas de alginato de calcio de la entrada del ión Na + impidiendo laruptura de la interacción entre el Ca 2+ y los grupos carboxilatos de los bloques G 28,31,32 . Por otraparte, también debe restringir la entrada de iones Cl - disminuyendo la fuerza osmótica. En suma,la membrana imposibilita el hinchamiento, erosión y desintegración 31 de las microcápsulas dealginato de calcio, por lo tanto aumenta la retención del complejo PSS-R6G. Además, si lamembrana tiene la capacidad de proteger a la microcápsula de la entrada de Cl - y Na + , tambiéntiene la capacidad de impedir la salida del complejo R6G-PSS mediante la formación decomplejos QUIT-PSS-R6G. Xiao-Yu y col. 44 reportaron que la mejor condición para laestructuración de membranas quitosano alrededor de microcápsulas de alginato de calcio es a pH5, formándose membranas más densas que a pH más bajo o alto. Esto se explica porqueaproximadamente el 70-80% de los grupos aminos y carboxílicos están cargados, por lo tanto,cada polisacárido presenta una conformación lineal y rígida que provoca una membranadensa 33,43,46 .Gaserod y col. 46 reportaron una alta resistencia que tienen este tipo de microcápsulas (endos etapas) cuando son expuestas en una solución salina y luego traspasadas a agua desionizadapara exponerlas a una alta presión osmótica. También éstas presentaron una gran estabilidadcuando fueron expuestas a una solución salina de 0.154 M de NaCl. La resistencia tanto a lafuerza osmótica como a la estabilidad ante la solución salina, por parte de este tipo demicrocápsulas, es correlacionada directamente a la cantidad de quitosano que ingresa al interior

69de la matriz, ya que al aumentar la porosidad de las matrices, al disminuir el peso molecular, y elgrado de desacetilación del quitosano (aumenta la penetrabilidad del quitosano), aumenta tanto laresistencia a la fuerza osmótica como la estabilidad ante la solución salina para ser más precisosante los iones Na + , los que compiten con los iones calcio en la interacción con los gruposcarboxilatos del alginato. Sin embargo, para tener una conclusión más asertiva ante estos análisis,es necesario poder hacer algunos experimentos de espesor de membrana de quitosano o en sudefecto de penetrabilidad de quitosano en el interior de las matrices de alginato. Esto podría serposible mediante microscopía confocal, marcando el quitosano con moléculas fluorescentes.La menor retención que presentan las cápsulas de alginato de calcio recubiertas por unaconcentración que quitosano en un orden de magnitud menor a la concentración de alginato(Figura 25) se puede deber a que se no se forma una membrana propiamente tal, sino que partesde las microcápsulas de alginato de calcio quedan recubiertas por complejos de quitosanoalginato.Por lo tanto, pueden existir partes “vulnerables” a la presencia de los iones Na + .5. CONCLUSIONESLa encapsulación de rodamina 6G no es efectiva con tradicionales microcápsulas dealginato de calcio. Debido a que ésta es una molécula de bajo peso molecular y soluble en agua,difunde rápidamente desde las microcápsulas. Estas características se conjugan con la altaporosidad que presentan este tipo de microcápsulas.La encapsulación de rodamina 6G no fue efectiva cuando estuvo presente el polímeropoli(vinil sulfonato de sodio). Esto se debe a que la interacción entre este polímero y el tinte es

70electrostática de largo alcance. Esta interacción es débil ante la presencia de fuerza iónica lo queprovoca el rompimiento de la interacción, y por lo tanto la liberación de la R6G desde lasmicrocápsulas de alginato de calcio.Una mayor cantidad de rodamina 6G fue microencapsulada cuando estuvo presente elpolímero poli(4-estirensulfonato de sodio). Esto es debido a la formación de un complejo entre elpolímero y el tinte, el cual fue posible monitorearlo mediante el corrimiento de la banda delmonómero del tinte en 8 nm. El aumento de tamaño, debido a la formación del complejo R6G-PSS, presenta una mayor dificultad para la difusión de éste desde las microcápsulas. Por otraparte, la interacción aromática de naturaleza de corto alcance entre el polímero y el tinte esbastante resistente frente al apantallamiento por parte de fuerza iónica (NaCl), lo que permite laestabilidad del complejo y la permanencia del tinte rodamina 6G en el interior de lasmicrocápsulas de alginato de calcio.Cuando se adicionó en el medio de formación de las microcápsulas (en la solución decloruro de calcio) el polímero quitosano, se presenta una mayor encapsulación del complejoR6G-PSS en comparación a las microcápsulas de alginato de calcio. Además, el porcentaje deencapsulación del complejo R6G-PSS acrecienta a medida que aumenta la cantidad de quitosano.Se encontraron estructuras sobresalientes en las microcápsulas de alginato-quitosano,cuando el quitosano fue agregado en el medio de formación de la microcápsulas. Estasestructuras pueden estar formadas mediante la complejación de las cadenas del polímeroquitosano con las cadenas del polímero alginato. Éstas pueden aumentar en las propiedadesbioadhesivas de estas microcápsulas, debido al aumento de la superficie de contacto entre lasmicrocápsulas y la capa mucosa.

