helena - Agentúra Harmony vos

HL_2_1290P_2004_09_6.qxp 07/10/2004 13:58 Page 2helenawww.helena-biosciences.comBioSciencesEuropeInstructions For UseSAS-1 Plus High Resolution-12Cat. No. 200700SAS-1 Plus Haute résolution-12Fiche techniqueRéf. 200700SAS-1 Plus High Resolution-12AnleitungKat. Nr. 200700SAS-1 Plus ad alta risoluzione-12Istruzioni per l'usoCod. 200700SAS-1 Plus Alta Resolución-12Instrucciones de usoNo de catàlogo 200700ContentsEnglish 1Français 6Deutsch 12Italiano 18Español 24

HL_2_1290P_2004_09_6.qxp 07/10/2004 13:58 Page 1SAS-1 PLUS HIGH RESOLUTION-12INTENDED PURPOSEThe SAS-1 Plus High Resolution Kit is intended for the separation of serum or plasma proteins byagarose gel electrophoresis.Serum contains over 100 individual proteins, each with a specific set of functions which are subject tospecific variation in concentration under different pathological conditions 1 .Since the introduction of moving boundary electrophoresis by Tiselius 2 , and the subsequent use of zoneelectrophoresis, serum proteins have been fractionated on the basis of their charge at a particular pH.The High Resolution kit separates serum proteins beyond the classical 5 band pattern into 10-15discrete fractions, thereby increasing the diagnostic usefulness of the protein patterns 3-5 . Approximately15 serum proteins have been studied extensively because they may be measured easily 6-9 .The SAS-1 Plus High Resolution Kit separates serum / plasma proteins according to charge in a bufferedagarose gel. The protein bands are then fixed and stained for visualisation and qualitativeinterpretation.WARNINGS AND PRECAUTIONSAll reagents are for in-vitro diagnostic use only. Do not ingest or pipette by mouth any kit component.Wear gloves when handling all kit components. Refer to the product safety data sheet for risk andsafety phrases and disposal information.COMPOSITION1. SAS-1 Plus High Resolution GelContains agarose in a barbital buffer with thiomersal and sodium azide as preservatives. The gelis ready for use as packaged.2. High Resolution Stain ConcentrateContains concentrated high resolution stain. Dilute the contents of the bottle to 700ml withdestain solution and mix well. Store in a tightly stoppered bottle.3. Other Kit ComponentsEach kit contains Instructions For Use and sufficient Blotter C to complete 10 gels.STORAGE AND SHELF-LIFE1. SAS-1 Plus High Resolution GelGels should be stored at 15...30°C and are stable until the expiry date indicated on the package.DO NOT REFRIGERATE OR FREEZE. Deterioration of the gel may be indicated by 1) crystallineappearance indicating the gel has been frozen, 2) cracking and peeling indicating drying of the gelor 3) visible contamination of the agarose from bacterial or fungal sources.2. High Resolution StainThe stain concentrate should be stored at 15...30°C and is stable until the expiry date indicated onthe label. Diluted stain solution is stable for 6 months at 15...30°C. Poor staining performancemay indicate deterioration of the stain solution.1English

HL_2_1290P_2004_09_6.qxp 07/10/2004 13:58 Page 2ITEMS REQUIRED BUT NOT PROVIDEDCat. No. 210200 Sample Applicator Blades (1 x 10)Cat. No. 210300 Sample Applicator Blades (5 x 10)Cat. No. 210100 Disposable Sample Cups (100)Cat. No. 5141 High Resolution Protein MarkerCat. No. 3100 REP PrepDestain Solution: Mix 500ml of methanol and 500ml of purified water. Add 100ml of glacial acetic acid.Store in a tightly stoppered bottle.Purified waterDrying oven with forced air capable of 60...70°C.SAMPLE COLLECTION AND PREPARATIONFresh serum or plasma is the specimen of choice. Samples may be stored covered for a maximum of48 hours at 2...6°C. The use of plasma will result in a fibrinogen band between the beta and gammafractions. The use of aged samples will cause the C3 band to migrate in the transferrin region.Urine and CSF samples can be used as samples following a suitable concentration step:Total Protein (g/L)Concentration Factor

HL_2_1290P_2004_09_6.qxp 07/10/2004 13:58 Page 3SAS-1 PLUS HIGH RESOLUTION-126. Perform the High Resolution electrophoresis:i) SAS-1 Plus users: Electrophoresis: 250 Volts, 12 mins, 18°C, 1 applicationii) SAS-3 users:Step Time (mm:ss) Temperature (°C) Voltage OtherElectrophoresisLoad Sample 00:10 21 Speed 1Apply Sample 00:10 21 Speed 1*Electrophoresis 12:00 18 250* Use Location 17. At the end of electrophoresis, remove the electrodes and remove both gel blocks using the GelBlock Remover.Staining the gela) SAS-2 (Auto-Stainer)Step Solution Time (mm:ss) Port Temperature (°C)Stain Hi-Res Stain 15:00 5Destain Destain solution 00:30 3Dry —- 10:00 65Destain Destain solution 01:00 3Destain Destain solution 01:00 3Wash Purified water 01:00 1Dry —- 05:00 65b) ManualFollow the sequence listed for the SAS-2 Auto-Stainer, using a staining bath for the Stain, Destainand Wash steps, and a drying oven for the Dry steps.Alternative Staining ProceduresTwo alternative staining protocols are available depending on the desired staining requirement of theuser.1. Substitute Amido Black Stain (Cat. No. 3048) for the High Resolution Stain. FOR SERUM/PLASMA SAMPLES ONLY. Follow the staining protocol outlined above.The amido black stain is less sensitive than the coomassie stain, but provides a more uniformstaining quality, allowing a better qualitative evaluation of differences in band intensity.2. Double Staining Technique. FOR CSF AND URINE SAMPLES ONLY. After electrophoresisperform amido black staining through to the completed gel then perform the coomassie stainingtechnique through to the completed gel.The double stain technique may allow clearer visualisation of urine protein bands and oligoclonalbands in CSF.3English

HL_2_1290P_2004_09_6.qxp 07/10/2004 13:58 Page 4NOTE: Do not stain the gel in the SAS-4, as the stain and solution destain contain methanol.INTERPRETATION OF RESULTSIt is recommended that any evaluation of the gel is performed against normal patterns produced forthis method in each individual laboratory.Visually inspect the gel for the presence or absence of particular protein bands.Figure 1 illustrates the migration patterns of the main plasma proteins which can be identified using theSAS-1 Plus High Resolution Procedure.Figure 1Pre-Albuminα 1-Acid Glycoproteinα-Lipoproteinα 1-AntichymotrypsinHaptoglobinC3IgAIgGAlbuminα 1-Antitrypsinα 1-MacroglobulinTransferrinβ-LipoproteinFibrinogen(in plasma only)IgMHigh Resolution protein electrophoresis patterns are primarily interpreted by comparing the relativeintensities of the bands obtained on unknown samples with those obtained from normal individuals.One of the most common abnormal serum protein patterns is that observed in the non-specificinflammatory response, which is characterized by an increase in α1-antitrypsin and haptoglobin withdecreased prealbumin, albumin and transferrin. While it is not useful in establishing a general diagnosis,it is useful in monitoring a patient’s response to therapy.Other examples of clinically important variations are:1. Elevation of the transferrin band, suggesting low levels of iron.2. Presence of monoclonal proteins, suggesting abnormalities in the immune system.3. Low haptoglobin, suggesting elevated red cell turnover, or in-vitro haemolysis.4. CRP presence, indicating an acute inflammatory response.5. Low prealbumin, albumin and transferrin with diffuse hypergammaglobulinaemia, suggestingchronic inflammation, infection or antigenic stimulation.6. Low C3 on fresh samples, suggesting complement consumption.High Resolution protein electrophoresis is an excellent analytical tool to gain a broad overview of urineproteins 3,10 . Normal urine normally contains a trace of albumin, and sometimes a faint transferrin band.Glomerular-type proteinuria usually consistes of strong bands of albumin, both α1-acid glycoproteinand a1-antitrypsin in a broad α1 zone and transferrin in the β1 region. The serum pattern showsdecreases in these proteins, with increases in the proteins retained by the glomerulus. The urinepattern in Tubular proteinuria usually consistes of a faint albumin band, a double band in the α2 regiondue to α2-microglobulin, a strong band in the mid-beta region due to β2-microglobulin and sometimesdiffuse background staining in the gamma region due to free light chains. Chronic renal disease, orrenal failure can lead to a mixed type pattern, caused by damage to both the tubules and glomerulus.4

