(Eh) y metanólico (Em) de Pera distichophylla sobre un aislado de ...
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Cultivo <strong>de</strong> línea celular - Se utilizaron células<br />
epiteliales aisladas <strong>de</strong> riñón <strong>de</strong> mono ver<strong>de</strong> africano<br />
(células Vero-ATCC) cultivadas en medio MEM<br />
suplementado con 5% <strong>de</strong> SFB y antibióticos e<br />
incubadas a 37ºC en <strong>un</strong>a atmósfera <strong>de</strong> 5% <strong>de</strong> CO 2 .<br />
Infección celular - Se utilizaron formas tripomastigotes<br />
<strong>de</strong> cada <strong>un</strong>o <strong>de</strong> los <strong>aislado</strong>s en estudio,<br />
en <strong>un</strong>a proporción 10 tripomastigotes / 1 célula.<br />
Para ello se utilizaron cultivos <strong>de</strong> Células Vero-<br />
ATCC en monocapa con <strong>un</strong> 70-80% <strong>de</strong> confluencia<br />
y se incubó a 37°C. Una vez iniciada la liberación<br />
<strong>de</strong> formas tripomastigotes al medio <strong>de</strong> cultivo, éste<br />
fue colectado y la concentración <strong>de</strong> tripomastigotes<br />
vivos se <strong>de</strong>terminó en cámara <strong>de</strong> Neubauer.<br />
Ensayo in vitro con tripomastigotes - En <strong>un</strong>a<br />
microplaca estéril <strong>de</strong> 96 pozos <strong>de</strong> fondo plano se<br />
agregaron 100 µL <strong>de</strong> <strong>un</strong>a suspensión <strong>de</strong> 1x10 8<br />
parásitos/mL a cada pozo. Inmediatamente se añadió<br />
50 µL <strong>de</strong>l fármaco a diversas concentraciones (0,01<br />
- 0,1 - 1 - 10 - 100 - 1.000 µg/mL). Se incubó a<br />
37ºC durante 72 horas. Cumplido el tiempo <strong>de</strong><br />
incubación se agregó a cada pozo 20 µL <strong>de</strong> <strong>un</strong>a<br />
solución <strong>de</strong> MTT. Se reincubó la placa durante 3<br />
horas a 37°C y se procedió disolver los cristales<br />
<strong>de</strong> formazán con <strong>un</strong>a solución <strong>de</strong> SDS 0,01% en<br />
HCl 0,1N. El producto <strong>de</strong> formazán solubilizado<br />
fue cuantificado con la ayuda <strong>de</strong> <strong>un</strong> lector <strong>de</strong><br />
microplacas TECAN-s<strong>un</strong>rise a 570 nm. Cada<br />
ensayo se realizó por duplicado con sus respectivos<br />
controles mantenidos sin la presencia <strong>de</strong>l fármaco.<br />
Análisis Estadísticos - La actividad <strong>de</strong> los fármacos<br />
fue expresada como la concentración necesaria<br />
para inhibir el 50% <strong>de</strong>l crecimiento parasitario<br />
(CI 50 ) (Alzamora et al., 2007). Fue calculada<br />
con <strong>un</strong> intervalo <strong>de</strong> confianza <strong>de</strong>l 95% mediante<br />
<strong>un</strong>a regresión no lineal, usando para ello el software<br />
GRAPHPAD PRISM (Intuitive Software for<br />
Science, San Diego, CA, USA). Los resultados<br />
son mostrados como la media ± <strong>de</strong>sviación estándar<br />
(DS) <strong>de</strong> tres experimentos in<strong>de</strong>pendientes. Las<br />
comparaciones y significancias estadísticas fueron<br />
<strong>de</strong>terminadas por <strong>un</strong> análisis <strong>de</strong> t <strong>de</strong> Stu<strong>de</strong>nt. Adicionalmente,<br />
se realizaran análisis <strong>de</strong> correlación<br />
lineal <strong>de</strong> Pearson con la finalidad <strong>de</strong> evaluar si el<br />
aumento en la concentración <strong>de</strong> los fármacos tiene<br />
o no relación con la viabilidad celular. Valores <strong>de</strong> p<br />
< 0,05 fueron consi<strong>de</strong>rados significativos.<br />
RESULTADOS<br />
Evaluación <strong>de</strong> la susceptibilidad <strong>de</strong> <strong>aislado</strong>s<br />
<strong>de</strong> T. cruzi en estadio <strong>de</strong> epimastigote - La actividad<br />
<strong>de</strong> los fármacos NF y BZ contra epimastigotes <strong>de</strong> T.<br />
cruzi es mostrada en la Tabla 2. Todos los <strong>aislado</strong>s<br />
evaluados fueron susceptibles a NF (CI 50 <strong>de</strong> 3,65<br />
± 1,00 a 63,42 ± 7,43 µM) y a BZ (CI 50 <strong>de</strong> 35,78<br />
± 4,33 a 50,43 ± 9,42 µM). Para el caso específico<br />
<strong>de</strong>l fármaco NF, es posible observar variaciones<br />
los valores <strong>de</strong> CI 50 <strong>de</strong>pendiendo <strong>de</strong>l <strong>aislado</strong>. Caso<br />
contrario se obtiene en la evaluación <strong>de</strong>l fármaco<br />
BZ <strong>sobre</strong> los cuatro <strong>aislado</strong>s parasitarios, don<strong>de</strong><br />
los valores <strong>de</strong> CI 50 no presentan variaciones<br />
estadísticamente significativas (p > 0,05). De los<br />
resultados obtenidos para los <strong>aislado</strong>s parasitarios<br />
en estadio epimastigote, el <strong>aislado</strong> <strong>de</strong> trasmisión<br />
oral 1.593 presentó los valores más bajos <strong>de</strong> CI 50 a<br />
ambos fármacos, con valores <strong>de</strong> 3,65 ± 1,00 µM y<br />
35,78 ± 4,33 µM para NF y BZ, respectivamente.<br />
Por otra parte, el <strong>aislado</strong> EP mostró el valor más<br />
alto <strong>de</strong> CI 50 al fármaco NF (63,42 ± 7,43 µM); caso<br />
similar se obtuvo para el <strong>aislado</strong> <strong>de</strong> transmisión<br />
vectorial PM con <strong>un</strong> valor <strong>de</strong> CI 50 al fármaco BZ <strong>de</strong><br />
50,43 ± 9,42 µM.<br />
Tabla 2. Susceptibilidad in vitro a Nifurtimox y Benznidazol <strong>de</strong> <strong>aislado</strong>s humanos <strong>de</strong> Trypanosoma cruzi en<br />
estadio <strong>de</strong> epimastigote<br />
Aislado Modo <strong>de</strong> transmisión CI50 (µM) (media ± DS)<br />
NF BZ<br />
EP ND 63,42 ± 7,43 42,36 ± 6,00<br />
PM Vectorial 8,13 ± 2,77 50,43 ± 9,42<br />
1593 Oral 3,65 ± 1,00 35,78 ± 4,33<br />
1595 Oral 26,91 ± 8,60 41,32 ± 7,13<br />
ND: No <strong>de</strong>terminado. Los valores <strong>de</strong> CI50 fueron calculados a partir <strong>de</strong> tres ensayos in<strong>de</strong>pendientes.<br />
Rev. Ibero-Latinoam. Parasitol. (2012); 71 (1): 14-22<br />
SUSCEPTIBILIDAD IN VITRO T. CRUZI ISOLATES FROM VENEZUELA<br />
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