71Cuando las microcápsulas de alginato de calcio fueron incubadas en agua desionizada sepresentó una liberación menor en comparación cuando fueron expuestas a una solución salina. Elsodio (Na + ) juega un rol importante; éste interfiere en el enlace entre el calcio y los gruposcarboxílicos de acido gulurónico provocando, paulatinamente, la desintegración de las cápsulas,induciendo a una mayor liberación del complejo R6G-PSS.El recubrimiento de las microcápsulas de alginato de calcio con el polímero quitosanofavoreció significativamente la retención de complejo R6G-PSS cuando éstas fueron expuestas adiferentes condiciones fisicoquímicas. El quitosano protege al núcleo formado por el gel dealginato de calcio de los cationes monovalentes, los que rompen la interacción entre los cationesCa 2+ y los grupos carboxílicos de las cadenas del alginato. Además, la membrana formada por elquitosano impide la difusión del complejo desde el interior de las microcápsulas.La encapsulación del complejo R6G-PSS en microcápsulas de alginato de calcio y enmicrocápsulas de alginato de calcio recubiertas con quitosano permite el marcaje de lasmicrocápsulas. Esto podría servir para poder monitorearlos en su transcurso a través del tractodigestivo de salmones.

726. REFERENCIAS[1] Burridge, L., Weis, J., Cabello. F., Pizarro, J., Bostick, K. 2010. Chemical Use in SalmonAquaculture: a Review of Current Practices and Possible Environmental Effects. Aquaculture,306, 7–23.[2] Buschmann, A., Fortt, A. 2005. Efectos Ambientales de la Acuicultura Intensiva yAlternativas para un Desarrollo Sustentable. Revista Ambiente y Desarrollo. 21(3), 58-64.[3] Soto, D., Norambuena, F. 2004. Evaluation of Salmon Farming Effects on Marine Systems inthe Inner Seas of Southern Chile: a Large-Scale Mensurative Experiment. Journal of AppliedIchthyology. 20, 493–501.[4] Carreño, A. Impactos del virus ISA en Chile. 2010. Publicaciones Fundación Terram.(www.terram.cl).[5] www.aqua.cl.[6] Cabello, F. 2004. Enfermedades Originadas en el Mar: ¿Síntomas del Deterioro de laBiodiversidad Marina en la Décima Región?. Revista Ambiente y Desarrollo. 20(3) - 21(1), 80-87.[7] Soto, D., Jara, F., Moreno C. 2001. Escaped Salmon in the Inner Sea, Southern Chile: FacingEcological and Social Conflicts. Ecological Applications. 11(6), 1750–1762.[8] Cabello, F. 2004. Antibiotics and Aquaculture in Chile: Implications For Human and AnimalHealth. Revista Médica de Chile. 132, 1001-1006.

73[9] Ilse, A., Ferrer, P., Valenzuela, P., Burzio, L. 2003. Immunoresponse of Coho SalmonImmunized with a Gene Expression Library from Piscirickettsia salmonis. BiologicalResearch. 36, 3-4.[10] González, R. 2007. Interacciones entre Cloruro de Trifeniltetrazolio y Polímeros Solubles enAgua. Tesis de pregrado, Escuela de Química y Farmacia, Facultad de Ciencias.Universidad Austral de Chile.[11] Villatoro, J. 2008. Interacciones entre Tintes de Rodamina y Polímeros Solubles en Agua”.Tesis de pregrado, Escuela de Química y Farmacia, Facultad de Ciencias. UniversidadAustral de Chile.[12] Murano, E. 1998 Use of Natural Polysaccharides in the Microencapsulation Technique.Journal of Applied Ichthyology. 14, 245-249.[13] Araya. R. 2010. “Sensibilidad de Complejos Fluorescentes de Rodamina 6G-Polielectrólitosa la Presencia de CU 2+ en Solución”. Tesis de pregrado, Escuela de Biología Marina, Facultadde Ciencias. Universidad Austral de Chile.[14] Moreno-Villoslada, I., Torres-Gallegos, C., Araya-Hermosilla, R., Fuenzalida, J., Marambio,O., Pizarro, G., Flores, M., Murakami, T., Nishide, H. 2010. “Diferent Models on Binding ofAromatic Counterions to Polyelectrolytes”. Molecular Crystals and Liquid Crystals. 522,25/[437]-36/[448].

