(Eh) y metanólico (Em) de Pera distichophylla sobre un aislado de ...

C. MEDINA et al.
la metodología descrita por Vesey et al., (1993). A
cada muestra de 5 L se le realizó el siguiente tratamiento:
se hizo un filtrado grueso a través de un
colador de plástico cubierto con una gasa, pasando
así la muestras a recipientes de polietileno con capacidad
de 6L. Utilizando un cilindro graduado se
agregó una de solución de cloruro de calcio (CaCl 2 )
1 M (10 mL/L de muestra). Se sometió a una agitación
con movimiento circular, luego se agregó
bicarbonato de sodio (NaHCO 3 ) 1M (10 mL/L de
muestra) nuevamente se sometió a una agitación
con movimiento circular, posteriormente se midió
el pH inicial y luego se fue agregando una solución
hidróxido de sodio (NaOH) 3 N hasta que la muestra
llegara a un pH de 10, en este punto la muestra
así tratada, se dejó tapada en reposo por 4 horas a
temperatura ambiente. Al cabo del período se sedimentación,
se eliminó cuidadosamente el sobrenadante,
mediante la presión de succión ejercida por
una bomba portátil (sin perturbar el sedimento),
seguidamente se lavó el envase con búffer fosfato
salino estéril (PBS) más TWEEN 20 y se recuperó
este volumen junto con el resto del sedimento. El
sedimento se trató con solución de Acido Sulfámico
(H 2 NSO 3 H) al 10% hasta observar la disolución
del floculo, la mezcla resultante se llevó a tubos de
50 mL.
Concentración de ooquistes de Cryptosporidium
spp: La mezcla resultante ya en los tubos de
50 mL, se centrifugaron a 3.314 g por 15 minutos
a 4°C de temperatura luego cada tubo se añadió
búffer fosfato salino estéril (PBS) más TWEEN 20
para lavar, nuevamente se centrifugó 3.314 G por
15 minutos a 4°C de temperatura, para concentrar
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Figura 1. Mapa georeferencial de
los sitios de muestreo en la planta de
tratamiento Taiguaiguay, Maracay Estado
Aragua Venezuela. Fuente: Claudio
Medina 2011.
aun más la muestra. Una vez finalizado este proceso
se agregan todos los sedimentos a un único tubo
de 50 mL pasando a ser la muestra concentrada.
Purificación de ooquistes de Cryptosporidium
spp. mediante la técnica de Flotación por sacarosa:
Se trabajo seguen la metodología de Vesey
et al., (1993), se agregó en un tubo de 50 mL, 15
mL de sacarosa al 2,5 M y 5 mL de la muestra concentrada
muy lentamente por las paredes del recipiente,
se llevo a centrifugar por 10 minutos a 994
g a 4°C de temperatura. Trascurrido ese tiempo con
una pipeta pasteur se tomo del sobrenadante de la
capa más superficial y se coloco en un tubo de 50
mL, se completo con (PBS) a 45 mL para realizar el
lavado, luego se llevo a centrifugar por 10 minutos
a 3.314 G a 4°C y posteriormente se descartó el
sobrenadante y el sedimento generado se coloco
en un tubo de ensayo representado esta la muestra
final purificada.
Identificación de ooquistes de Cryptosporidium
spp. mediante la técnica de Microscopia
de inmunofluorescencia directa (IFD): Se agregó
50 µL de la muestra purificada a la lamina SuperSticK
(Waterborne, Inc.) se dejó secar a temperatura
ambiente, después que secó se colocó 1 gota de
metanol y se dejo secar nuevamente, se agrego 50
µL de buffer por 1 minuto y se escurrió al culminar
el tiempo, luego se añadió una 1 gota de Cryt-agloTM
y se incubó en cámara húmeda por 25 minutos
a 37°C de temperatura, pasado este tiempo se
agregó 50 µL de buffer por 1 minuto y se escurrió
al culminar este tiempo, posteriormente se colocó
1 gota de BlockOut para dejar incubar por 1 min
a temperatura ambiente, para después agregar 50
Rev. Ibero-Latinoam. Parasitol. (2012); 71 (1): 83-89