(Eh) y metanólico (Em) de Pera distichophylla sobre un aislado de ...
(Eh) y metanólico (Em) de Pera distichophylla sobre un aislado de ... (Eh) y metanólico (Em) de Pera distichophylla sobre un aislado de ...
C. M. WAGNER et al. el tratamiento de las mismas tiene limitaciones. En la constante búsqueda de nuevos medicamentos para el tratamiento de estas afecciones, un gran número de agentes terapéuticos y de extractos de plantas han sido analizados in vitro para evaluar su actividad amebicida contra este patógeno. En este sentido, se planteó evaluar in vitro la actividad biológica del extracto crudo alcohólico (Ec), obtenido de Pera distichophylla, una planta del Amazonas, sobre un aislado de Acanthamoeba spp (A27), proveniente de un paciente con úlcera corneal. Se evaluó el efecto del extracto Ec a concentraciones de 1 mg/ml y 10 mg/ml sobre trofozoitos y quistes de Acanthamoeba spp, en placas de poliestireno de 24 pozos. Se observó inhibición en el crecimiento amibiano, a ambas concentraciones evaluadas, siendo mayor el efecto a 10 mg/ml; también se observaron cambios morfológicos en los trofozoitos, como redondeamiento y vacuolización, como signos de degeneración y muerte celular. En los quistes, no se observaron cambios morfológicos visibles al microscopio de luz, ni variaciones en el tamaño, al ser enfrentados a las concentraciones estudiadas. Los resultados sugieren que el extracto pareciera producir lisis en los trofozoítos y actividades amebostática, lítica y amebicida a las concentraciones de 1 y 10 mg/ml. Se sugiere evaluar otras concentraciones para complementar los resultados obtenidos en este trabajo y realizar estudios ultraestructurales para la detección de modificaciones en la célula. Palabras claves: Acanthamoeba spp, Pera distichophylla, úlcera corneal, tratamiento. 56 INTRODUCCIóN Las plantas y sus derivados han representado, desde la antigüedad, una buena opción terapéutica para algunas enfermedades. Venezuela posee en el Amazonas, gran diversidad de especies vegetales algunas con propiedades curativas, y se ubica como uno de los países con mayores fuentes naturales para el desarrollo de la industria farmacéutica en el tratamiento de enfermedades. En los últimos años, las infecciones por Acanthamoeba spp se han incrementado, especialmente las afecciones oculares por Acanthamoeba spp (Díaz et al., 1993; Bermúdez et al., 1997;) y el tratamiento farmacológico utilizado tiene ciertas limitaciones (Dribe et al.,1988; Kilvington et al., 1990). En la búsqueda de nuevas opciones terapéuticas para un tratamiento efectivo contra este protozoario, surge la inquietud de evaluar productos naturales provenientes de plantas, ya que se ha reportado la existencia de actividad amebicida de algunos extractos sobre diferentes especies de Acanthamoeba (My Chu et al., 1998; Vural et al., 2007; Polat et al., 2007a,b; 2008). Con el análisis fitoquímico y biológico de una planta del Amazonas, Pera distichophylla, se demostró que el extracto crudo alcohólico (Ec) de hojas y ramas posee actividad antiparasitaria sobre Trypanosoma cruzi (Luna, 2003). Estos ensayos fueron ampliados por Rodríguez-Ortega y colaboradores, al evaluar la actividad anti- parasitaria para T. cruzi de los extractos acuosos (Ea) y alcohólicos (Ec) de Pera glabrata y de Pera distichophylla, así como su actividad antiviral sobre los virus de dengue y fiebre amarilla, obteniéndose inhibición de la replicación de epimastigotes de T. cruzi por los Ea de ambas plantas y en especial, del Ea de P. glabrata sobre la replicación de las formas amastigotas del parásito. En relación con el virus del dengue y de la fiebre amarilla, los Ec fueron más efectivos que los Ea (Rodríguez et al., 2006). En las infecciones por Acanthamoeba spp, el uso de extractos naturales sería una excelente alternativa ante las limitaciones actuales para el tratamiento de las mismas. Basado en estas investigaciones, se planteó evaluar in vitro la actividad biológica del Ec obtenido de Pera distichophylla, sobre un aislado de Acanthamoeba spp, A27, proveniente de un paciente con úlcera corneal. MATERIAL Y MÉTODO Material vegetal: Pera distichophylla (Euphorbiaceae), fue identificada y recolectada por el Prof. Anibal Castillo (Universidad Central de Venezuela, Instituto de Biología Experimental), cerca del Río Sipapo, Municipio Autana, Estado Amazonas. En el Laboratorio de Productos Naturales de la Escuela de Química de la Facultad de Ciencias de la Universidad Central de Venezuela fueron obtenidos 3 Rev. Ibero-Latinoam. Parasitol. (2012); 71 (1): 55-61