HL_2_1290P_2004_09_6.qxp 07/10/2004 13:58 Page 5SAS-1 PLUS HIGH RESOLUTION-12An elevation or decrease in particular sample components or the detection of unusual samplecomponents requires further investigation. The completed SAS-1 Plus High Resolution gel is stable foran indefinite period of time.PERFORMANCE CHARACTERISITCSSensitivityThe method is sensitive to 60mg/L per band, determined as the lowest concentration of protein whichwas evident as a discrete band on the completed gel.LinearityThe linearity of the method is a function of densitometer specification as well as gel performance.It is recommended that each customer determine the linearity of the method based upon thedensitometer in use in the laboratory.BIBLIOGRAPHY1. Alper, C.A. ‘Plasma Protein Measurements as a Diagnostic Aid’, N. Eng. J. Med., 1974; 291 :287-290.2. Tiselius, A. ‘A New Approach for Electrophoretic Analysis of Colloidal Mixtures’, Trans. FaradaySoc., 1937; 33 : 524.3. Laurell, C.B. ‘Composition and Variation of the Gel Electrophoretic Fractions of Plasma,Cerebrospinal Fluid and Urine’ Scand. J. Clin. Lab. Invest., 1972; 29 (Suppl. 24) : 71.4. Killingsworth, L.M. et al. ‘Protein Analysis, Deciphering Cerebrospinal Fluid Patterns’ Diag. Med.,1980; March/April : 1-7.5. Killingsworth, L.M. et al. ‘Protein Analysis, Finding Clues to Disease in Urine’ Diag. Med., 1980;May/June : 69-75.6. Killingsworth, L.M. ‘Clinical Applications of Protein Determinations in Biological Fluids Other ThanBlood’ Clin. Chem., 1982; 28(5) : 1093-1102.7. Ritzmann, S.E and Daniels, J.C. ‘Diagnostic Proteinology: Separation and Characterization ofProteins. Qualitative and Quantitative Assays’ in Laboratory Medicine, Harper & Row, Inc.,Hagerstown, 1979.8. Killingsworth, L.M. et al. ‘Protein Analysis’ Diag. Med., 1980; Jan/Feb : 3-15.9. Killingsworth, L.M. ‘Plasma Protein Patterns in Health and Disease’ CRC Critical Reviews inClinical Laboratory Sciences, August 1979.10. Peterson, P.A., Ervin, P.E. and Beggard, I. ‘Differentiation of Glomerular, Tubular and NormalProteinuria: determination of Urinary Excretion of α2-microglobulin, Albumin and Total Protein’J. Clin. Invest., 1969; 48 : 1189-1198.5English

HL_2_1290P_2004_09_6.qxp 07/10/2004 13:58 Page 6UTILISATIONLe kit SAS-1 Plus Haute résolution est destiné à la séparation des protéines du sérum ou du plasma parélectrophorèse en gel d’agarose.Le sérum contient plus de 100 protéines qui ont chacune une fonction spécifique et qui peuvent subirdes variations quantitatives en fonction de diverses conditions pathologiques 1 .Depuis l’introduction par Tiselius 2de la mobilité électrophorétique, les protéines sériques sontfractionnées en fonction de leur charge à un pH déterminé.Le kit Haute résolution sépare les protéines sériques au-delà des 5 bandes classiques en 10 à 15fractions différentes, ce qui augmente l’utilité diagnostique des protéinogrammes 3-5 . Quinze protéinessériques ont été largement étudiées du fait de la facilité de leur dosage 6-9 .Le kit SAS-1 Plus Haute résolution sépare les protéines du sérum ou du plasma en fonction de leurcharge en gel d’agarose tamponné. Elles sont ensuite fixées et colorées afin de permettre leurvisualisation et une interprétation qualitative.PRÉCAUTIONSTous les réactifs sont à usage diagnostic in-vitro uniquement. Ne pas ingérer ou pipeter à la boucheaucun composant. Porter des gants pour la manipulation de tous les composants. Se reporter auxfiches de sécurité des composants du kit pour la manipulation et l’élimination.COMPOSITION1. Plaque SAS-1 Plus Haute résolution-12Contient de l’agarose dans un tampon barbital additionné de thimérosal et d’azide de sodiumcomme conservateurs. Le gel est prêt à l’emploi.2. Colorant concentré Haute résolutionContient du colorant concentré de haute résolution. Diluer le contenu du flacon dans 700ml desolution décolorante et bien mélanger. Conserver en bouteille hermétiquement fermée.3. Autres composants du kitChaque kit contient également 1 fiche technique et des buvards C pour 10 gels.STOCKAGE ET CONSERVATION1. Plaque SAS-1 Plus Haute résolution-12Les gels doivent être conservés entre 15...30°C; ils sont stables jusqu’à la date de péremptionindiquée sur l’emballage. NE PAS RÉFRIGÉRER OU CONGELER. Les conditions suivantesindiquent une détérioration du gel: 1) des cristaux visibles indiquant que le gel a été congelé, 2) descraquelures indiquant une déshydratation du gel, 3) une contamination visible, bactérienne oufongique.2. Colorant Haute résolutionLe colorant concentré doit être conservé entre 15...30°C; il est stable jusqu’à la date depéremption indiquée sur l’étiquette. Le colorant reconstitué est stable 6 mois entre 15...30°C.Si la performance de coloration diminue, cela indique une détérioration de la solution colorante.6

HL_2_1290P_2004_09_6.qxp 07/10/2004 13:58 Page 7MATÉRIELS NÉCESSAIRES NON FOURNISRéf. 210200 Applicateurs échantillons (1 x 10)Réf. 210300 Applicateurs échantillons (5 x 10)Réf. 210100 Cupules échantillons jetables (100)Réf. 5141 Marqueur protéique haute résolutionRéf. 3100 Solution de REP-prepSolution décolorante: Mélanger 500ml d’eau distillée avec 500ml de méthanol. Ajouter 100ml d’acideacétique glacial. Conserver en bouteille hermétiquement fermée.Eau distilléeÉtuve de séchage à convection forcée offrant une température entre 60...70°C.PRÉLÈVEMENTS DES ÉCHANTILLONSL’utilisation de sérum ou plasma fraîchement prélevé est fortement recommandée. Les échantillonspeuvent être conservés bouchés 48 heures entre 2...6°C. L’utilisation de plasma laisse apparaître unebande de fibrinogène entre les fractions bêta et gamma. L’utilisation d’échantillons anciens peutentraîner l’apparition d’une bande C3 qui migre dans la zone de la transferrine.Les échantillons d’urine ou de LCR peuvent être utilisés après concentration:Protéines totales (g/l)Facteur de concentration

HL_2_1290P_2004_09_6.qxp 07/10/2004 13:58 Page 85. Placer 1 applicateur en position supérieure dans l’instrument (SAS-3: encoche 8).6. Réaliser l’électrophorèse haute résolution:i) SAS-1 Plus:Électrophorèse: 250 volts, 12 min., 18°C, 1 dépôtii) SAS-3:Étape Durée (mm:ss) Température (°C) Tension AutreÉlectrophorèseCharger échantillon 00:10 21 Vitesse 1Déposer échantillon 00:10 21 Vitesse 1*Électrophorèse 12:00 18 250* Utiliser Emplacement 1 (Loc 1)7. Une fois la migration terminée, enlever les électrodes et les ponts d’agarose à l’aide de la raclette.Coloration du gela) SAS-2 (module de coloration)Étape Solution Durée (mm:ss) Orifice Température (°C)Colorer Colorant Haute rés. 15:00 5Décolorer Solution décolorante 00:30 3Sécher — 10:00 65Décolorer Solution décolorante 01:00 3Décolorer Solution décolorante 01:00 3Laver Eau distillée 01:00 1Sécher — 05:00 65b) Méthode manuelleSuivre la séquence indiquée pour le SAS-2, en utilisant des bains de colorant, de décolorant et desolution de lavage. Sécher dans une étuve ventilée.Méthodes de coloration alternativesDeux protocoles de coloration alternatifs sont possibles suivant la coloration requise par l’opérateur.1. Substituer le colorant Haute résolution par du noir amido (réf. 3048). UNIQUEMENT POUR LESÉRUM OU LE PLASMA. Suivre le protocole de coloration indiquée auparavant. Le noir amidoest moins sensible que le bleu de Coomassie, mais il donne une coloration plus uniforme, ce quipermet d’obtenir une meilleure évaluation qualitative des différentes intensités de bandes.8

