(Eh) y metanólico (Em) de Pera distichophylla sobre un aislado de ...

se realizaron por duplicado. Los trofozoítos y
quistes se incubaron con los extractos a 37ºC,
evaluando el efecto de cada concentración y de los
controles sobre las amibas a diferentes tiempos de
exposición: 2, 24, 48, 72 y 96 horas. Al concluir
cada tiempo, se recolectó el contenido de cada pozo,
midió el volumen obtenido, realizó el recuento
final de las amibas y se observó la morfología.
Posteriormente, se realizó un lavado con medio de
cultivo líquido, posterior centrifugación a 150 g y
descarte del sobrenadante, para detener el efecto
de los extractos y del DMSO en el caso de los
controles respectivos. El sedimento obtenido fue
resuspendido en medio líquido y se evaluó el efecto
de los extractos en los quistes y trofozoítos sobre
su viabilidad y el crecimiento en cultivo en medio
de Page modificado por Chinchilla y col. (1979)
en placas de petri. Los bioensayos realizados se
describen a continuación:
1.- Evaluación del efecto de Eh y Em de P.
distichophylla sobre la morfología del aislado A27
de Acanthamoeba spp.
La morfometría del aislado A27 de Acanthamoeba
spp. fue evaluada antes y después del contacto
con los extractos, mediante examen al fresco
con objetivo de 40x. Para determinar el posible
efecto sobre el aislado, se tomaron en consideración
los siguientes parámetros: a) Para los trofozoítos,
redondeamiento, variaciones del tamaño, vacuolización
del citoplasma y variaciones del tamaño de
la vacuola contráctil, b) para los quistes, igualmente
se consideró cambios de forma y/o tamaño de los
mismos.
2.- Evaluación del efecto de Eh y Em de
P.distichophylla sobre el número de trofozoítos y
quistes del aislado A27 de Acanthamoeba spp. Determinación
de la capacidad lítica.
La evaluación de la capacidad lítica se realizó
mediante el recuento de amibas antes y después del
contacto con los extractos. Al concluir cada tiempo
de incubación, se recogió el volumen de cada pozo
por separado y se colocó una gota de la suspensión
en cámara de Neubauer para realizar el recuento
final de las amibas por duplicado. El porcentaje de
lisis se calculó utilizando la siguiente fórmula:
Para comparar los resultados del porcentaje (%)
de lisis obtenido al emplear esta metodología, con
los reportes de lisis celular producidos por extractos
naturales sobre células (epitelio corneal) descrito
por otros autores (Polat et al., 2007ª), se hizo una
transformación de los mismos a la siguiente escala
numérica: 0= lisis no detectable (0%); 1 = menos
de 20% de lisis; 2 = 20-40% de lisis; 3 = > 40 a <
60% de lisis; 4 = > 60 a < 80% de lisis; 5 > de 80%
de lisis.
3.- Evaluación del efecto de Eh y Em de P. distichophylla
sobre la viabilidad del aislado A27 de Acanthamoeba
spp. mediante el método de exclusión de
colorantes: azul de tripano.
Al concluir los tiempos de incubación de las
amibas con los extractos, se recolectó el contenido
de cada pozo, se lavó y se obtuvo el sedimento después
de centrifugar. Se colocó una gota del mismo
con una gota del colorante supravital azul de tripano,
se observó al microscopio y determinó el porcentaje
de amibas vivas y muertas. Como controles
de la prueba, se examinó amibas sin tratamiento y
amibas muertas por calor o con lugol, con el azul
de tripano. Se contaron las amibas en cada preparación,
por duplicado. Se consideraron como amibas
vivas, los trofozoítos y quistes que no tomaron el
colorante, y lo contrario en el caso de las amibas
muertas. Se estimó el % de viabilidad según la fórmula
siguiente:
% viabilidad: Nº de amibas vivas x 100
Total de amibas contadas
4.- Crecimiento del aislado A27 de Acanthamoeba
spp. en el medio de Page modificado por Chinchilla
y col. (1979), luego de diferentes tiempos de exposición
a Eh y Em de P. distichophylla.
Una alícuota (no cuantificada) de las amibas
expuestas a los extractos y al DMSO fue sembrada
en el medio de Page modificado por Chinchilla
et al., (1979), en placas de petri, e incubadas a
37ºC. La placa de cultivo fue examinada mediante
microscopio invertido con objetivo de 25x,
a las 2 horas y a los 7 días y se estimó semicuantitativamente
la cantidad de amibas presentes
% de lisis= Nº de amibas (T y Q) iniciales - Nº de amibas (T y Q) finales x 100
Nº de amibas (T y Q) iniciales
Rev. Ibero-Latinoam. Parasitol. (2012); 71 (1): 42-54
PERA DISTICHOPHYLLA SOBRE ACANTHAMOEBA DE ÚLCERA CORNEAL
45