(Eh) y metanólico (Em) de Pera distichophylla sobre un aislado de ...

extractos (crudo alcohólico, hexanólico y metanólico)
(Luna, 2003). En este trabajo se evaluó el extracto
crudo alcohólico (Ec).
Se prepararon dos soluciones madres del Ec: 3
mg/ml y 30 mg/ml, solubilizadas en dimetilsulfóxido
(DMSO) al 100 % y se completó con agua destilada
estéril hasta un volumen final de 15 ml. El
porcentaje final de DMSO de cada solución fue de
10%. Previamente, se realizaron ensayos de toxicidad
de este compuesto sobre el aislado de Acanthamoeba
spp, empleando concentraciones desde 1%
hasta 12,5%.
Material biológico: El aislado de Acanthamoeba
spp, designado como A27 según nomenclatura
propia del Laboratorio de Amibiasis de la Escuela
de Bioanálisis de la Universidad Central de Venezuela
(UCV), fue obtenido en este laboratorio
a partir de una muestra de raspado de úlcera corneal,
tomada a una paciente de 27 años de edad,
quien presentó una lesión ocular, la cual ameritó la
toma de esta muestra para el diagnóstico etiológico;
como antecedente epidemiológico, la paciente
informó ser usuaria de lentes de contacto blandos
por 9 años. Este aislado ha sido mantenido en el
medio de cultivo bifásico de Page modificado por
Chinchilla et al., (1979) en placas de petri y fue
adaptado al crecimiento en placas de poliestireno
de 24 pozos para realizar los bioensayos.
Bioensayos: El efecto del Ec sobre la morfología
y viabilidad del aislado A27 de Acanthamoeba spp,
así como la capacidad lítica del Ec sobre el mismo,
fueron evaluados al exponer una suspensión de 1 x
10 4 amibas/ml de cultivo (trofozoítos y quistes) a las
concentraciones de 1 mg/ml y 10 mg/ml a las 24,
48, 72 y 96 horas. Estos bioensayos se realizaron en
el medio de cultivo bifásico de Page modificado por
Chinchilla et al., (1979), en placas de poliestireno de
24 pozos Nunc®, y una suspensión de Escherichia
coli (patrón 0,5 Mac Farland) en la fase líquida de
este medio (Pérez de Galindo, 1975; Chinchilla
et al., 1979). Para todos los ensayos, se estableció
un control de amibas con el medio de cultivo y un
control de DMSO al 3%, siendo ésta la concentración
del solvente que se obtuvo al realizar las diluciones
de las soluciones madres en los pozos.
Los bioensayos se realizaron por duplicado,
incubando los trofozoítos y/o quistes con las dos
concentraciones del Ec a 37ºC; al concluir cada
tiempo, se recolectó el contenido de cada pozo,
colocando en tubos de centrífuga graduados y
Rev. Ibero-Latinoam. Parasitol. (2012); 71 (1): 55-61
ExTRACTO CRUDO DE PERA DISTICHOPHYLLA CONTRA ACANTHAMOEBA CORNEAL
estériles y se midió el volumen obtenido. Se tomó
una alícuota para observar la morfología y se
realizó el recuento de las amibas. Posteriormente,
se realizó un lavado con medio de cultivo líquido,
se centrifugó a 150 g y se eliminó el sobrenadante,
para detener el efecto de los extractos y del DMSO.
Estos bioensayos se detallan a continuación:
1.- Evaluación del efecto del Ec sobre la
morfología de Acanthamoeba spp
La morfología del aislado fue estudiada cualitativa
y morfométricamente. Los criterios que definen
el efecto sobre la morfología descrita al microscopio
de luz con 400 aumentos son: modificaciones
en el tamaño y forma de los trofozoítos y quistes,
cambios en el aspecto del citoplasma respecto a
vacuolas digestivas y/o contráctiles, al compararlo
con la morfología característica del aislado antes de
ser expuesto al Ec.
2.- Evaluación del efecto del Ec sobre la
viabilidad de los trofozoítos y quistes de
Acanthamoeba spp
La viabilidad del aislado se evaluó posterior
al contacto con el Ec, utilizando el método de
exclusión de dos colorantes supravitales: Azul de
Tripano 0,4% y Rojo Congo 0,4 % y fue reportada
en porcentaje (%) de células vivas (Jiménez, 2003).
Las observaciones se realizaron en un microscopio
óptico (Olympus), con objetivo de 10x y 40x,
considerando el número de células vivas entre 100
células totales contadas. El % de viabilidad celular
se calculó, según la siguiente fórmula:
% Viabilidad celular = N° células vivas x 100
Total de células
3.- Evaluación de la capacidad lítica del Ec sobre
los trofozoítos y quistes de Acanthamoeba spp
La evaluación de la capacidad lítica del Ec sobre
el aislado se realizó mediante el recuento de
amibas antes y después del contacto de las mismas
con el extracto. Se colocó un inóculo inicial y posteriormente,
al concluir cada tiempo de incubación
de las amibas con las concentraciones del Ec, se
recogió el volumen de cada uno de los pozos por
separado y se colocó una gota de la suspensión en
cámara de Neubauer para realizar el recuento final
de las amibas. El porcentaje de lisis se calculó utilizando
la siguiente fórmula:
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