HL_2_1290P_2004_09_6.qxp 07/10/2004 13:58 Page 9SAS-1 PLUS HAUTE RÉSOLUTION-122. Technique de double coloration. UNIQUEMENT POUR L’URINE ET LE LCR. Après l’étaped’électrophorèse, réaliser le processus complet de coloration du gel d’abord au noir amido puis aubleu de Coomassie. La double coloration permet une visualisation plus claire du protéinogrammeurinaire et des bandes oligoclonales dans le LCR.REMARQUE: Ne pas colorer le gel dans le SAS-4 car le colorant et la solution décolorantecontiennent du méthanol.INTERPRÉTATION DES RÉSULTATSIl est recommandé de réaliser chaque évaluation en comparant le gel à un modèle normal obtenu dansles mêmes conditions pour chaque laboratoire.Une inspection visuelle permet de déterminer si les bandes d’une protéine spécifique sont présentesou non.La figure 1 illustre la migration des principales protéines plasmatiques pouvant être identifiées par latechnique SAS-1 Plus Haute résolution.Fig. 1Préalbumineα1 glycoprotéine acideα- lipoprotéineα 1 antichymotrypsineHaptoglobineC3IgAIgGAlbumineα 1 antitrypsineα 1 macroglobulineTransferrineβ-lipoprotéineFibrinogène(dans le plasma uniquement)IgMLes migrations électrophorétiques de haute résolution sont d’abord interprétées en comparantl’intensité relative des bandes des échantillons analysés avec celle d’un échantillon normal de référence.Chez un patient ayant une réaction inflammatoire non spécifique, le protéinogramme sérique secaractérise le plus couramment par une augmentation de l’alpha-1-antitrypsine et de l’haptoglobineavec une diminution de la préalbumine, de l’albumine et de la transferrine par rapport aux valeursnormales. Cependant, même s’il ne sert pas à établir un diagnostic, il est utile pour suivre la réponsed’un patient à une thérapie.Autres exemples de variations cliniques importantes:1. Élévation de la bande de transferrine, suggérant un faible taux de fer.2. Présence de bande monoclonale, suggérant une anormalité dans le système immunitaire.3. Diminution de l’haptoglobine, suggérant un renouvellement élevé des globules rouges ou unehémolyse in-vitro.4. Présence de CRP, indiquant une réponse inflammatoire aiguë.5. Diminution de la préalbumine, de l’albumine et de la transferrine avec unehypergammaglobulinémie diffuse, suggérant une inflammation chronique, une infection ou unestimulation antigénique.6. Diminution du C3 dans un échantillon frais, indiquant une consommation du complément.9Français

HL_2_1290P_2004_09_6.qxp 07/10/2004 13:58 Page 10L’électrophorèse Haute résolution est un excellent outil analytique pour observer les protéinesurinaires 3,10 . Une urine normale contient généralement des traces d’albumine et parfois une faiblebande de transferrine. Une protéinurie de type glomérulaire révèle la présence d’une forte banded’albumine, avec de l’alpha-1-glycoprotéine et de l’alpha-1-antitrypsine dans la zone alpha-1 et de latransferrine dans la zone bêta-1. Le protéinogramme sérique indique une diminution de ces mêmesprotéines avec une augmentation des protéines retenues par le glomérule. Une tubulopathie secaractérise en général par une faible bande d’albumine, une double bande dans la région des alpha-2due à l’alpha-2-microglobuline, une forte bande dans la région médiane bêta due à la bêta-2-microglobuline avec parfois une coloration diffuse dans les gamma due aux chaînes légères libres.Une atteinte rénale chronique ou une insuffisance rénale donne lieu à un mélange des deux typesprécédents à cause des lésions des tubules et des glomérules.Une élévation ou une diminution d’un composant particulier ou la détection d’une protéine inhabituelledoit conduire à d’autres investigations. Après traitement, le gel SAS-1 Plus Haute résolution est stableindéfiniment.PERFORMANCESSensibilitéLa méthode est sensible à partir de 60mg/L par bande, concentration la plus faible en protéinespermettant la visualisation d’une fine bande une fois le gel terminé.LinéaritéLa linéarité est fonction des caractéristiques du densitomètre ainsi que des performances du gel.Il est recommandé à chaque client de déterminer la linéarité de cette méthode en fonction dudensitomètre utilisé au sein du laboratoire.BIBLIOGRAPHIE1. Alper, C. A. ‘Plasma Protein Measurements as a Diagnostic Aid’, N. Eng. J. Med., 1974 ; 291 :287-290.2. Tiselius, A. ‘A New Approach for Electrophoretic Analysis of Colloidal Mixtures’, Trans. FaradaySoc., 1937 ; 33 : 524.3. Laurell, C. B. ‘Composition and Variation of the Gel Electrophoretic Fractions of Plasma,Cerebrospinal Fluid and Urine’ Scand. J. Clin. Lab. Invest., 1972 ; 29 (suppl. 24) : 71.4. Killingsworth, L. M. et al. ‘Protein Analysis, Deciphering Cerebrospinal Fluid Patterns’ Diag. Med.,1980; mars/avril : 1-7.5. Killingsworth, L. M. et al. ‘Protein Analysis, Finding Clues to Disease in Urine’ Diag. Med., 1980 ;mai/juin : 69-75.6. Killingsworth, L. M. ‘Clinical Applications of Protein Determinations in Biological Fluids OtherThan Blood’ Clin. Chem., 1982 ; 28(5) : 1093-1102.7. Ritzmann, S. E et Daniels, J.C. ‘Diagnostic Proteinology: Separation and Characterization ofProteins. Qualitative and Quantitative Assays’ in Laboratory Medicine, Harper & Row, Inc.,Hagerstown, 1979.8. Killingsworth, L. M. et al. ‘Protein Analysis’ Diag. Med., 1980 ; jan/fév : 3-15.9. Killingsworth, L. M. ‘Plasma Protein Patterns in Health and Disease’ CRC Critical Reviews inClinical Laboratory Sciences, août 1979.10

HL_2_1290P_2004_09_6.qxp 07/10/2004 13:58 Page 11SAS-1 PLUS HAUTE RÉSOLUTION-1210. Peterson, P. A., Ervin, P. E. et Beggard, I. ‘Differentiation of Glomerular, Tubular and NormalProteinuria: determination of Urinary Excretion of α2-microglobulin, Albumin and Total Protein’J. Clin. Invest., 1969; 48 : 1189-1198.11Français

HL_2_1290P_2004_09_6.qxp 07/10/2004 13:58 Page 12ANWENDUNGSBEREICHDas SAS-1 Plus High Resolution Kit ist zur Auftrennung von Serum- oder Plasmaproteinen durchAgarose-Gel-Elektrophorese bestimmt.Serum enthält über 100 einzelne Proteine, jedes mit einer Reihe spezifischer Funktionen, die unterverschiedenen pathologischen Bedingungen gewissen spezifischen Konzentrationsschwankungenunterliegen 1 . Seit der Einführung der Kapillarelektrophorese durch Tiselius 2 und die darauf folgendeNutzung der Zonen-Elektrophorese sind Serumproteine aufgrund ihrer elektrischen Ladung bei einembestimmten pH-Wert fraktioniert worden. Das High Resolution Kit trennt Serumproteine über dasklassische 5-Bandenmuster hinaus in 10-15 einzelne Fraktionen, und erhöhen damit den diagnostischenNutzen der Proteinmuster 3-5 . Ungefähr 15 Serumproteine sind ausführlich untersucht worden, da sieleicht gemessen werden können 6-9 .Das SAS-1 Plus High Resolution Kit trennt in einem gepufferten Agarose-Gel die Serum-/Plasmaproteine nach ihrer Ladung auf. Die Proteinbanden werden dann fixiert und zur Visualisierungund qualitativen Interpretation angefärbt.WARNHINWEISE UND VORSICHTSMASSNAHMENAlle Reagenzien sind nur zur in-vitro Diagnostik bestimmt. Nicht einnehmen oder mit dem Mundpipettieren. Beim Umgang mit den Kit-Komponenten ist das Tragen von Handschuhen erforderlich.Siehe Sicherheitsdatenblatt mit den Gefahrenhinweisen und Sicherheitsvorschlägen sowieInformationen zur Entsorgung.INHALT1. SAS-1 Plus High Resolution GelEnthält Agarose in einem Barbitalpuffer mit Thiomersal und Natriumazid als Konservierungsmittel.Das Gel ist gebrauchsfertig verpackt.2. High Resolution FarbstoffkonzentratEnthält konzentrierte High Resolution Farbstofflösung. Den Inhalt der Flasche mit Entfärbelösungauf 700ml verdünnen. Gut schütteln. In einer fest verschlossenen Flasche aufbewahren.3. Weitere Kit-KomponentenJedes Kit enthält eine Methodenbeschreibung sowie ausreichend Blotter C für 10 Gele.LAGERUNG UND STABILITÄT1. SAS-1 Plus High Resolution GelGele sollten bei 15...30°C gelagert werden und sind bis zum aufgedruckten Verfallsdatum stabil.NICHT IM KÜHLSCHRANK ODER TIEFKÜHLSCHRANK AUFBEWAHREN! Der Zustand desGels kann sich verschlechtern. Dafür gibt es folgende Merkmale: 1) Kristallisation weist aufvorangegangenes Einfrieren hin, 2) Risse und Ablösen weisen auf ein Austrocknen des Gels hin, und3) sichtbare Kontamination der Agarose durch Bakterien oder Pilze.2. High Resolution FärbungDas Farbstoffkonzentrat sollte bei 15...30°C gelagert werden und ist bis zum aufgedrucktenVerfallsdatum stabil. Die verdünnte Farbstofflösung ist bei einer Temperatur von 15...30°C 6Monate stabil. Schlechte Färbeleistung kann auf Verfall der Färbelösung hinweisen.12

