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C. ZÚÑIGA et al. RESUMEN Ratones Balb/c, de dos y ocho meses de edad, se infectaron con 2.000 tripomastigotes Dm28c de Trypanosoma cruzi. A las dos semanas de infección, los machos jóvenes alcanzaron parasitemia de 5.1 x 10 5 parásitos/mL y 50% de mortalidad acumulada, la que llegó al 100% a los 40 días. Los machos de mayor edad. Alcanzaron parasitemia de 3.2 x 10 5 parásitos/mL y supervivencia del 40% más allá de los cuatro meses de infección. La histopatología mostró diferencias en la distribución y severidad del daño, entre ambos grupos de ratones. Los de mayor edad mostraron pseudoquistes y daño cardiaco seguido de una lenta reparación mientras las lesiones aumentaban en músculo esquelético de los ratones jóvenes, en ausencia de pseudoquistes y parásitos libres. Las diferencias en parasitemia, daño tisular y mortalidad observada en los ratones aquí infectados, sugiere que la edad puede afectar la efectividad de la respuesta inmune para controlar el daño parásito-dependiente y/o inmunológico, en órganos específicos. Aunque no hay evidencia del rol patogénico del parásito y/o de la respuesta autoinmune en la evolución de la enfermedad, la mortalidad de los ratones jóvenes puede obedecer a mecanismos adicionales de daño, como las alteraciones neurológicas asociadas a arritmias malignas y muerte súbita en humanos. Estas alteraciones no ocurrirían en ratones de mayor edad, como consecuencia del deterioro del sistema inmune que acompaña al envejecimiento. Palabras clave: Trypanosoma cruzi, ratones, parasitemia, histopatología, edad. 24 INTRODUCCIóN La Enfermedad de Chagas o tripanosomosis americana, que puede presentarse como una infección aguda a menudo asintomática o, como ocurre en la mayoría de los casos, en forma de un síndrome crónico y debilitante, es causada por el protozoo Trypanosoma cruzi. Debido a su amplia distribución y alta prevalencia en el hombre y animales, la infección constituye un importante problema de salud pública en Centro y Sudamérica (Dias et al., 2002) causando anualmente la muerte de casi 15.000 personas (Rodríguez y Albajar, 2010). Existen más de 100 especies de insectos triatominos que transmiten T. cruzi, el que puede infectar virtualmente a todos los mamíferos y muchas especies silvestres parecen actuar como reservorios naturales del parásito (Guhl, 2007; Costa y Lorenzo, 2009; Rodríguez y Albajar, 2010;). Además de la forma habitual de infección a través del insecto hematófago, los humanos pueden infectarse por transfusión sanguínea, por vía transplacentaria, transplante de órganos, accidentes de laboratorio o por la ingestión de alimentos contaminados con deyecciones de insectos infectados (Moncayo y Yanine, 2006; Clayton, 2010). Después de ingresar en el hospedero vertebrado, el parásito puede infectar macrófagos, células de músculo liso y músculo es- triado, fibroblastos y virtualmente todas las células nucleadas del hospedero (Andrade et al., 2010). El modelo murino de infección experimental con T. cruzi ha resultado muy útil en el estudio de la Enfermedad de Chagas, puesto que imita muchos aspectos de la enfermedad humana, incluyendo los mecanismos de daño tisular (Andrade y Magalhaes, 1996; Andrade et al., 1999; Andrade et al., 2002; Diaz et al., 2004: Valenzuela et al., 2010;) y los mecanismos inmunológicos involucrados en el control del parásito (Zúñiga et al., 2002; Andersson et al., 2003). Distintas cepas de ratones difieren en la susceptibilidad o resistencia a la infección con T. cruzi, existiendo al parecer un complejo control genético de los niveles de parasitemia y supervivencia de los animales infectados (Wrightsman et al., 1982; Zúñiga et al., 1998). Se ha descrito que tanto factores dependientes del hospedero como factores dependientes del parásito pueden tener importante efecto en el desarrollo y evolución de la infección con T. cruzi. Entre estos factores se encuentran el repertorio genético, sexo, y edad del hospedero, así como la dosis del inoculo inicial y la cepa de parásito, aún cuando la influencia de algunas de estas variables no ha sido claramente establecida (Urzúa et al., 2004). En el presente trabajo se analizó la influencia que la edad del individuo infectado puede tener en la prepatencia, niveles de parasitemia, mortalidad y Rev. Ibero-Latinoam. Parasitol. (2012); 71 (1): 23-33