74[15] Moreno-Villoslada, I., Torres-Gallegos, C., Araya-Hermosilla, R., Nishide, H. 2010.Influence of the Linear Aromatic Density on Methylene Blue Aggregation Around PolyanionsContaining Sulfonate Groups. Journal Physical Chemistry B. 114, 4151-4158.[16] Moreno-Villoslada, I., Flores, M., Marambio, O., Pizarro, G., Nishide, H. 2010.Polyaromatic-Anion Behavior of Different Polyelectrolytes Containing BenzenecarboxylateUnits. Journal Physical Chemistry B. 114, 7753-7759.[17] Moreno-Villoslada, I., Gonzálex, F., Rivera, L., Hess, S., Rivas, Bernabé, Shibue, T.,Nishide, H. 2007. Aromatic-Aromatic Interaction between 2,3,5-Triphenyl-2H-tetrazoliumChloride and Poly(sodium 4-styrenesulfonate). Journal Physical Chemistry B. 111, 6146-6150.[18] Moreno-Villoslada, I., Fuenzalida, J., Tripailaf, G., Araya-Hermosilla, R., Pizarro, G.,Marambio, O., Nichide, H. 2010. Comparative Study of the Self-Aggregation of Rhodamine 6Gin the Presence of Poly(sodium 4-styrenesulfonato), Poly(N-phenylmaleimide-co-acrylic acid),Poly(styrene-alt-maleic acid), and Poly(sodium acrylate). Journal Physical Chemestry B. 114,11983-11992.[19] Poncelet, D., Teunou, E. 2002. Bioencapsulation of Nutraceutics for Food Applications.Workshop Brussels, Belgium. 26-30.[20] Ghosh, S. 2006. Functional Coatings and Microencapsulation: A General Perspective.www.johnwiley.com.au.

75[21] Venkata, N., Muthu, P., Narayan, S., Surya, K., Seetha, P., Srawan, G. 2010.Microencapsulation Techniques, Factors Influencing Encapsulation Efficiency. Journal ofMicroencapsulation. 27(3), 187–197.[22] Lopretti, M., Barreiro, F., Fernandes, I., Damboriarena, A., Ottati, C., Olivera, A. 2007.Microencapsulación de Compuestos de Actividad Biológica. Publicación anual del laboratoriotecnológico del Uruguay. No. 2.[23] Tonnesen, H.; Karlsen, J. 2002. Alginate in Drug Delivery Systems. Drug Developmentand Industrial Pharmacy. 28(6), 621-630.[24] Alison, C., Hodsdon, A., John, R., Mitchell. B., Martyn, C., Davies, A., Colin, D., Melia A.1995. Structure and Behaviour in Hydrophilic Matrix Sustained Release Dosage Forms: 3. TheInfluence of pH on the Sustained-Release Performance and Internal Gel Structure of SodiumAlginate Matrices. Journal of Controlled Release. 33, 143-152.[25] Meera, G., Abraham E. 2006. Polyionic Hydrocolloids for the Intestinal Delivery of ProteinDrugs: Alginate and Chitosan — a Review. Journal of Controlled Release. 114, 1–14.[26] Gombotz, W., Wee, S. 1998. Protein Release from Alginate Matrices. Advanced DrugDelivery Reviews. 31, 267–285.[27] Kurt, I., Gudmund, S., Olav, S. 1997. Alginate Based New Materials. InternationalJournal of Biological Macromolecules. 2(1-2), 47-55.[28] Wang, X.; Spencer, H. 1998. Calcium Alginate Gels: Formation and Stability in thePresence of an Inert Electrolyte. Polymer. 39(13), 2759-2764.