HL_2_1290P_2004_09_6.qxp 07/10/2004 13:58 Page 13NICHT MITGELIEFERTES, ABER BENÖTIGTES MATERIALKat. Nr. 210200 Probenapplikatorkämme (1 x 10)Kat. Nr. 210300 Probenapplikatorkämme (5 x 10)Kat. Nr. 210100 Einweg-Probengefäße (100)Kat. Nr. 5141 High Resolution Protein-MarkerKat. Nr. 3100 REP-Prep-LösungEntfärbelösung: 500ml Methanol mit 500ml dest. Wasser mischen. 100ml Eisessigsäure hinzufügen.In einer fest verschlossenen Flasche aufbewahren.Destilliertes WasserTrockenschrank mit Umluft und einer Temperaturleistung von 60...70°C.PROBENENTNAHME UND VORBEREITUNGFrisches Serum oder Plasma ist das Untersuchungsmaterial der Wahl. Proben können abgedecktmaximal 48 Stunden bei 2...6°C gelagert werden. Bei der Verwendung von Plasma entsteht zwischender Beta- und Gammafraktion eine Fibrinogen-Bande. Altes Probenmaterial lässt die C3-Bande in denBereich des Transferrins wandern.Urin und Liquor können nach entsprechender Konzentrierung als Proben eingesetzt werden:Gesamt-Protein (g/L)Konzentrierungsfaktor< 0,5 100-fach0,5 -1,0 50-fach1,0 -3,0 25-fach3,0 -6,0 10-fach6,0 -10,0 5-fachSAS-1 PLUS HIGH RESOLUTIONNach Konzentrierung sollten die Urin- und Liquorproben direkt auf das Gel aufgetragen werden.SCHRITT-FÜR-SCHRITT METHODE1. 35µl Probe in die entsprechende Vertiefung der Probenplatte oder Einweg- Probengefäßepipettieren.i) SAS-1 Plus Benutzer: SAS-1 Probenplatte verwenden. Die Probenplatte vorsichtig auf denApplikatoreinschub stellen. Darauf achten, dass die Platte in Position fest eingerastet ist.ii) SAS-3 Benutzer: SPIFE / SAS-3 Probenvorlageplatte verwenden. Mit den Haltestiften derProbenbasis die Probenplatte vorsichtig einrichten. Sicherstellen, dass die Platte richtig eingesetztist.2. Das Gel aus der Verpackung nehmen und:i) SAS-1 Plus Benutzer: 400µL REP-Prep-Lösung auf die Kühlplatte verteilen. Das Gel mit derAgaroseseite nach oben auf die Kühlplatte legen, positive und negative Seite an den passendenElektrodenhaltern ausrichten. Darauf achten, dass unter dem Gel keine Luftblasen sind.ii) SAS-3 Benutzer: Die Führungsschiene auf die Stifte setzen und 400µl REP Prep auf dieKammermitte verteilen. Das Gel mit der Agaroseseite nach oben in die Kammer legen und mitHilfe der Schiene die positive und negative Seite an den passenden Elektrodenhaltern ausrichten.Darauf achten, dass unter dem Gel keine Luftblasen sind.3. Die Geloberfläche mit einem Blotter C blotten, Blotter verwerfen.13Deutsch

HL_2_1290P_2004_09_6.qxp 07/10/2004 13:58 Page 144. i) SAS-1 Plus Benutzer: Die Elektroden auf den Elektrodenhaltern befestigen, damit sie mit denPufferblöcken in Kontakt stehen. BENUTZEN SIE NICHT DIE ABDECKUNG.ii) SAS-3 Benutzer: Die Elektroden auf den Elektrodenhaltern befestigen, damit sie mit denPufferblöcken in Kontakt stehen.5. 1 Applikatorkamm-Halterung in der oberen Position auf dem Gerät anbringen, (SAS-3 Benutzer:Schlitz 8).6. High Resolution-Elektrophorese durchführen:i) SAS-1 Plus Benutzer: Elektrophorese: 250 Volt, 12 Min., 18°C, 1 Applikationii) SAS-3 Benutzer:Schritt Dauer (mm:ss) Temperatur (°C) Spannung AndereElektrophoreseProbenaufnahme 00:10 21 Geschwindigkeit 1Probenapplikation 00:10 21 Geschwindigkeit 1*Elektrophorese 12:00 18 250* Platz 1 verwenden7. Nach Elektrophorese-Ende, Elektroden sowie beide Gel-Blöcke mit dem Gelblock-Entfernerentfernen.Färben des Gelsa) SAS-2 (Auto-Stainer)Schritt Lösung Dauer (mm:ss) Anschluss Temperatur (°C)Farbstoff Hi-Res-Farbstoff 15:00 5Entfärben Entfärbelösung 00:30 3Trocknen —- 10:00 65Entfärben Entfärbelösung 01:00 3Entfärben Entfärbelösung 01:00 3Waschen Destilliertes Wasser 01:00 1Trocknen —- 05:00 65b) ManuellDem für den SAS-2 Auto-Stainer angegebenen Ablauf folgen. Zum Färben, Entfärben und Waschenein Färbebad, und zum Trocknen einen Trockenschrank verwenden.14

HL_2_1290P_2004_09_6.qxp 07/10/2004 13:58 Page 15SAS-1 PLUS HIGH RESOLUTIONAlternative FärbemethodenZwei alternative Färbemethoden sind je nach gewünschtem Färbebedarf des Anwenders möglich.1. High Resolution Farbstoff (Kat. Nr. 3048) gegen Farbstoff „Amidoschwarz“ austauschen.NUR FÜR SERUM / PLASMAPROBEN. Nach der oben angegebenen Färbeanleitung färben. DerFarbstoff Amidoschwarz ist weniger empfindlich als der Coomassie-Farbstoff, liefert aber einegleichmäßigere Färbequalität und gestattet damit eine bessere qualitative Auswertung derUnterschiede in der Bandenintensität.2. Zweifach-Färbemethode. NUR FÜR LIQUOR UND URINPROBEN Nach der Elektrophoresedas fertige Gel mit „Amido Schwarz“ färben, anschließend die Färbung mit Coomassiedurchführen. Die zweifache Färbetechnik gestattet eine deutlichere Darstellung derProteinbanden im Urin und der Oligoklonal-Banden im Liquor.BITTE BEACHTEN: Gel nicht im SAS-4 färben, da Farbstoff und Entfärbelösung Methanol enthalten.AUSWERTUNG DER ERGEBNISSEEs wird empfohlen, die Auswertung des Gels gegen Standard-Proteine vorzunehmen, die für dieseMethode in dem entsprechenden Labor ermittelt worden sind.Das Gel optisch auf An- oder Abwesenheit von bestimmten Proteinbanden ansuchen.Abbildung 1 zeigt die Migrationsmuster der Haupt-Plasmaproteine, die mit der SAS-1 Plus HighResolution Methode differenziert werden können.Abb. 1:PräalbuminAlpha-1-saures-GlykoproteinAlpha-LipoproteinAlpha-1-AntitrypsinHaptoglobinC3IgAIgGAlbuminá-1-AntitrypsinAlpha-1-MakroglobulinTransferrinBeta-LipoproteinFibrinogen(nur im Plasma)IgMDie Proteinmuster der High Resolution Elektrophorese werden in erster Linie durch Vergleichzwischen der relativen Intensität der Banden in der unbekannten Probe und derjenigen von normalenProbanden interpretiert. Eine der häufigsten pathologischen Serumproteinmuster ist das derunspezifischen Entzündungsreaktion, die durch einen Anstieg von Alpha-1-Antitrypsin und Haptoglobinbei gleichzeitiger Abnahme von Präalbumin, Albumin und Transferrin charakterisiert ist. Obwohl dasfür eine allgemeine Diagnosestellung nicht besonders hilfreich ist, so erweist es sich doch beimPatienten-Monitoring auf eine Therapiereaktion als nützlich.15Deutsch