alteraciones histopatológicas a nivel de corazón y músculo esquelético en ratones jóvenes de 2 meses de edad y ratones mayores, de 8 meses de edad, experimentalmente infectados con T. cruzi. MATERIALES Y MÉTODOS Parásitos. La infección experimental se realizó utilizando tripomastigotes sanguíneos del clon Dm28c de T. cruzi (Contreras et al., 1988). Esta cepa de parásito es mantenida in vivo en el bioterio de la Unidad de Inmunología de la Facultad de Ciencias Veterinarias y Pecuarias de la Universidad de Chile, mediante el traspaso semanal de tripomastigotes en ratones Balb/c. Ratones. Se utilizaron cuatro grupos de 10 ratones machos, de la cepa Balb/c. Los dos primeros grupos corresponden a ratones jóvenes de dos meses de edad y los dos grupos restantes corresponden a ratones mayores, de ocho meses de edad. Esta cepa de ratones Balb/c proviene originalmente del Jackson Laboratory, Bar Arbor, Maine, U.S.A. Modelo de infección experimental. Para la obtención de parásitos, se extrajo 0,6 mL de sangre mediante punción cardiaca de un ratón Balb/c infectado con el clon Dm28c de T. cruzi, y sacrificado cumpliendo con las normas bioéticas establecidas en el Manual de Normas de Biseguridad de la Comisión Nacional de Investigación Científica y Tecnológica (CONICYT), Chile. La sangre así extraída se colocó en un tubo estéril conteniendo 0,1 mL de citrato de sodio, como anticoagulante. Luego se realizó una dilución de 10 uL. de sangre infectada en 490 uL de suero fisiológico estéril y se hizo un recuento de parásitos en cámara de Neubauer. Este procedimiento permitió determinar la cantidad total de parásitos totales en los 0,6 mL de sangre extraídos del ratón experimentalmente infectado. Posteriormente se realizaron las diluciones requeridas para obtener 2.000 parásitos en 0,2 mL que fue la cantidad inoculada por vía intraperitoneal en a cada uno de los ratones de los grupos experimentalmente infectados. Los 2 grupos control de dos y ocho meses de edad se inocularon con 0,2 mL de sangre de ratones Balb/c no infectados y diluida de manera similar a los grupos infectados. Estudio de Parasitemia. Los ratones experimentalmente infectados se sangraron cada dos días, a partir del tercer día postinfección (p.i) y los nive- Rev. Ibero-Latinoam. Parasitol. (2012); 71 (1): 23-33 EDAD DEL HOSPEDERO EN LA INFECCIÓN CON TRYPANOSOMA CRUZI les de parasitemia se analizaron hasta la muerte de los ratones o hasta la negatividad en los niveles de parasitemia. La sangre fue obtenida de la vena caudal, en tubos de micro hematocrito heparinizados. Luego cada muestra fue centrifugada a 700 g por 5 minutos, dejando reposar por 30 minutos en estufa a 37ºC para luego medir el volumen de sangre en cada tubo. Finalmente cada muestra se colocó en un portaobjeto para determinar el número de parásitos en 50 campos elegidos al azar y utilizando un aumento de 400x. Los resultados se expresaron como el promedio de parasitemia del grupo y la desviación estándar correspondiente, de acuerdo al método descrito por Arias y Ferro (1988). Estudio histopatológico. Se sacrificó un ratón de cada grupo los días 13, 23 y 33 p.i. y se tomaron muestras de tejido cardiaco y músculo esquelético para su estudio histopatológico. Los tejidos se fijaron en Bouin-formalina y se incluyeron en parafina para finalmente realizar cortes de 5 μm que se tiñeron con hematoxilina-eosina. La severidad del daño tisular y la presencia de pseudoquistes se realizó utilizando un aumento de 100x y se representó como negativo (-) al tejido preservado y sin signos aparentes de daño tisular. La intensidad de las lesiones fue evaluada en conformidad a la severidad de la infiltración inflamatoria, uytilizando el siguiente criterio: (+) Lesiones inflamatorias mínimas con discreto infiltrado leucocitario; (++) Lesiones moderadas, con infiltrado leucocitario, hiperemia y edema; (+++) Lesiones severas, infiltrado leucocitario, hiperemia, edema y necrosis. El tropismo tisular y número de parásitos intracelulares se evaluó en 10 campos microscópicos de cada corte de tejido, examinados con aumento de 600x y se representó de la siguiente manera: (-) Negativo, ausencia de células parasitadas (pseudoquistes); (+) Leve, presencia de 1-5 células infectadas; (++) Moderado, presencia de 6-10 pseudoquistes; (+++) Severo, presencia de 11 o más pseudoquistes. Análisis Estadístico. Los resultados de los niveles máximos de parasitemia se analizaron mediante una prueba de t. El análisis de supervivencia se realizó de acuerdo al método de Kaplan y Meier (1958). RESULTADOS Y DISCUSIóN En la Figura 1 se muestra la evolución de los 25
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