extractos (crudo alcohólico, hexanólico y metanólico) (Luna, 2003). En este trabajo se evaluó el extracto crudo alcohólico (Ec). Se prepararon dos soluciones madres del Ec: 3 mg/ml y 30 mg/ml, solubilizadas en dimetilsulfóxido (DMSO) al 100 % y se completó con agua destilada estéril hasta un volumen final de 15 ml. El porcentaje final de DMSO de cada solución fue de 10%. Previamente, se realizaron ensayos de toxicidad de este compuesto sobre el aislado de Acanthamoeba spp, empleando concentraciones desde 1% hasta 12,5%. Material biológico: El aislado de Acanthamoeba spp, designado como A27 según nomenclatura propia del Laboratorio de Amibiasis de la Escuela de Bioanálisis de la Universidad Central de Venezuela (UCV), fue obtenido en este laboratorio a partir de una muestra de raspado de úlcera corneal, tomada a una paciente de 27 años de edad, quien presentó una lesión ocular, la cual ameritó la toma de esta muestra para el diagnóstico etiológico; como antecedente epidemiológico, la paciente informó ser usuaria de lentes de contacto blandos por 9 años. Este aislado ha sido mantenido en el medio de cultivo bifásico de Page modificado por Chinchilla et al., (1979) en placas de petri y fue adaptado al crecimiento en placas de poliestireno de 24 pozos para realizar los bioensayos. Bioensayos: El efecto del Ec sobre la morfología y viabilidad del aislado A27 de Acanthamoeba spp, así como la capacidad lítica del Ec sobre el mismo, fueron evaluados al exponer una suspensión de 1 x 10 4 amibas/ml de cultivo (trofozoítos y quistes) a las concentraciones de 1 mg/ml y 10 mg/ml a las 24, 48, 72 y 96 horas. Estos bioensayos se realizaron en el medio de cultivo bifásico de Page modificado por Chinchilla et al., (1979), en placas de poliestireno de 24 pozos Nunc®, y una suspensión de Escherichia coli (patrón 0,5 Mac Farland) en la fase líquida de este medio (Pérez de Galindo, 1975; Chinchilla et al., 1979). Para todos los ensayos, se estableció un control de amibas con el medio de cultivo y un control de DMSO al 3%, siendo ésta la concentración del solvente que se obtuvo al realizar las diluciones de las soluciones madres en los pozos. Los bioensayos se realizaron por duplicado, incubando los trofozoítos y/o quistes con las dos concentraciones del Ec a 37ºC; al concluir cada tiempo, se recolectó el contenido de cada pozo, colocando en tubos de centrífuga graduados y Rev. Ibero-Latinoam. Parasitol. (2012); 71 (1): 55-61 ExTRACTO CRUDO DE PERA DISTICHOPHYLLA CONTRA ACANTHAMOEBA CORNEAL estériles y se midió el volumen obtenido. Se tomó una alícuota para observar la morfología y se realizó el recuento de las amibas. Posteriormente, se realizó un lavado con medio de cultivo líquido, se centrifugó a 150 g y se eliminó el sobrenadante, para detener el efecto de los extractos y del DMSO. Estos bioensayos se detallan a continuación: 1.- Evaluación del efecto del Ec sobre la morfología de Acanthamoeba spp La morfología del aislado fue estudiada cualitativa y morfométricamente. Los criterios que definen el efecto sobre la morfología descrita al microscopio de luz con 400 aumentos son: modificaciones en el tamaño y forma de los trofozoítos y quistes, cambios en el aspecto del citoplasma respecto a vacuolas digestivas y/o contráctiles, al compararlo con la morfología característica del aislado antes de ser expuesto al Ec. 2.