HL_2_1290P_2004_09_6.qxp 07/10/2004 13:58 Page 16Andere Beispiel wichtiger klinischer Veränderungen sind:1. Erhöhung der Transferrin-Bande, die auf niedrige Eisenwerte hinweist.2. Anwesenheit monoklonaler Proteine, die auf Anomalien des Immunsystems hinweisen.3. Niedriges Haptoglobin weist auf einen erhöhten Erythrozytenumsatz oder in-vitro Hämolyse hin.4. Die Anwesenheit von CRP weist auf eine akute Entzündungsreaktion hin.5. Niedriges Präalbumin, Albumin und Transferrin mit diffuser Hypergammaglobulinämie weist aufeine chronische Entzündung, Infektion oder Antigenstimulation hin.6. Niedriges C3 in frischen Proben weist auf Komplementverbrauch hin.Die High Resolution Protein Elektrophorese ist ein ausgezeichnetes Hilfsmittel, um sich einenumfassenden Überblick über Proteine im Urin zu verschaffen 3,10 . Normaler Urin enthält für gewöhnlicheine Spur Albumin und gelegentlich eine schwache Transferrin-Bande. Glomeruläre Proteinuriebesteht gewöhnlich aus starken Albuminbanden, sowohl Alpha-1-saures-Glykoprotein wie auch Alpha-1-Antitrypsin in einem breiten Alpha-1-Bereich und Transferrin in der Alpha-1-Region. Das Serum-Muster zeigt eine Abnahme dieser Protein mit Zunahme der Proteine, die vom Glomerulumzurückbehalten wurden. Das Urinprotein-Muster in der tubulären Proteinurie besteht gewöhnlich auseiner schwachen Albuminbande, einer sich aus dem Alpha-2-Mikroglobulin ergebenden Doppelbandein der Alpha-2-Region, einer sich aus dem Alpha-2-Mikroglobulin ergebenden starken Bande in dermittleren Beta-Region und manchmal einer diffusen Hintergrundfärbung in der Gamma-Region aufGrund freier Leichtketten. Chronische Nierenerkrankungen oder Nierenversagen können durchSchädigung sowohl des Tubulus wie auch des Glomerulums zu einem Mischtyp-Bandenmuster führen.Erhöhung oder Abnahme von bestimmten Probenbestandteilen oder der Nachweis ungewöhnlicherProbenbestandteile machen weitere Untersuchungen notwendig. Das fertige SAS-1 Plus HighResolution Gel ist unbegrenzt stabil.LEISTUNGSEIGENSCHAFTENEmpfindlichkeitDie Sensibilität der Methode beträgt 60mg/L pro Bande und wurde als die niedrigste Protein-Konzentration ermittelt, die als diskrete Bande auf dem fertigen Gel zu erkennen war.LinearitätDie Linearität der Methode ist von der Densitometer-Spezifikation sowie der Leistung des Gelsabhängig. Es wird jedem Kunden empfohlen, die Linearität der Methode mit dem im Laborverwendeten Densitometer selbst zu bestimmen.LITERATUR1. Alper, C.A. ‘Plasma Protein Measurements as a Diagnostic Aid’, N. Eng. J. Med., 1974; 291 : 287-290.2. Tiselius, A. ‘A New Approach for Electrophoretic Analysis of Colloidal Mixtures’, Trans. FaradaySoc., 1937; 33 : 524.3. Laurell, C.B. ‘Composition and Variation of the Gel Electrophoretic Fractions of Plasma,Cerebrospinal Fluid and Urine’ Scand. J. Clin. Lab. Invest., 1972; 29 (Suppl. 24) : 71.4. Killingsworth, L.M. et al. ‘Protein Analysis, Deciphering Cerebrospinal Fluid Patterns’ Diag. Med.,1980; March/April : 1-7.5. Killingsworth, L.M. et al. ‘Protein Analysis, Finding Clues to Disease in Urine’ Diag. Med., 1980;May/June : 69-75.16

HL_2_1290P_2004_09_6.qxp 07/10/2004 13:58 Page 17SAS-1 PLUS HIGH RESOLUTION6. Killingsworth, L.M. ‘Clinical Applications of Protein Determinations in Biological Fluids Other ThanBlood’ Clin. Chem., 1982; 28(5) : 1093-1102.7. Ritzmann, S.E and Daniels, J.C. ‘Diagnostic Proteinology: Separation and Characterization ofProteins. Qualitative and Quantitative Assays’ in Laboratory Medicine, Harper & Row, Inc.,Hagerstown, 1979.8. Killingsworth, L.M. et al. ‘Protein Analysis’ Diag. Med., 1980; Jan/Feb : 3-15.9. Killingsworth, L.M. ‘Plasma Protein Patterns in Health and Disease’ CRC Critical Reviews inClinical Laboratory Sciences, August 1979.10. Peterson, P.A., Ervin, P.E. and Beggard, I. ‘Differentiation of Glomerular, Tubular and NormalProteinuria: determination of Urinary Excretion of α2-microglobulin, Albumin and Total Protein’J. Clin. Invest., 1969; 48 : 1189-1198.17Deutsch

HL_2_1290P_2004_09_6.qxp 07/10/2004 13:58 Page 18PRINCIPIOIl kit ad alta risoluzione SAS-1 Plus è formulato per la separazione delle proteine seriche o plasmatichemediante elettroforesi su gel di agarosio.Il siero contiene oltre 100 singole proteine, ciascuna con specifiche funzioni, le quali variano la loroconcentrazione a seconda delle differenti condizioni patologiche in corso 1 .Dall’invenzione dell’elettroforesi a fronte mobile ad opera di Tiselius 2 , e il successivo utilizzodell’elettroforesi di zona, le proteine del siero sono state frazionate in base alla loro carica ad unparticolare pH.Il kit ad alta risoluzione separa le proteine seriche oltre il pattern classico a 5 bande in 10-15 frazionidistinte, incrementando pertanto l’utilità diagnostica dei pattern proteici 3-5 . Sono state ampiamentestudiate circa 15 proteine seriche, in quanto possono essere misurate facilmente 6-9 .Il kit ad alta risoluzione SAS-1 Plus separa le proteine seriche / plasmatiche secondo la loro caricaelettrica in un gel di agarosio tamponato. Le bande proteiche vengono quindi fissate e colorate perconsentirne la visualizzazione e l’interpretazione qualitativa.AVVERTENZE E PRECAUZIONITutti i reagenti devono essere utilizzati esclusivamente per diagnosi in vitro. Non ingerire né pipettarecon la bocca i componenti del kit. Indossare guanti protettivi durante l’uso dei componenti del kit.Riferirsi alle schede tecniche e dati di sicurezza per le avvertenze sui componenti dei Kit.COMPOSIZIONE1. Gel ad alta risoluzione SAS-1 PlusContiene agarosio in tampone barbital con tiomersal e sodio azide come conservanti. Il gel èpronto all’uso.2. Colorante concentrato ad alta risoluzioneContiene colorante concentrato ad alta risoluzione. Diluire l’intero contenuto del flacone a 700mlcon soluzione decolorante e miscelare bene. Conservare in una bottiglia tappata ermeticamente.3. Altri componenti del kitCiascun kit contiene un foglio di istruzioni ed un numero sufficiente di strisce assorbenti C per 10gel.CONSERVAZIONE ESTABILITA’1. Gel ad alta risoluzione SAS-1 PlusI gel devono essere conservati a 15...30°C e sono stabili fino alla data di scadenza riportata sullaconfezione. NON REFRIGERARE NÉ CONGELARE. Il deterioramento del gel può essereindicato da 1) formazioni cristalline per effetto di congelamento, 2) screpolature e fessurazione pereffetto di essiccamento oppure, 3) contaminazione visibile dell’agarosio causata da batteri o funghi.2. Colorante ad alta risoluzioneIl colorante concentrato deve essere conservato a 15...30°C, è stabile fino a data di scadenzariportata sull’etichetta. La soluzione decolorante diluita è stabile per 6 mesi a 15...30°C. Risultatiinsoddisfacenti della colorazione possono indicare un deterioramento della soluzione colorante.18

