(Eh) y metanólico (Em) de Pera distichophylla sobre un aislado de ...

Cultivo de línea celular - Se utilizaron células
epiteliales aisladas de riñón de mono verde africano
(células Vero-ATCC) cultivadas en medio MEM
suplementado con 5% de SFB y antibióticos e
incubadas a 37ºC en una atmósfera de 5% de CO 2 .
Infección celular - Se utilizaron formas tripomastigotes
de cada uno de los aislados en estudio,
en una proporción 10 tripomastigotes / 1 célula.
Para ello se utilizaron cultivos de Células Vero-
ATCC en monocapa con un 70-80% de confluencia
y se incubó a 37°C. Una vez iniciada la liberación
de formas tripomastigotes al medio de cultivo, éste
fue colectado y la concentración de tripomastigotes
vivos se determinó en cámara de Neubauer.
Ensayo in vitro con tripomastigotes - En una
microplaca estéril de 96 pozos de fondo plano se
agregaron 100 µL de una suspensión de 1x10 8
parásitos/mL a cada pozo. Inmediatamente se añadió
50 µL del fármaco a diversas concentraciones (0,01
- 0,1 - 1 - 10 - 100 - 1.000 µg/mL). Se incubó a
37ºC durante 72 horas. Cumplido el tiempo de
incubación se agregó a cada pozo 20 µL de una
solución de MTT. Se reincubó la placa durante 3
horas a 37°C y se procedió disolver los cristales
de formazán con una solución de SDS 0,01% en
HCl 0,1N. El producto de formazán solubilizado
fue cuantificado con la ayuda de un lector de
microplacas TECAN-sunrise a 570 nm. Cada
ensayo se realizó por duplicado con sus respectivos
controles mantenidos sin la presencia del fármaco.
Análisis Estadísticos - La actividad de los fármacos
fue expresada como la concentración necesaria
para inhibir el 50% del crecimiento parasitario
(CI 50 ) (Alzamora et al., 2007). Fue calculada
con un intervalo de confianza del 95% mediante
una regresión no lineal, usando para ello el software
GRAPHPAD PRISM (Intuitive Software for
Science, San Diego, CA, USA). Los resultados
son mostrados como la media ± desviación estándar
(DS) de tres experimentos independientes. Las
comparaciones y significancias estadísticas fueron
determinadas por un análisis de t de Student. Adicionalmente,
se realizaran análisis de correlación
lineal de Pearson con la finalidad de evaluar si el
aumento en la concentración de los fármacos tiene
o no relación con la viabilidad celular. Valores de p
< 0,05 fueron considerados significativos.
RESULTADOS
Evaluación de la susceptibilidad de aislados
de T. cruzi en estadio de epimastigote - La actividad
de los fármacos NF y BZ contra epimastigotes de T.
cruzi es mostrada en la Tabla 2. Todos los aislados
evaluados fueron susceptibles a NF (CI 50 de 3,65
± 1,00 a 63,42 ± 7,43 µM) y a BZ (CI 50 de 35,78
± 4,33 a 50,43 ± 9,42 µM). Para el caso específico
del fármaco NF, es posible observar variaciones
los valores de CI 50 dependiendo del aislado. Caso
contrario se obtiene en la evaluación del fármaco
BZ sobre los cuatro aislados parasitarios, donde
los valores de CI 50 no presentan variaciones
estadísticamente significativas (p > 0,05). De los
resultados obtenidos para los aislados parasitarios
en estadio epimastigote, el aislado de trasmisión
oral 1.593 presentó los valores más bajos de CI 50 a
ambos fármacos, con valores de 3,65 ± 1,00 µM y
35,78 ± 4,33 µM para NF y BZ, respectivamente.
Por otra parte, el aislado EP mostró el valor más
alto de CI 50 al fármaco NF (63,42 ± 7,43 µM); caso
similar se obtuvo para el aislado de transmisión
vectorial PM con un valor de CI 50 al fármaco BZ de
50,43 ± 9,42 µM.
Tabla 2. Susceptibilidad in vitro a Nifurtimox y Benznidazol de aislados humanos de Trypanosoma cruzi en
estadio de epimastigote
Aislado Modo de transmisión CI50 (µM) (media ± DS)
NF BZ
EP ND 63,42 ± 7,43 42,36 ± 6,00
PM Vectorial 8,13 ± 2,77 50,43 ± 9,42
1593 Oral 3,65 ± 1,00 35,78 ± 4,33
1595 Oral 26,91 ± 8,60 41,32 ± 7,13
ND: No determinado. Los valores de CI50 fueron calculados a partir de tres ensayos independientes.
Rev. Ibero-Latinoam. Parasitol. (2012); 71 (1): 14-22
SUSCEPTIBILIDAD IN VITRO T. CRUZI ISOLATES FROM VENEZUELA
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