76[29] Tu, J., Bolla, S., Barr, J., Miedema, J., Li, X., Jasti, B. 2005. Alginate MicroparticlesPrepared by Spray-Coagulation Method: Preparation, Drug Loading and ReleaseCharacterization. International Journal of Pharmaceutic. 303, 171-181.[30] Kikuchi, A., Kawabuchi, M., Watanabe, A., Sugihara M., Sakuraia, Y., Okanoa, T. 1999.Effect of Ca 2+ Alginate Gel Dissolution on Release of Dextran with Different Molecular Weights.Journal of Controlled Release. 58, 21–28.[31] Murata, Y., Maeda, T., Miyamoto, E., Kawashima, S. 1993. Preparation of Chitosan-Reinforced Alginate Gel Beads Effects of Chitosan on Gel Matrix Erosion. InternationalJournal of Pharmaceutics. 96, 139-145.[32] Kikuchi, A., Kawabuchi, M., Sugihara M., Sakuraia, Y., Okanoa, T. 1997. Pulsed DextranRelease From Calcium Alginate Gel Beads. Journal of Controlled Release. 47, 21–29.[33] Gasserod, O., Smidsrod, O., Skjask-Break, G. 1998. Microcapsules of Alginate-Chitosan –l.A Quantitative Study of the Interaction Between Alginate and Chitosan. Biomaterials. 19, 1815-1825.[34] Hari, P., Chandy, T., Chandra, S. 1996. Chitosan/ Calcium-Alginate Beads for Oral Deliveryof Insulin. Journal of Applied Polymer Science. 59, 1795-1801.[35] Taqieddin, E., Amiji, M. 2004. Enzyme Immobilization in Novel Alginate–Chitosan Core-Shell Microcapsules. Biomaterials. 25(10), 1937–1945.[36] Stockwell A., Davis S., Walker, S. 1986. In Vitro Evaluation of Alginate Gel Systems asSustained Release Drug Delivery Systems. Journal of Controlled Release. 3(1-4), 167-175.

77[37] Talukder, R., Fassihi, R. 2004. Gastroretentive Delivery Systems: Hollow Beads. DrugDevelopment and Industrial Pharmacy. 30(4), 405–412.[38] Ghersod, O., Jolliffe, I., Hampson, F., Dettmar, P., Skjak-Break, G. 1998. The Enhancementof the Bioadhesive Properties of Calcium Alginate Gel Beads by Coating with Chitosan.International Journal of Pharmaceutics. 175, 237-246.[39] Murata, Y., Sasaki, N., Miyamoto, E., Kawashima, S. 2000. Use of floating Alginate GelBeads for Stomach-Specific Drug Delivery. European Journal of Pharmaceutics andBiopharmaceutics. 50, 221-226.[40] Huguet, M., Dellacherie E. 1996. Calcium Alginate Beads Coated with Chitosan: Effect ofthe Structure of Encapsulated Materials on Their Release. Process Biochemist. 31(8), 745-751.[41] Hari, P., Chandy T., Sharma C. 1996. Chitosan/calcium alginate microcapsules for intestinaldelivery of nitrofurantoin. Journal of Microencapsulation. 13(3), 319-329.[42] Anal, A., Bhopatkar, D., Tokura, S., Tamura, H., Stevens, W. 2003. Chitosan-AlginateMultilayer Beads for Gastric Passage and Controlled Intestinal Release of Protein. DrugDevelopment and Industrial Pharmacy. 29(6), 713-724.[43] Kuen, Y., Won, H., Wan, S. 1997. Polyelectrolyte Complexes of Sodium Alginate withChitosan or its Derivatives for Microcapsules. Journal of Applied Polymer Science. 63, 425-432.[44] Li, X., Jin, L., McAllister T, Stanford, K., Xu, J., Lu, Y., Zhen, Y., Sun Y., Xu Y. 2007.Chitosan-Alginte Microcapusles for Oral Delivery of Egg Yolk Immuniglobulin. JournalAgricultural and Food Chemistry. 55( 8), 2911-2917.

78[45] Junginger, H., Verhoef, J. 1998. Macromolecules as Safe Penetration Enhancers forHydrophilic Drugs a Fiction?. PSTT. 1, 9.[46] Gasserod, O., Sannes, A., Skjask-Break, G. 1999. Microcapsules of Alginate-Chitosan. II. AStudy of Capsule Stability and Permeability. Biomaterials. 20, 773-783.