HL_2_1290P_2004_09_6.qxp 07/10/2004 13:58 Page 19MATERIALI NECESSARI, MA NON IN DOTAZIONECod. N. 210200 Lamelle di applicazione dei campioni (1 x 10)Cod. N. 210300 Lamelle di applicazione dei campioni (5 x 10)Cod. N. 210100 Coppette per campioni monouso (100)Cod. N. 5141 Marker proteico ad alta risoluzioneCod. N. 3100 Preparazione REPSoluzione decolorante: Mescolare 500ml di metanolo e 500ml di acqua distillata. Aggiungere 100ml diacido acetico glaciale. Conservare in una bottiglia tappata ermeticamente.Acqua distillataForno di essiccazione ad aria forzata con temperature di 60...70°C.RACCOLTA DEI CAMPIONI E PREPARAZIONEIl campione ideale è costituito da plasma o siero fresco. I campioni possono essere conservati copertiper un massimo di 48 ore a 2...6°C. L’utilizzo del plasma può portare alla comparsa del fibrinogeno trala frazione beta e la frazione gamma. L’utilizzo di campioni vecchi fa sì che la banda C3 migri nellaregione della transferrina.Si possono utilizzare campioni di urine e CSF previa opportuna concentrazione:Proteina totale (g/L)Fattore di concentrazione

HL_2_1290P_2004_09_6.qxp 07/10/2004 13:58 Page 203. Asciugare la superficie del gel con un blotter C, quindi gettarlo.4. i) Per gli utilizzatori di SAS-1 Plus: fissare gli elettrodi sul lato superiore dei puntali, in modotale che entrino a contatto con i blocchi tampone. NON UTILIZZI IL COPERCHIO.ii) Per gli utilizzatori di SAS-3: fissare gli elettrodi sul lato superiore dei puntali, in modo taleche entrino a contatto con i blocchi tampone.5. Collocare un gruppo di lamelle di applicazione nella parte superiore dello strumento (per gliutilizzatori di SAS-3: slot 8).6. Eseguire l’elettroforesi con ad alta risoluzione:i) Per gli utilizzatori di SAS-1:Elettroforesi: 250 Volt per 12 minuti, 18°C, 1 applicazioneii) Per gli utilizzatori di SAS-3:Fase Tempo (mm:ss) Temperatura (°C) Tensione AltroElettroforesiCaricare campione 00:10 21 Velocità 1Applicare campione 00:10 21 Velocità 1*Elettroforesi 12:00 18 250* Utilizzare l’impostazione 17. Al termine dell’elettroforesi, rimuovere gli elettrodi ed entrambi i blocchi di gel utilizzando il GelBlock Remover.Colorazione del gel:a) SAS-2 (Auto-Stainer)Fase Soluzione Tempo (mm:ss) Presa Temperatura (°C)Colorare Colorante ad alta risoluzione 15:00 5Decolorare Soluzione decolorante 00:30 3Asciugare — 10:00 65Decolorare Soluzione decolorante 01:00 3Decolorare Soluzione decolorante 01:00 3Lavare Acqua distillata 01:00 1Asciugare —- 05:00 65b) ManualeSeguire la sequenza indicata per il SAS-2 Auto-Stainer, utilizzando un bagno colorante per le fasi dicolorazione, decolorazione e lavaggio, nonché un forno di essiccazione per le fasi di essiccazione.20

HL_2_1290P_2004_09_6.qxp 07/10/2004 13:58 Page 21SAS-1 PLUS AD ALTA RISOLUZIONE-12Procedure di colorazione alternativeSono disponibili due protocolli di colorazione alternativi a seconda della colorazione richiestadall’utilizzatore.1. Colorante Amido nero sostitutivo (Cod. N. 3048) per il colorante ad alta risoluzione. SOLO PERCAMPIONI SERICI O PLASMATICI. Seguire il protocollo di colorazione precedentementeillustrato. Il colorante Amido nero è meno sensibile del colorante di Coomassie, ma fornisce unaqualità di colorazione più uniforme, consentendo una migliore valutazione qualitativa delledifferenze in termini di intensità delle bande.2. Tecnica a doppia colorazione. SOLO PER CAMPIONI DI CSF E URINE. In seguito adelettroforesi, eseguire la colorazione con colorante Amido nero sul gel ottenuto e quindi applicarela tecnica di colorazione con colorante di Coomassie sul gel ottenuto. La tecnica a doppiacolorazione può consentire una più chiara visualizzazione delle bande proteiche nelle urine e dellebande oligoclonali nel CSF.NOTA: Non colorare il gel nel SAS-4, in quanto il colorante e la soluzione decolorante contengonometanolo.INTERPRETAZIONE DEI RISULTATISi consiglia ad ogni singolo laboratorio di valutare il gel rispetto ai pattern normali creati per questometodo.Ispezionare il gel visivamente per accertare la presenza o assenza di bande proteiche di particolareinteresse.La figura 1 illustra i pattern di migrazione delle principali proteine plasmatiche, che possono essereidentificate utilizzando la procedura ad alta risoluzione SAS-1 Plus.Fig. 1.Prealbuminaα 1-Glicoproteina acidaα-Lipoproteinaα 1-AntichimotripsinaAptoglobinaC3IgAIgGAlbuminaα 1-Antitripsinaα 1-MacroglobulinaTransferrinaβ-LipoproteinaFibrinogeno(solo nel plasma)IgMI pattern di elettroforesi proteica ad alta risoluzione vengono interpretati principalmente confrontandole intensità relative delle bande ottenute su campioni sconosciuti con quelle ottenute da individuinormali. Uno dei pattern proteici del siero anomali più diffusi è quello osservato nella rispostainfiammatoria aspecifica, caratterizzata da un aumento dell’α1-antitripsina e dell’aptoglobina e da unariduzione di prealbumina, albumina e transferrina. Se non è di alcuna utilità nel definire una diagnosigenerale, è però utile nel monitorare la risposta di un paziente alla terapia.21Italiano

HL_2_1290P_2004_09_6.qxp 07/10/2004 13:58 Page 22Altri esempi di variazioni clinicamente importanti sono:1. Innalzamento della banda di transferrina, ad indicare bassi livelli di ferro.2. Presenza di proteine monoclonali, ad indicare anomalie nel sistema immunitario.3. Bassi livelli di aptoglobina, ad indicare un elevato ricambio di eritrociti o emolisi in vitro.4. Presenza di CRP, ad indicare una risposta infiammatoria acuta.5. Bassi livelli di prealbumina, albumina e transferrina con ipergammaglobulinemia diffusa, ad indicareinfiammazione cronica, infezione o stimolazione antigenica.6. Basso livello di C3 in campioni freschi, ad indicare un consumo di complemento.L’elettroforesi proteica ad alta risoluzione è un ottimo strumento analitico per ottenere una vastapanoramica delle proteine presenti nelle urine 3,10 . Le urine normali contengono solitamente tracce dialbumina e talvolta una debole banda di transferrina. La proteinuria di tipo glomerulare consistegeneralmente in bande fortemente evidenti di albumina, presenza in un’ampia zona a1 sia diα1-glicoproteina acida che di α1-antitripsina, e di transferrina nella regione β1. Il pattern del sieromostra una diminuzione di queste proteine, con un aumento delle proteine trattenute dal glomerulo.Il pattern dell’urina nella proteinuria tubulare consiste invece in una debole banda di albumina, in unadoppia banda nella regione α2 dovuta alla α2-microglobulina, in una forte banda nella regione betamediana dovuta alla β2-microglobulina ed a volte in una diffusa colorazione di fondo nella regionegamma dovuta a catene leggere libere. La malattia renale cronica, o insufficienza renale, può portaread un pattern di tipo misto, causato da danni sia ai tubuli che al glomerulo.Un aumento o diminuzione di particolari componenti del siero, oppure la presenza di componenti delsiero insolite, richiede un’ulteriore indagine. Il gel ad alta risoluzione SAS-1 Plus completato è stabileper un tempo indefinito.CARATTERISTICHE PRESTAZIONALISensibilitàIl metodo è sensibile fino a 60mg/L per banda, determinato come la minima concentrazione diproteine, le quali sono visibili sotto forma di banda distinta presente sul gel completato.LinearitàLa linearità del metodo è una funzione della specificazione densitometrica nonché delle prestazioni delgel. Si raccomanda di determinare la linearità del metodo sulla base del densitometro in uso nellaboratorio.BIBLIOGRAFIA1. Alper, C.A. ‘Plasma Protein Measurements as a Diagnostic Aid’, N. Eng. J. Med., 1974; 291 : 287-290.2. Tiselius, A. ‘A New Approach for Electrophoretic Analysis of Colloidal Mixtures’, Trans. FaradaySoc., 1937; 33 : 524.3. Laurell, C.B. ‘Composition and Variation of the Gel Electrophoretic Fractions of Plasma,Cerebrospinal Fluid and Urine’ Scand. J. Clin. Lab. Invest., 1972; 29 (Suppl. 24) : 71.4. Killingsworth, L.M. et al. ‘Protein Analysis, Deciphering Cerebrospinal Fluid Patterns’ Diag. Med.,1980; March/April : 1-7.5. Killingsworth, L.M. et al. ‘Protein Analysis, Finding Clues to Disease in Urine’ Diag. Med., 1980;May/June : 69-75.22

