Vol. 2 Núm. 8 - Instituto Nacional de Investigaciones Forestales ...

Rev. Mex. Cien. For. Vol. 2 Núm. 8Identificación morfológicaA partir de 10 cultivos puros (monoconidiales o monoascopóricos)en EMA (2%) a 25 ± 2 °C e incubados durante 40 días seidentificaron los hongos a nivel de género con las clavestaxonómicas de Barnett y Hunter (1972) y Hanlin (2001), y paralas especies se emplearon las de Upadhyay (1981) y Jacobs yWingfield (2001). Además, se observó la forma de crecimiento,color de la colonia, tipo de micelio, formación de estructurasreproductivas, tipo y forma de conidios o ascosporas, enlas que se midieron en micras 200 ascosporas y conidios y 30peritecios o sinemas. El seguimiento al desarrollo de conidios ytipo de ascosporas se hizo con microscopía de barrido; paraello se tomaron discos con crecimiento fungal de 5 mm dediámetro. Las muestras se fijaron en glutaraldehído al 3% conamortiguador de fosfatos Sorensen 0.1M, pH 7.2, durante24 h. Posteriormente, se lavaron tres veces con el amortiguadorde fosfatos Sorensen por un minuto y se deshidrataron en unaserie de soluciones de etanol (30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 y100%, las últimas tres soluciones se usaron dos veces) por 15 min.en cada cambio. Los discos se colocaron en una secadorade punto crítico de CO 2Samdri-780A ® (TOUSIMIS ResearchCorporation, Rockville, EUA) a 31.1 °C y 1073 psi; enseguida,los discos se pegaron en un portamuestras de latón de 9 mmde diámetro con cinta adhesiva-conductiva de cobre y serecubrieron con oro durante 4 min en una ionizadoraJFC-1100 ® (JEOL LTD, Tokio, Japón). Las muestras se revisaronen un microscopio electrónico de barrido JSM-35C ® (JEOLLTD, Tokio, Japón) operado a 15 Kv en el laboratorio deMicroscopia Electrónica del Colegio de Postgraduados.Caracterización molecularLos 10 aislamientos de hongos puros utilizados para extraer elADN se cultivaron en matraces con 50 mL de medio líquidode extracto de malta (EM: 20 g de extracto de malta,1,000 mL de agua destilada estéril), a una temperaturade 25 °C y oscuridad por 25 días. La extracción del ADN sehizo de acuerdo al método AP (Sambrook y Russell, 2001).Su calidad se evaluó por electroforesis en gel de agarosa al1%. La amplificación de las regiones internas ITS1 e ITS2 delos genes ribosomales (rADN), localizados entre la subunidadpequeña 18S.5.8S y la subunidad larga 5.8S-28S se realizómediante la técnica de PCR con los iniciadores universalesITS1-F (5´-CTTGGTCATTTAGAGGGAAGTAA-3´) e ITS4(5´-TCC TCCGCTTATTGATATGC-3´).La mezcla de reacción de PCR estuvo compuesta de: 12.5 µLagua libre de nucleasas, 2.5 µL solución amortiguadora Buffer1X, 2.5 µL de MgCl 2a 2.5 mM, 0.5 µL de dNTPs a 10 mM,0.5 µL de cada oligonucleótido, 2 U de Taq-DNA polimerasa(Invitrogen) y 2 µL de DNA (10 ng), con un volumen final de 25 µL.Se utilizó un termociclador Applied Biosystems MR (Mod. TermalCycler 2720) con el siguiente programa: desnaturalizaciónMorpholgic identificationFrom the 10 pure cultures (monoconidial or monoascoporic) in2% MAE at 25 ± 2 °C and incubated for 40 days, at a genuslevel, fungi were determined by following the taxonomic keys ofBarnett and Hunter (1972) and Hanlin (2001), and for speciesthose of Upadhyay (1981) and Jacobs and Wingfield (2001).Also, the way they grew, the color of the colony, the typeof mycelium, reproductive structure formation, type and form ofconidia and ascospores were observed, in which 200 ascosporesand conidia and 30 peritecia or synnemas were measured inmicrons. The follow-up of the development of conidia andtype of ascospores was made by electron microscopy; for thatending, fungal growth discs of 5 mm in diameter were taken.Samples were fixed in 3% glutaraldehyde with 0.1M Sorensenphoshate buffer, pH 7.2 or 24 h. Afterwards, they were rinsedthrice with the Sorensen fosfate buffer for one minute and weredehydrated with a series of ethanol solutions (30, 40, 50,60, 70, 80, 90 and 100%; the three last were used twice) for15 min in every change.. The discs were placed into aSamdri-780A ® (TOUSIMIS Research Corporation, Rockville, USA)kiln at the critical point of CO 2at 31.1 °C and 1073 psi; rightaway, the discs were fixed on a 9 mm diameter brass samplerwith a copper conductive-adhesive tape and were covered withgold during 4 min in a JFC-1100 ® (JEOL LTD, Tokio, Japanioniziner). Samples were reviewed with a JSM-35C ®(JEOL LTD, Tokio, Japan) electron microscope operated at15 Kv in the Electronic Microscopy laboratory of the GraduateStudies College.Molecular DescriptionThe ten pure fungi isolations used to extract DNA were cultivatedin 50 mL flacks of liquid medium of malt extract (ME: 20 gof malt extract + 1,000 mL of sterile distilled water) at25 o C in darkness for 25 days. DNA extraction was madeaccording to the AP method (Sambrook and Russell, 2001).Its quality was assessed by electrophoresis in agrose gel at1%. The amplification of the ITS1 and ITS2 internal regions of therhibozomal (rDNA) genes, located between the 18S.5.8S smallsubunit and the 5.8S-28S long subunit was made by the PCRtechnique with ITS1-F (5´-CTTGGTCATTTAGAGGGAAGTAA-3´)and ITS4 (5´-TCC TCCGCTTATTGATATGC-3´) universal initiators.The reaction mixture of PCR was made up by 12.5 µL waterfree of nucleases, 2.5 µL Buffer solution of 1X, 2.5 µL deMgCl 2at 2.5 mM, 0.5 µL of dNTPs at 10 mM, 0.5 µL of eacholigonucleotide, 2 U of Taq-DNA polymerase (Invitrogen) and 2µL of DNA (10 ng), with a final volume of 25 µL. An AppliedBiosystems TM (Thermal Cycler 2720 model) thermal cycler wasused with the following program: initial desnaturalization at95 °C for 3 min; 35 desnaturalization cycles of 94 °C for 59 sec;alignment at 55 °C for 59 sec and extension at 72 °C for1 min and a final extension of 72 °C for 8 min (Zhou et al., 2004).38