(Eh) y metanÃ³lico (Em) de Pera distichophylla sobre un aislado de ...

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A. DORLA et al. en los campos observados. El inóculo sembrado en cada placa fue variable, ya que estuvo constituido por las amibas recolectadas después de la acción de cada extracto y control de DMSO respectivo. Se determinó si hubo crecimiento al comparar la observación realizada a las 2 horas respecto a la observación de los 7 días. Análisis estadístico: Los datos obtenidos de los experimentos para evaluar el efecto de ambos extractos sobre el número de amibas, se agruparon en tablas de contingencia, para ser analizados posteriormente mediante la prueba de chi-cuadrado, usando el programa GraphPad Instad 3.02 (software GraphPad, San Diego, c.a). Los valores de los resultados se consideraron significativos, si p < 0,05, para 1 grado de libertad. 46 RESULTADOS 1.- Morfología del aislado A 27 de Acantthomoeba spp.: El aislado A27 de Acanthamoeba spp., antes de ser expuesto a las diferentes concentraciones de los extractos, presentó las siguientes características al microscopio óptico: a) Trofozoítos: forma irregular, con una medida promedio de 26 m de diámetro mayor; emisión de filopodios (acantopodios). Endoplasma granular, 1 ó 2 vacuolas contráctiles con un diámetro promedio de 4 m y algunas vacuolas digestivas (Figura 1-A). b) Quistes: con doble pared quística, exoquiste ligeramente ondulado y endoquiste irregular o poliédrico con varias puntas; diámetro promedio de 14 m. El citoplasma se observó finamente granuloso y el núcleo no fue evidenciado en el examen al fresco (Figura 1-B). En los trofozoítos, la exposición al Eh y sus controles de DMSO a diferentes tiempos, sólo produjo cambios en la forma, observándose redondeamiento celular, con un diámetro promedio de 20 µ, vacuolas degenerativas de aproximadamente 12,5 µ y numerosos gránulos intracitoplasmáticos (Figura 2). Estas modificaciones fueron evidentes a partir de las 48 horas, presentándose en los controles de DMSO, mientras que a las 72 horas, los cambios mencionados se observaron tanto en los controles de DMSO como en las concentraciones del Eh. Cabe destacar que, a las 96 horas no hubo modificaciones de la morfología de los trofozoítos, en ninguno de los controles ni de las concentraciones del extracto Eh. Luego de la exposición del aislado A27 a las concentraciones de DMSO y del extracto Em, tampoco se evidenciaron cambios morfológicos en los quistes, sólo en la forma vegetativa, los cuales Figura 1. A: Trofozoíto de Acanthamoeba spp., aislado A27, antes de la exposición a los extractos Eh y Em de Pera distichophylla. Examen directo en medio liquido de Page modificado, 1.000 aumentos. Se observa el ectoplasma (a) con escasos acantopodios (b) y endoplasma (c) Vacuola contráctil (d) y digestivas (e) Núcleo con cariosoma evidente (f). B: Quistes de Acanthamoeba spp., aislado A27, antes de la exposición a los extractos Eh y Em de Pera distichophylla. Examen directo en medio líquido de Page modificado. 1.000 aumentos. arriba: quiste con 4 puntas; abajo: quiste con 6 puntas. Se observan dos quistes de Acanthamoeba spp., donde se evidencia ecto (a) y endoquiste (b), con poro u ostiolo (c). Rev. Ibero-Latinoam. Parasitol. (2012); 71 (1): 42-54
Figura 2. Trofozoítos de Acanthamoeba spp., aislado A27, luego de la exposición al extracto Eh Pera distichophylla. (Examen directo en medio líquido de Page modif. 1.000 aumentos). A: trofozoíto en DMSO 3,5% a las 48 horas de incubación, con vacuola degenerativa (a), ectoplasma hialino (b) con numerosos acantopodios (c) y endoplasma granuloso y vacuolado (d), B: trofozoíto en DMSO 3,5% a las 48 horas de incubación, redondeado sin acantopodios, con gránulos (e), C: se observan 3 trofozoítos vivos redondeados, vacuolados y con gránulos, expuestos al Eh 3,8 mg/ml a las 72 horas (Examen directo con colorante supravital Azul de Tripano, 1.000 aumentos). Figura 3. Trofozoítos de Acanthamoeba spp., aislado A27, luego de la exposición al extracto Em Pera distichophylla. A: trofozoíto en Em 3,8% a las 48 horas de incubación (Examen directo en medio líquido de Page modificado. 1.000 aumentos), redondeado y vacuolado, con gránulos en endoplasma (a), B: trofozoíto vivo redondeado, con gránulos finos (a). C: trofozoíto muerto, redondeado y vacuolado, con gránulos endoplásmicos (a). B y C: trofozoítos expuestos al Em 3,8 mg/ml a las 96 horas (Examen directo con colorante supravital Azul de Tripano, 1.000 aumentos). Los trofozoítos en A, B y C se observan rodeados de material granuloso (b), proveniente del extracto Em. fueron semejantes a los descritos para el Eh (Figura 3). Estos cambios se presentaron a las 24 horas para el DMSO 1,5% y Em 0,75 mg/ml. A las 48 y 72 horas, las modificaciones también fueron evidentes en el aislado expuesto al Em 3,8%, manteniéndose las mismas hasta las 96 horas de exposición, a diferencia de lo que ocurre al aislado expuesto al Em 0,75 mg/ml, que no presenta alteraciones en su morfología. 2.- Efecto del Eh y Em de P. distichophylla sobre el número de amibas (trofozoítos y quistes) del Aislado A27 de Acanthamoeba spp. Evaluación de la capacidad lítica: Antes de la evaluación de los extractos a las diferentes concentraciones Rev. Ibero-Latinoam. Parasitol. (2012); 71 (1): 42-54 PERA DISTICHOPHYLLA SOBRE ACANTHAMOEBA DE ÚLCERA CORNEAL se realizo una curva de crecimiento del parásito en cultivos en placas de poliestireno 24 pozos. Al realizar los recuentos del número de amibas durante las distintas horas de duración del experimento, se obtuvo que, a las 2 horas de haber colocado el inóculo inicial, ocurrió una disminución en el número de amibas, que se prolongó hasta la 24 horas. A partir de este tiempo, y hasta las 72 horas, hubo un aumento en el número de amibas, el cual decreció a las 96 horas de observación, por lo cual, se consideró las 24 horas como el tiempo inicial y por ende, el recuento basal de cada ensayo. 2.1.- Efecto del Eh y Em P. distichophylla sobre el número de trofozoítos y quistes. Evaluación de la capacidad lítica. 47
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