HL_2_1290P_2004_09_6.qxp 07/10/2004 13:58 Page 23SAS-1 PLUS AD ALTA RISOLUZIONE-126. Killingsworth, L.M. ‘Clinical Applications of Protein Determinations in Biological Fluids Other ThanBlood’ Clin. Chem., 1982; 28(5) : 1093-1102.7. Ritzmann, S.E. and Daniels, J.C. ‘Diagnostic Proteinology: Separation and Characterization ofProteins. Qualitative and Quantitative Assays’ in Laboratory Medicine, Harper & Row, Inc.,Hagerstown, 1979.8. Killingsworth, L.M. et al. ‘Protein Analysis’ Diag. Med., 1980; Jan/Feb : 3-15.9. Killingsworth, L.M. ‘Plasma Protein Patterns in Health and Disease’ CRC Critical Reviews inClinical Laboratory Sciences, August 1979.10. Peterson, P.A., Ervin, P.E. and Beggard, I. ‘Differentiation of Glomerular, Tubular and NormalProteinuria: determination of Urinary Excretion of a2-microglobulin, Albumin and Total Protein’ J.Clin. Invest., 1969; 48 : 1189-1198.23Italiano

HL_2_1290P_2004_09_6.qxp 07/10/2004 13:58 Page 24USO PREVISTOEl objetivo del kit de alta resolución SAS-1 Plus es la separación de las proteínas del suero o plasma pormedio de la electroforesis con gel de agarosa.El suero contiene más de 100 proteínas individuales, cada una de ellas con una serie de funcionesespecíficas que están sujetas a variaciones en su concentración bajo diferentes condiciones patológicas 1 .Desde que Tiselius 2introdujera la electroforesis de límites móviles, y el uso posterior de laelectroforesis por zonas, se han fraccionado las proteínas séricas de acuerdo con su carga a un pHdeterminado.El kit de alta resolución separa las seroproteínas más allá del modelo clásico de 5 bandas en 10-15fracciones discretas, incrementando así la utilidad del diagnóstico de los modelos proteicos 3-5 . Unas 15seroproteínas han sido estudiadas ampliamente, dado que pueden medirse fàcilmente 6-9 .El kit de alta resolución SAS-1 Plus separa las proteínas del suero/plasma según su carga en un gel deagarosa tamponado. Luego, se fijan y colorean las bandas de proteínas para su visualización einterpretación cualitativa.ADVERTENCIAS Y PRECAUCIONESTodos los reactivos son exclusivamente para uso diagnóstico in-vitro. No ingerir ni chupar con la bocaningún componente del kit. Usar guantes para manejar todos los componentes del kit. Consultar lahoja con los datos de seguridad del producto acerca de los riesgos de los componentes, avisos deseguridad y consejos para su eliminación.COMPOSICIÓN1. Gel SAS-1 Plus Alta ResoluciónContiene agarosa en un tampón de barbital con tiomersal y azida de sodio como conservantes.El gel viene envasado listo para usar.2. Concentrado colorante de alta resolución.Contiene colorante de alta resolución concentrado. Diluir el contenido del frasco en 700ml desolución decolorante y mezclar bien. Guardar en un frasco herméticamente cerrado.3. Otros componentes del kitCada kit contiene una hoja de instrucciones y secante C hasta completar 10 geles.ALMACENAMIENTO Y PERÍODO DE VALIDEZ1. Gel SAS-1 Plus Alta ResoluciónLos geles han de almacenarse a 15...30°C y permanecen estables hasta la fecha de caducidadindicada en el envase. NO REFRIGERAR NI CONGELAR. El deterioro del gel puede estarindicado por: 1) apariencia cristalina, indicativo de que el gel ha sido congelado, 2) agrietamiento ydescamación, indicativo del resecamiento del gel, o 3) contaminación visible de la agarosa porfuentes bacterianas o micóticas.2. Colorante de Alta ResoluciónEl colorante concentrado ha de almacenarse a 15...30°C y es estable hasta la fecha de caducidadindicada en el envase. La solución colorante diluida ha de almacenarse a 15...30°C y permaneceestable durante 6 meses. La reducción de la capacidad de coloración puede ser señal de deteriorode la solución colorante.24

HL_2_1290P_2004_09_6.qxp 07/10/2004 13:58 Page 25ARTÍCULOS NECESARIOS NO SUMINISTRADOSNº de catálogo 210200 Aplicadores de muestras 1 x 10Nº de catálogo 210300 Aplicadores de muestras 5 x 10Nº de catálogo 210100 Vasos de recogida de muestras desechables (100)N° de catálogo 5141 Marcador de Proteínas de Alta ResoluciónN° de catálogo 3100 REP PrepSolución decolorante: Mezclar 500ml de metanol y 500ml de agua destilada. Añadir 100ml de ácidoacético cristalizado. Guardar en un frasco herméticamente cerrado.Agua destiladaHorno con aire a presión capaz de alcanzar 60...70°C.RECOGIDA Y PREPARACIÓN DE MUESTRASSe ha de elegir como muestra suero o plasma recién recogidos. Las muestras pueden almacenarsetapadas durante un máximo de 48 horas a 2...6°C. El uso de plasma dará como resultado una bandade fibrinógeno entre las fracciones beta y gamma. El uso de muestras deterioradas provocará que labanda C3 migre en la región de la transferrina.Se pueden utilizar muestras de orina y LCR tras una fase de concentración adecuada:Proteína total (g/l)Factor de concentración< 0,5 100 x0.5 -1.0 50 x1.0 -3.0 25 x3.0 -6.0 10 x6.0 -10.0 5 xSAS-1 PLUS ALTA RESOLUCIÓN-12Tras la concentración, las muestras de orina y LCR se aplicarán directamente al gel.PROCEDIMIENTO PASO A PASO1. Con una pipeta, introducir 35µl de la muestra en la cavidad correspondiente de la bandeja demuestras o en vasos de recogida de muestras desechables.i) Usuarios de SAS-1 Plus: Utilizar la bandeja de muestras de SAS-1. Colocar cuidadosamente labandeja con la muestra en la gaveta del aplicador. Asegurarse de que la bandeja está firmementeintroducida en su posición.ii) Usuarios de SAS-3: Utilizar la base para muestras de SPIFE / SAS-3. Colocar cuidadosamente labandeja con la muestra utilizando los pasadores de localización de la base de la muestra.Asegurarse de que la bandeja está en una posición segura.2. Sacar el gel del envase y:i) Usuarios de SAS-1 Plus: pipetear 400µL de REP Prep en el disipador térmico. Colocar el gelen el disipador térmico, con el lado de agarosa hacia arriba, alineando los lados positivo y negativocon los bordes, teniendo cuidado de evitar las burbujas aéreas debajo del gel.ii) Usuarios de SAS-3: colocar la guía de alineación en los pasadores y pipetear 400µL de REP Prepen el centro de la cámara. Colocar el gel en la cámara con la agarosa hacia arriba, utilizar la guíapara alinear los lados positivo y negativo con los bordes, teniendo cuidado de evitar las burbujasaéreas debajo del gel3. Secar la superficie del gel con un secante C y luego desechar el secante.25Español

HL_2_1290P_2004_09_6.qxp 07/10/2004 13:58 Page 264. i) Usuarios de SAS-1 Plus: conectar los electrodos a los bordes, de forma que estén en contactocon los bloques tampón. NO UTILICE LA CUBIERTA.ii) Usuarios de SAS-3: conectar los electrodos a los bordes, de forma que estén en contacto conlos bloques tampón.5. Colocar 1 unidad del aplicador en la posición del instrumento (usuarios de SAS-3: ranura 8).6. Realizar la electroforesis alta resolución:i) Usuarios de SAS-1 Plus:Electroforesis: 250 Voltios, 12 mins, 18°C, 1 aplicacionii) Usuarios de SAS-3:Paso Hora (mm:ss) Temperatura (ºC) Tensión OtrosElectroforesisCargar muestra 00:10 21 Velocidad 1Aplicar muestra 00:10 21 Velocidad 1*Electroforesis 12:00 18 250* Utilizar posición 17. Finalizada la electroforesis, retirar los electrodos y ambos bloques de gel utilizando el extractor debloques de gel.Cómo colorear el gela) SAS-2 (Colorante automático):Paso Solución Hora (mm:ss) Puerto Temperatura (°C)Colorear Colorante de alta res. 15:00 5Decolorar Solución decoloradora 00:30 3Secar —- 10:00 65Decolorar Solución decoloradora 01:00 3Decolorar Solución decoloradora 01:00 3Lavar Agua destilada 01:00 1Secar —- 05:00 65b) ManualSeguir la secuencia mencionada para el Colorante Automático SAS-2, utilizando un baño decoloración para los pasos de colorear, decolorar y lavar, y un horno de secado para los pasos desecado.26