- Evaluación del efecto del Ec sobre la viabilidad de los trofozoítos y quistes de Acanthamoeba spp La viabilidad del aislado se evaluó posterior al contacto con el Ec, utilizando el método de exclusión de dos colorantes supravitales: Azul de Tripano 0,4% y Rojo Congo 0,4 % y fue reportada en porcentaje (%) de células vivas (Jiménez, 2003). Las observaciones se realizaron en un microscopio óptico (Olympus), con objetivo de 10x y 40x, considerando el número de células vivas entre 100 células totales contadas. El % de viabilidad celular se calculó, según la siguiente fórmula: % Viabilidad celular = N° células vivas x 100 Total de células 3.- Evaluación de la capacidad lítica del Ec sobre los trofozoítos y quistes de Acanthamoeba spp La evaluación de la capacidad lítica del Ec sobre el aislado se realizó mediante el recuento de amibas antes y después del contacto de las mismas con el extracto. Se colocó un inóculo inicial y posteriormente, al concluir cada tiempo de incubación de las amibas con las concentraciones del Ec, se recogió el volumen de cada uno de los pozos por separado y se colocó una gota de la suspensión en cámara de Neubauer para realizar el recuento final de las amibas. El porcentaje de lisis se calculó utilizando la siguiente fórmula: 57
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el tratamiento <strong>de</strong> las mismas tiene limitaciones. En la constante búsqueda <strong>de</strong> nuevos medicamentos para el<br />
tratamiento <strong>de</strong> estas afecciones, <strong>un</strong> gran número <strong>de</strong> agentes terapéuticos y <strong>de</strong> extractos <strong>de</strong> plantas han sido<br />
analizados in vitro para evaluar su actividad amebicida contra este patógeno. En este sentido, se planteó evaluar<br />
in vitro la actividad biológica <strong>de</strong>l extracto crudo alcohólico (Ec), obtenido <strong>de</strong> <strong>Pera</strong> <strong>distichophylla</strong>, <strong>un</strong>a<br />
planta <strong>de</strong>l Amazonas, <strong>sobre</strong> <strong>un</strong> <strong>aislado</strong> <strong>de</strong> Acanthamoeba spp (A27), proveniente <strong>de</strong> <strong>un</strong> paciente con úlcera<br />
corneal. Se evaluó el efecto <strong>de</strong>l extracto Ec a concentraciones <strong>de</strong> 1 mg/ml y 10 mg/ml <strong>sobre</strong> trofozoitos<br />
y quistes <strong>de</strong> Acanthamoeba spp, en placas <strong>de</strong> poliestireno <strong>de</strong> 24 pozos. Se observó inhibición en el<br />
crecimiento amibiano, a ambas concentraciones evaluadas, siendo mayor el efecto a 10 mg/ml; también<br />
se observaron cambios morfológicos en los trofozoitos, como redon<strong>de</strong>amiento y vacuolización, como<br />
signos <strong>de</strong> <strong>de</strong>generación y muerte celular. En los quistes, no se observaron cambios morfológicos visibles<br />
al microscopio <strong>de</strong> luz, ni variaciones en el tamaño, al ser enfrentados a las concentraciones estudiadas. Los<br />
resultados sugieren que el extracto pareciera producir lisis en los trofozoítos y activida<strong>de</strong>s amebostática,<br />
lítica y amebicida a las concentraciones <strong>de</strong> 1 y 10 mg/ml. Se sugiere evaluar otras concentraciones para<br />
complementar los resultados obtenidos en este trabajo y realizar estudios ultraestructurales para la <strong>de</strong>tección<br />
<strong>de</strong> modificaciones en la célula.<br />
Palabras claves: Acanthamoeba spp, <strong>Pera</strong> <strong>distichophylla</strong>, úlcera corneal, tratamiento.<br />
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INTRODUCCIóN<br />
Las plantas y sus <strong>de</strong>rivados han representado,<br />
<strong>de</strong>s<strong>de</strong> la antigüedad, <strong>un</strong>a buena opción terapéutica<br />
para alg<strong>un</strong>as enfermeda<strong>de</strong>s. Venezuela posee en el<br />
Amazonas, gran diversidad <strong>de</strong> especies vegetales<br />
alg<strong>un</strong>as con propieda<strong>de</strong>s curativas, y se ubica como<br />
