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C. M. WAGNER et al. Porcentaje (%) de lisis= Nº de amibas (T y Q) iniciales - Nº de amibas (T y Q) finales x 100 Nº de amibas (T y Q) iniciales T: trofozoítos Q: quistes 58 RESULTADOS Y DISCUSIóN El uso de productos naturales y/o sus derivados en el tratamiento de pacientes con queratitis acantamibiana y ulceras corneales ha sido evaluado tanto in vitro (Polat et al., 2007a,b; 2008; My Chu, 1998; Derda et al., 2004) como in vivo (Vural et al., 2007). De estos reportes, se deriva la necesidad de evaluar la susceptibilidad de cada especie de Acanthamoeba a los diferentes extractos de una misma planta, ya que estudios previos con plantas de la familia Apocynaceae muestran que in vitro no poseen la misma actividad contra microorganismos similares. La disponibilidad de algunos extractos de la planta Pera distichophylla y sus antecedentes de actividad antiparasitaria ofrecieron la posibilidad de evaluar sus efectos in vitro sobre un aislado de Acanthamoeba spp, A27, productor de úlcera corneal (Luna, 2003; Rodríguez et al., 2006). La morfología de los trofozoítos y quistes del aislado A27 se observó al microscopio óptico a 400 aumentos, antes de ser expuesto al Ec. En los quistes se apreció una doble pared quística, conformada por un exoquiste, moderadamente ondulado y un endoquiste poliédrico o estrellado. Se destacó un citoplasma granular y vacuolar, pero sin distinguirse el núcleo. Cuando se realizaron las medidas de los mismos, presentaron un diámetro entre 12,5 y 20 µm, con un tamaño promedio de 16 µm (Figura 1). Los trofozoítos mostraron una movilización lenta, a través de la emisión de uno o dos pseudópodos hialinos, con abundantes acantopodios a lo largo de toda la célula. El endoplasma se observó granular, con una o dos vacuolas contráctiles. Las medidas oscilaron entre 17,5 y 37,7 µm, teniendo un valor medio de 27 µm (Figura 2), concordando estas descripciones de trofozoítos y quistes del género Acanthamoeba con las hechas por otros autores (Rondanelli y Scala, 1987). Después de haber sido expuestos al efecto del Ec a concentraciones de 1 y 10 mg/ml, se realizó la observación microscópica y micrometría para los quistes y trofozoítos. Los parámetros morfométri- Figura 1. Quistes de Acanthamoeba spp, aislado A27, antes de la exposición al extracto Ec de Pera distichophylla. Examen directo en medio líquido de Page modificado. 1.000 aumentos. Quiste con 4 puntas, donde se evidencia ecto (a) y endoquiste (b), con poro u ostiolo (c) . cos de los trofozoítos y quistes se resumen en la Tabla 1. La morfología de los quistes no varió a ninguna de las dos concentraciones del Ec evaluadas: ni en el control con el DMSO 3%. El tamaño y las características morfológicas de la pared y del interior de los quistes variaron poco comparados con los quistes control y los expuestos al DMSO, debido probablemente a la naturaleza quitinosa de la pared quística, lo cual le confiere resistencia a la penetración del Ec. Para complementar estas observaciones y al no determinarse cambios morfológicos visibles en los quistes al microscopio óptico, se sugiere realizar estudios ultraestructurales, para detectar si hay modificaciones en alguno de los organelos celulares. Respecto a la morfometría de los trofozoítos, para todos los casos, se observó una disminución en el tamaño, al ser comparados con el control sin exponer al tratamiento con Ec y DMSO. Además, se observó redondeamiento de los mismos, lo cual se mantuvo a lo largo del experimento, para la con- Rev. Ibero-Latinoam. Parasitol. (2012); 71 (1): 55-61
Figura 2. Trofozoíto de Acanthamoeba spp, aislado A27, antes de la exposición al extracto Ec de Pera distichophylla. Examen directo en medio liquido de Page modificado, 1.000 aumentos. Se observa el ectoplasma (a) con escasos acantopodios (b) y endoplasma (c) Vacuola contráctil (d). centración de 1 mg/ml y para el control de DMSO 3%, por lo tanto, se puede considerar que el cambio de forma del trofozoíto no es debido al Ec evaluado a esa concentración, sino al efecto del DMSO 3%. Para la concentración de 10 mg/ml, los trofo- zoítos presentaron señales de degeneración celular como múltiples vacuolas. Además, se observó que a esta concentración pareciera se inhibió la capacidad del aislado A27 para enquistarse, ya que en el grupo control sin extracto, se observaron quistes a las 48 horas, mientras que las amibas expuestas al extracto no presentaron quistes para ese tiempo de estudio (Figura 3). Luego de la exposición del aislado A27 de Acanthamoeba spp a las dos concentraciones del Ec en todos los tiempos de exposición, se obtuvo quistes y trofozoítos 100% viables. Sin embargo, se destaca que para el recuento a la concentración de 10 mg/ml, el número de amibas fue inferior a 100, por lo que se infiere que probablemente hubo lisis de los quistes y trofozoítos, comparados con el control de DMSO 3% y con el recuento para la concentración de Ec 1 mg/ml. La determinación de la capacidad lítica del Ec presentó algunos inconvenientes relacionados con la pigmentación intensa del mismo, lo cual dificultó el recuento de las formas evolutivas, especialmente a la concentración de 10 mg/ml. La capacidad lítica del Ec a la concentración de 1 mg/ml a las 2 horas de exposición, fue de 37,5%, incrementando a medida que aumenta el tiempo de exposición al extracto, ya que a las 24 y 48 horas fue superior a 80% y para las 96 horas de exposición fue de 89,5%, indicando estos resultados que la capacidad lítica del Ec a la menor concentración Tabla 1. Medidas de los quistes y trofozoítos del Aislado A27 de Acanthamoeba spp. después de haber sido enfrentados al extracto crudo alcohólico (Ec) deP. distichophylla Ec 1 mg/ml Ec 10 mg/ml Control DMSO 3% Quistes Trofozoítos Quistes Trofozoítos Quistes Trofozoítos 15,0 30,0 15,0 15,0 15,0 10,0 15,0 25,0 12,5 30,0 20,0 20,0 17,5 15,0 15,0 12,5 20,0 25,0 12,5 17,5 17,5 17,5 15,0 15,0 15,0 15,0 15,0 10,0 12,5 15,0 17,5 30,0 15,0 10,0 17,5 30,0 15,0 25,0 17,5 12,5 15,0 37,5 17,5 10,0 20,0 15,0 17,5 15,0 15,0 15,0 12,5 15,0 15,0 15,0 20,0 15,0 12,5 17,5 20,0 27,5 x= 16 x= 20 x= 15,3 x= 15,5 x= 17 x= 18 Rev. Ibero-Latinoam. Parasitol. (2012); 71 (1): 55-61 ExTRACTO CRUDO DE PERA DISTICHOPHYLLA CONTRA ACANTHAMOEBA CORNEAL 59
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