HL_2_1290P_2004_09_6.qxp 07/10/2004 13:58 Page 27SAS-1 PLUS ALTA RESOLUCIÓN-12Procedimientos de coloración alternativosExisten dos protocolos de coloración alternativos, dependiendo de los requisitos de tinción deseadospor el usuario.1. Sustituir el colorante negro amido (Nº de catálogo 3048) por colorante de alta resolución.ÚNICAMENTE PARA MUESTRAS DE SUERO/PLASMA. Seguir el protocolo de coloraciónindicado arriba. El colorante amido black (negro amido) es menos sensible que el colorantecoomassie, pero proporciona una calidad de tinción más uniforme, permitiendo una mejorevaluación cualitativa de las diferencias en la intensidad de las bandas.2. Técnica de doble tinción ÚNICAMENTE PARA MUESTRAS DE LCR Y ORINA. Finalizada laelectroforesis, efectuar la coloración con negro amido sobre el gel completado y luego realizar latécnica de coloración coomassie sobre el gel completado. La técnica de doble coloración puedepermitir una visualización más clara de las bandas de proteínas en la orina y de las bandasoligoclonales en el LCR.NOTA: No colorear el gel en SAS-4, ya que las soluciones colorante y decolorante contienen metanol.INTERPRETACIÓN DE RESULTADOSSe recomienda realizar cualquier evaluación del gel con respecto a patrones normales obtenidos paraeste método en cada laboratorio individual.Inspeccionar visualmente el gel para detectar la presencia o ausencia de bandas de proteínasespecíficas.La figura 1 muestra los modelos de migración de las principales proteínas del plasma que puedenidentificarse utilizando el procedimiento de alta resolución SAS-1.Pre-albúminaGlicoproteína ácida α1Lipoproteína αα 1-antiquimiotripsinaAlbúminaα 1-Antitripsinaα 1-MacroglobulinaTransferrinaHaptoglobinaLipoproteína βC3Fibrinógeno(Sólo en el plasma)IgAFig. 1.IgMIgGLos patrones de la electroforesis de proteínas de alta resolución se interpretan en primer lugarcomparando las intensidades relativas de las bandas obtenidas de muestras desconocidas con aquellasobtenidas de individuos normales. Uno de los patrones de proteínas anormales de suero másfrecuente es el que se observa en la respuesta inflamatoria inespecífica, caracterizada por un aumentoen la α1- antitripsina y la haptoglobina con disminución de la prealbúmina, la albúmina y la transferrina.Aunque no es útil para establecer un diagnóstico general, es útil para supervisar la respuesta de unpaciente al tratamiento.27Español

HL_2_1290P_2004_09_6.qxp 07/10/2004 13:58 Page 28Otros ejemplos de variaciones clínicamente importantes:1. Elevación de la banda de transferrina, que sugiere niveles bajos de hierro.2. Presencia de proteínas monoclonales, que sugieren anormalidades en el sistema inmunitario.3. Baja haptoglobina, que sugiere un recambio elevado de los hematíes, o hemólisis in-vitro.4. Presencia de PCR, que indica una respuesta inflamatoria aguda.5. Baja prealbúmina, albúmina y transferrina con hipergammaglobulinemia difusa, que sugiereinflamación crónica, infección o estimulación antigénica.6. Bajo C3 en muestras recientes, que sugiere consumo de complemento.La electroforesis de proteínas Hidh Resolution es una excelente herramienta analítica para obtener unaamplia visión general de las proteínas de la orina 3,10 . La orina normal suele contener una pequeñacantidad de albúmina, y a veces una débil banda de transferrina. La proteinuria de tipo glomerular estáformada normalmente por fuertes bandas de albúmina, de α1-glicoproteína ácida y α1-antitripsina enuna amplia zona α1 y transfiriendo en la región α1. El modelo del suero muestra descensos en estasproteínas, con aumentos en las proteínas retenidas por los glomérulos. El modelo de orina enproteinuria tubular suele consistir en una débil banda de albúmina, una doble banda en la regiónα2 debida a la α2-microglobulina, una banda fuerte en la región semi-beta debida a laβ2-microglobulina y a veces una coloración de fondo difuso en la región gamma debida a cadenasligeras sueltas. Las enfermedades renales crónicas o insuficiencia renal pueden dar lugar a un modelode tipo mixto, causado por los daños en los túbulos y los glomérulos.Un aumento o descenso en los componentes de una muestra en concreto o la detección decomponentes inusuales en las muestras requerirá una investigación posterior. El gel de alta resoluciónSAS-1 Plus completado permanece estable durante un período de tiempo indefinido.CARACTERÍSTICAS FUNCIONALESSensibilidadEl método es sensible a 60mg/L por banda, determinado como la concentración más baja de proteínasque se consigue apreciar en forma de banda discreta en el gel completado.LinealidadLa linealidad del método está en función de la especificación del densitómetro así como de lascaracterísticas del gel. Es aconsejable que cada cliente determine la linealidad del método basándoseen el densitómetro utilizado en el laboratorio.BIBLIOGRAFÍA1. Alper, C.A. ‘Plasma Protein Measurements as a Diagnostic Aid’, N. Eng. J. Med., 1974; 291 :287-290.2. Tiselius, A. ‘A New Approach for Electrophoretic Analysis of Colloidal Mixtures’, Trans. FaradaySoc., 1937; 33 : 524.3. Laurell, C.B. ‘Composition and Variation of the Gel Electrophoretic Fractions of Plasma,Cerebrospinal Fluid and Urine’ Scand. J. Clin. Lab: Invest., 1972; 29 (Suppl. 24) : 71.4. Killingsworth, L.M. et al. ‘Protein Analysis, Deciphering Cerebrospinal Fluid Patterns’ Diag. Med.,1980; Marzo/Abril : 1-7.5. Killingsworth, L.M. et al. ‘Protein Analysis, Finding Clues to Disease in Urine’ Diag. Med., 1980;Mayo/Junio: 69-75.28

HL_2_1290P_2004_09_6.qxp 07/10/2004 13:58 Page 29SAS-1 PLUS ALTA RESOLUCIÓN-126. Killingsworth, L.M. ‘Clinical Applications of Protein Determinations in Biological Fluids Other ThanBlood’ Clin. Chem., 1982; 28(5): 1093-1102.7. Ritzmann, S.E y Daniels, J.C. ‘Diagnostic Proteinology: Separation and Characterization ofProteins. Qualitative and Quantitative Assays’ en Laboratory Medicine, Harper & Row, Inc.,Hagerstown, 1979.8. Killingsworth, L.M. et al. ‘Protein Analysis’ Diag. Med., 1980; Ene/Feb: 3-15.9. Killingsworth, L.M. ‘Plasma Protein Patterns in Health and Disease’ CRC Critical Reviews inClinical Laboratory Sciences, agosto 1979.10. Peterson, P.A., Ervin, P.E. y Beggard, I. ‘Differentiation of Glomerular, Tubular and NormalProteinuria: determination of Urinary Excretion of α2-microglobulin, Albumin and Total Protein’J. Clin. Invest., 1969; 48 : 1189-1198.29Español

HL_2_1290P_2004_09_6.qxp 07/10/2004 13:58 Page 1helenawww.helena-biosciences.comBioSciencesEuropeHelena BioSciences EuropeColima AvenueSunderland Enterprise ParkSunderlandSR5 3XBtel: +44 (0) 191 549 6064fax: +44 (0) 191 549 6271email: info@helena-biosciences.comOther Helena BioSciences Europe offices:Helena BioSciences Europe6 Rue Charles Cros-ZAE95320 Saint Leu La ForetFrancetel: +33 13 995 9292fax: +33 13 995 6891email: helena@helena.frHelena BioSciences EuropeVia Enrico Fermi, 2420090 Assago (Milano)Italytel: +39 02 488 1951or +39 02 488 2141fax: +39 02 488 2677HL-2-1290P 2004/09 (6)