<strong>un</strong>o <strong>de</strong> los países con mayores fuentes naturales<br />
para el <strong>de</strong>sarrollo <strong>de</strong> la industria farmacéutica en el<br />
tratamiento <strong>de</strong> enfermeda<strong>de</strong>s. En los últimos años,<br />
las infecciones por Acanthamoeba spp se han incrementado,<br />
especialmente las afecciones oculares por<br />
Acanthamoeba spp (Díaz et al., 1993; Bermú<strong>de</strong>z<br />
et al., 1997;) y el tratamiento farmacológico utilizado<br />
tiene ciertas limitaciones (Dribe et al.,1988;<br />
Kilvington et al., 1990). En la búsqueda <strong>de</strong> nuevas<br />
opciones terapéuticas para <strong>un</strong> tratamiento efectivo<br />
contra este protozoario, surge la inquietud <strong>de</strong> evaluar<br />
productos naturales provenientes <strong>de</strong> plantas,<br />
ya que se ha reportado la existencia <strong>de</strong> actividad<br />
amebicida <strong>de</strong> alg<strong>un</strong>os extractos <strong>sobre</strong> diferentes<br />
especies <strong>de</strong> Acanthamoeba (My Chu et al., 1998;<br />
Vural et al., 2007; Polat et al., 2007a,b; 2008). Con<br />
el análisis fitoquímico y biológico <strong>de</strong> <strong>un</strong>a planta <strong>de</strong>l<br />
Amazonas, <strong>Pera</strong> <strong>distichophylla</strong>, se <strong>de</strong>mostró que<br />
el extracto crudo alcohólico (Ec) <strong>de</strong> hojas y ramas<br />
posee actividad antiparasitaria <strong>sobre</strong> Trypanosoma<br />
cruzi (L<strong>un</strong>a, 2003). Estos ensayos fueron ampliados<br />
por Rodríguez-Ortega y colaboradores, al<br />
evaluar la actividad anti- parasitaria para T. cruzi<br />
<strong>de</strong> los extractos acuosos (Ea) y alcohólicos (Ec) <strong>de</strong><br />
<strong>Pera</strong> glabrata y <strong>de</strong> <strong>Pera</strong> <strong>distichophylla</strong>, así como<br />
su actividad antiviral <strong>sobre</strong> los virus <strong>de</strong> <strong>de</strong>ngue y<br />
fiebre amarilla, obteniéndose inhibición <strong>de</strong> la replicación<br />
<strong>de</strong> epimastigotes <strong>de</strong> T. cruzi por los Ea <strong>de</strong><br />
ambas plantas y en especial, <strong>de</strong>l Ea <strong>de</strong> P. glabrata<br />
<strong>sobre</strong> la replicación <strong>de</strong> las formas amastigotas <strong>de</strong>l<br />
parásito. En relación con el virus <strong>de</strong>l <strong>de</strong>ngue y <strong>de</strong> la<br />
fiebre amarilla, los Ec fueron más efectivos que los<br />
Ea (Rodríguez et al., 2006). En las infecciones por<br />
Acanthamoeba spp, el uso <strong>de</strong> extractos naturales<br />
sería <strong>un</strong>a excelente alternativa ante las limitaciones<br />
actuales para el tratamiento <strong>de</strong> las mismas. Basado<br />
en estas investigaciones, se planteó evaluar in vitro<br />
la actividad biológica <strong>de</strong>l Ec obtenido <strong>de</strong> <strong>Pera</strong><br />
<strong>distichophylla</strong>, <strong>sobre</strong> <strong>un</strong> <strong>aislado</strong> <strong>de</strong> Acanthamoeba<br />
spp, A27, proveniente <strong>de</strong> <strong>un</strong> paciente con úlcera<br />
corneal.<br />
MATERIAL Y MÉTODO<br />
Material vegetal: <strong>Pera</strong> <strong>distichophylla</strong> (Euphorbiaceae),<br />
fue i<strong>de</strong>ntificada y recolectada por el Prof.<br />
Anibal Castillo (Universidad Central <strong>de</strong> Venezuela,<br />
Instituto <strong>de</strong> Biología Experimental), cerca <strong>de</strong>l Río<br />
Sipapo, M<strong>un</strong>icipio Autana, Estado Amazonas. En<br />
el Laboratorio <strong>de</strong> Productos Naturales <strong>de</strong> la Escuela<br />
<strong>de</strong> Química <strong>de</strong> la Facultad <strong>de</strong> Ciencias <strong>de</strong> la Universidad<br />
Central <strong>de</strong> Venezuela fueron obtenidos 3<br />
Rev. Ibero-Latinoam. Parasitol. (2012); 71 (1): 55-61