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C. MEDINA et al. la metodología descrita por Vesey et al., (1993). A cada muestra de 5 L se le realizó el siguiente tratamiento: se hizo un filtrado grueso a través de un colador de plástico cubierto con una gasa, pasando así la muestras a recipientes de polietileno con capacidad de 6L. Utilizando un cilindro graduado se agregó una de solución de cloruro de calcio (CaCl 2 ) 1 M (10 mL/L de muestra). Se sometió a una agitación con movimiento circular, luego se agregó bicarbonato de sodio (NaHCO 3 ) 1M (10 mL/L de muestra) nuevamente se sometió a una agitación con movimiento circular, posteriormente se midió el pH inicial y luego se fue agregando una solución hidróxido de sodio (NaOH) 3 N hasta que la muestra llegara a un pH de 10, en este punto la muestra así tratada, se dejó tapada en reposo por 4 horas a temperatura ambiente. Al cabo del período se sedimentación, se eliminó cuidadosamente el sobrenadante, mediante la presión de succión ejercida por una bomba portátil (sin perturbar el sedimento), seguidamente se lavó el envase con búffer fosfato salino estéril (PBS) más TWEEN 20 y se recuperó este volumen junto con el resto del sedimento. El sedimento se trató con solución de Acido Sulfámico (H 2 NSO 3 H) al 10% hasta observar la disolución del floculo, la mezcla resultante se llevó a tubos de 50 mL. Concentración de ooquistes de Cryptosporidium spp: La mezcla resultante ya en los tubos de 50 mL, se centrifugaron a 3.314 g por 15 minutos a 4°C de temperatura luego cada tubo se añadió búffer fosfato salino estéril (PBS) más TWEEN 20 para lavar, nuevamente se centrifugó 3.314 G por 15 minutos a 4°C de temperatura, para concentrar 86 Figura 1. Mapa georeferencial de los sitios de muestreo en la planta de tratamiento Taiguaiguay, Maracay Estado Aragua Venezuela. Fuente: Claudio Medina 2011. aun más la muestra. Una vez finalizado este proceso se agregan todos los sedimentos a un único tubo de 50 mL pasando a ser la muestra concentrada. Purificación de ooquistes de Cryptosporidium spp. mediante la técnica de Flotación por sacarosa: Se trabajo seguen la metodología de Vesey et al., (1993), se agregó en un tubo de 50 mL, 15 mL de sacarosa al 2,5 M y 5 mL de la muestra concentrada muy lentamente por las paredes del recipiente, se llevo a centrifugar por 10 minutos a 994 g a 4°C de temperatura. Trascurrido ese tiempo con una pipeta pasteur se tomo del sobrenadante de la capa más superficial y se coloco en un tubo de 50 mL, se completo con (PBS) a 45 mL para realizar el lavado, luego se llevo a centrifugar por 10 minutos a 3.314 G a 4°C y posteriormente se descartó el sobrenadante y el sedimento generado se coloco en un tubo de ensayo representado esta la muestra final purificada. Identificación de ooquistes de Cryptosporidium spp. mediante la técnica de Microscopia de inmunofluorescencia directa (IFD): Se agregó 50 µL de la muestra purificada a la lamina SuperSticK (Waterborne, Inc.) se dejó secar a temperatura ambiente, después que secó se colocó 1 gota de metanol y se dejo secar nuevamente, se agrego 50 µL de buffer por 1 minuto y se escurrió al culminar el tiempo, luego se añadió una 1 gota de Cryt-agloTM y se incubó en cámara húmeda por 25 minutos a 37°C de temperatura, pasado este tiempo se agregó 50 µL de buffer por 1 minuto y se escurrió al culminar este tiempo, posteriormente se colocó 1 gota de BlockOut para dejar incubar por 1 min a temperatura ambiente, para después agregar 50 Rev. Ibero-Latinoam. Parasitol. (2012); 71 (1): 83-89
µL de buffer por 1 minuto y escurrir al culminar el tiempo, por último se colocó una gota del líquido de montaje y se cubrió con una laminilla. Las láminas se mantuvieron refrigerada a 4°C de temperatura y protegida de la luz hasta el momento de su observación. Las láminas se observaron en un microscopio de Epifluorescencia de marca Axios xop 2 plus (Zeiss) con filtro de 430-480 nm, en objetivos de 40x y 100x. Lectura del recuento de ooquistes de Cryptosporidium spp. Una vez hecho el recuento de ooquistes se aplico la fórmula que se describe a continuación para obtener el número total de ooquistes/L (Herrera 2003). Ooq/L = Nº Ooq. contados x Vol. purificado (mL) Vol. estudiado (mL) x Vol. Muestra (L) Ooq/L= representa la forma de reportar la concentración de ooquiste. N° Ooq. Contados = El número de ooquistes contados en las laminas por IFD. Vol. Purificado (mL) = Volumen obtenido de la purificación de la muestra. Vol. Estudiado (mL) = Volumen utilizados para realizar la coloración con IFD. Vol. Muestra (L) = Volumen original de cada muestras antes del tratamiento. RESULTADOS Y DISCUSIóN Con la finalidad de identificar la presencia de Cryptosporidium spp. en la planta de tratamiento Taiguaiguay, se procesaron 14 muestras de aguas residuales, organizadas en dos grupos según el sitio de muestreo, siete en la entrada y siete en la salida de la planta. En la Tabla 1, se presenta el recuento de ooquistes de Cryptosporidium spp en relación a los volúmenes de muestras de aguas residuales procesados. Se detectó la presencia de ooquistes de Cryptosporidium spp tanto en la entrada como la salida de la planta, observándose variaciones en el numero de ooquistes detectados en cada muestra analizada. Estos resultados son comparados con los reportados por Alarcon et al., (2005), donde reportan concentraciones variables de Cryptosporidium spp en las muestras analizadas en la cuenca alta del rio Bogotá, Colombia demostraron la presencia de Cryptosporidium spp en cinco muestreos realiza- Tabla 1. Recuento de ooquistes de Cryptosporidium spp en las muestras de aguas residuales recolectadas en la planta de tratamiento “Taiguaiguay” del Estado Aragua año 2011 Sitio de muestreo Muestras Vol. de la muestra (L) Vol. purificado (mL) Vol. Estudiado (µL) Numero de Ooq. M-1 5 2 50 4 M-2 5 1 100 ND M-3 5 1 100 ND Entrada M-4 5 2 100 ND M-5 5 1 100 1 M-6 5 2 100 2 M-7 5 2 100 2 M-8 5 3 50 ND M-9 5 2 100 ND M-10 5 1,5 100 1 Salida M-11 5 1,5 100 2 M-12 5 1,5 100 ND M-13 5 1 100 ND M-14 5 2 100 1 M: muestra, ND: no detectado, Ooq: Ooquiste, Vol: volumen. Rev. Ibero-Latinoam. Parasitol. (2012); 71 (1): 83-89 CRYPTOSPORIDIUM EN AGUAS RESIDUALES DE ARAGUA, VENEZUELA 87
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