(Eh) y metanólico (Em) de Pera distichophylla sobre un aislado de ...

A. MUÑOZ et al.
cionalmente, existen diferencias en los resultados
terapéuticos según la zona geográfica evaluada
(Rassi y Luquetti, 1992; Yun et al., 2009), lo que
puede ser explicado por la presencia de diferentes
linajes del parásito en las áreas geográficas, con T.
cruzi I predominando en América Central y norte
de Sur América y T. cruzi II en el resto de Sur
América (Carranza et al., 2009). Las variaciones
en la susceptibilidad a los fármacos entre aislados
de T. cruzi han sido documentadas ampliamente en
estudios in vitro e in vivo (Filardi y Brener, 1987;
Murta et al., 1998; Toledo et al., 2003; Villareal et
al., 2004; Luna et al., 2009; Moreno et al., 2010).
Teniendo en cuenta la variabilidad en la
susceptiblidad a los fármacos NF y BZ por parte
de aislados de T. cruzi ya descrita y en vista de
la evidencia de no curación por parte de un gran
número de pacientes con ECh tratados con BZ y/o
NF, basada en la obtención de hemocultivos posttratamiento,
PCR positivas y porcentajes elevados
de anticuerpos líticos, el presente estudio propone
evaluar si aislados de T. cruzi obtenidos del brote
de ECh urbano por transmisión oral ocurrido
en Caracas-Venezuela en el 2007, presentan
variaciones en la susceptibilidad in vitro a los
fármacos NF y BZ. Adicionalmente, se evaluará
si el mecanismo de transmisión de la enfermedad
influye en la susceptibilidad a los fármacos NF y
BZ, teniendo como referencia aislados de T. cruzi
obtenidos de pacientes con ECh por transmisión
vectorial.
16
MATERIALES Y MÉTODOS
Aislamiento de parásitos y cultivo - Los
aislados parasitarios fueron obtenidos a partir de
sangre de pacientes en fase aguda de ECh cultivada
en medio bifásico agar-sangre. Se tomaron 3 mL de
sangre venosa en tubos con citrato de sodio. Todo
el contenido del tubo fue agregado a un medio
bifásico agar-sangre con medio MEM (modified
Eagle’s médium) suplementado con 5% de Suero
Fetal Bovino (SFB) inactivado y antibióticos. Las
características epidemiológicas de los aislados de
T. cruzi empleados en este estudio se muestran en
la Tabla 1.
Fármacos - Nifurtimox (Lampit®) y Benznidazol
(Rochagan®) fueron obtenidos a partir de
muestras comerciales de laboratorios Bayer (Alemania)
y Roche (Suiza), respectivamente. Se disolvieron
100mg de cada fármaco en dimethyl sulfoxide
(DMSO), manteniendo una concentración
final de DMSO que no excediera el 1% v/v. Las
soluciones de trabajo fueron preparadas en medio
de cultivo LIT o MEM antes de cada ensayo.
Ensayo in vitro con epimastigotes - En una
microplaca estéril de 96 pozos de fondo plano se
agregaron 100 µL de una suspensión de cada aislado
a una concentración de 1x10 6 parásitos/mL a cada
pozo. Se incubó a 37°C durante 96 horas. Una vez
alcanzada la fase logarítmica, se agregó 20 µL del
fármaco en estudio a diversas concentraciones
(0,01 - 0,1 - 1 - 10 - 100 - 1000 µg/mL) y se incubó
durante 72 horas a 37°C. Cumplido el tiempo de
incubación se agregó a cada pozo 20 µL de una
solución de bromuro de 3-[4,5-dimetiltiazol-2-yl]-
2,5-difeniltetrazolio (MTT). Se re incubó la placa
durante 2 horas a 37°C y se procedió a disolver los
cristales de formazán con una solución de Sodium-
Dodecil-Sulfate (SDS) 0,01% en HCl 0,1N. El
producto de formazán solubilizado fue cuantificado
con un lector de microplacas TECAN-sunrise a
570nm. Cada ensayo se realizó por triplicado con
sus respectivos controles, los cuales contaban con
todos los reactivos sin presencia de fármaco.
Tabla 1. Características epidemiológicas de los aislados de Trypanosoma cruzi
Aislado Origen Geográfico Paciente Modo de
transmisión
EP Edo. Carabobo (VE) Infante ♂ ND
PM Valencia (VE) Adulto ♀ Vectorial
1593 Caracas (VE) Infante ♀ Oral
1595
ND: No determinado.
Caracas (VE) Adulto ♀ Oral
Rev. Ibero-Latinoam. Parasitol. (2012); 71 (1): 14-22