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Rev Peru Med Exp Salud Publica 21(3), 2004Arias B. y col.Escherichia coli ENTEROAGREGATIVA EN NIÑOS CON DIARREADE UN HOSPITAL DE LIMAIsabel Arias B 1 , Omar Cáceres R 2 , Myluska Figueroa V 1 , José Huguet T 1 , Máximo Camiña Q 3RESUMENEntre las Escherichia coli diarreogénicas la categoría E. coli enteroagregativa (ECEA) es una de las más importantesy frecuentemente asociada a diarreas infantiles. El presente estudio se realizó con la finalidad de detectar losfactores de virulencia que caracterizan a esta categoría patogénica mediante hibridación por colony blot usandosondas de ADN específicas. Se evaluaron 233 cepas aisladas en el laboratorio del Hospital de Emergencias Pediátricasdurante los meses de diciembre 1998 y abril de 1999. Del total de muestras analizadas, se encontró que 17,16% delas cepas poseen el factor de virulencia característico de esta categoría. Los resultados obtenidos demuestran queun importante número de aislamientos de niños con diarrea presentan E. coli enteroagregativa.Palabras clave: Escherichia coli / Clasificación; Diarrea Infantil; Perú (fuente: BIREME).ABSTRACTAmongst Escherichia coli causing diarrheal disease, enteroaggregative E. coli is one of the most important organisms,and it is frequently associated to diarrhea in infants. The study was performed aiming at detecting virulence factorsfor the aforementioned organism, using colony blood hybridization with specific deoxyribonucleic acid (DNA) probes.233 samples isolated in the Pediatric Emergency Hospital Laboratory between december 1998 and april 1999. Of allsamples analyzed, it was found that 17,16% of them have the typical virulence factor for their category. The resultsprove that an important proportion of isolates in children with diarrheal disease have enteroaggregative E. coli.Keywords: Escherichia coli / Classification; Infantile Diarrhea; Peru (source: BIREME).INTRODUCCIÓNEscherichia coli diarreogénica, es uno de los agentesbacterianos que produce diarrea con mayor frecuenciaen el Perú y el mundo 1,2 . Se conocen hasta la fechaseis diferentes categorías patógenas, que se manifiestancon diferentes cuadros clínicos 3 .Entre las diferentes categorías de Escherichia coli sedestaca la categoría E. coli enteroagregativa (ECEA),la que se encuentra asociada a episodios de diarreasen la población infantil, provocando diversos cuadrosdesde diarreas agudas a persistentes.La finalidad del presente estudio es identificar la categoríade E. coli enteroagregativa, mediante hibridaciónpor colony blot para detectar el factor de adhesióndenominado eagg, el cual genera el patrón de adherenciaagregativa o de agregación de la bacteria característicade esta categoría.REPORTESe evaluaron cepas de E. coli, procedentes del laboratoriodel Hospital Emergencias Pediátricas (Lima,Perú), durante los meses de diciembre 1998 y abril de1999. Las cepas obtenidas para el estudio fueron aisladasa partir de muestras de casos de diarrea acuosade pacientes que ingresaron a los consultorios y salasde hospitalización de dicha institución. Se obtuvieronen total 233 cepas que fueron enviadas al LaboratorioNacional de Referencia de Enteropatógenos del InstitutoNacional de Salud (Lima, Perú) en medio de mantenimientoagar tripticasa soya para su confirmación.Se procedió a realizar la identificación bioquímica deE. coli utilizando medios selectivos y medios diferenciales.Se realizó también la identificación serológicausando antisueros polivalentes y monovalentes. Todaslas cepas debidamente confirmadas fueroncriopreservadas en caldo glicerol peptona a –70 ºC.1División de Bacteriología, Centro Nacional de Salud Pública, Instituto Nacional de Salud. Lima, Perú.2División de Biología Molecular, Centro Nacional de Salud Pública, Instituto Nacional de Salud. Lima, Perú.3Departamento de Laboratorio Clínico, Hospital de Emergencias Pediátricas. Lima, Perú176
Rev Peru Med Exp Salud Publica 21(3), 2004E. coli enteroagregativa en niñosPara la identificación genética se usaron sondas deADN para detectar el gen eagg, las cuales estuvieronclonadas en el plásmido pCVD432 4 . Las bacteriasrecom- binantes fueron cultivadas en caldo LBampicilina(100 µg/mL) y los plásmidos fueron aisladospor el método de lisis alcalina (kit Wizard Miniprep,PROMEGA). La sonda fue liberada del plásmido pordigestión enzimática con las enzimas EcoRI - Pst Icuyo tamaño fue de 700 pb y purificada utilizando el KitWizard DNA Clean-Up (PROMEGA) 4 .Las cepas de E. coli cultivadas en caldo LB fueron colocadas(20 µL) sobre membranas de nylon (+) y éstascolocadas a su vez en placas de agar tripticasa soya eincubadas a 37 °C toda la noche. Las membranas conlas colonias crecidas sobre ella fueron tratadas conSDS al 10% y con soluciones desnaturalizantes yneutralizantes con la finalidad de liberar el ADN, el cualfue fijado a la membrana por calor a 85 °C por 2 horas 4 .El marcaje de las sondas, así como la hibridación delas membranas, fue realizado usando el kit dequimioluminiscencia ECL (Amersham PharmaciaBiotech) siguiendo las instrucciones del fabricante. Finalmenteel resultado de la hibridación fue visualizadopor reacción quimioluminiscente sobre un filmautoradiográfico.Se logró identificar un total de 40 cepas (17,16%) de E.coli positivas al gen eagg correspondientes a la categoríaenteroagregativa. Además de ésta categoría seevaluó la presencia del gen bfp propio de la categoríaenteropatógena. Se detectaron 3 cepas (1,28%) con elgen bfp y 2 cepas (0,86%) que llevaban ambos genes(eagg + bfp). No se detectaron estos factores en las190 cepas (81,54%) restantes.Al realizar la serotipificación se obtuvieron 93 cepasserotipadas, siendo las 140 restantes serológicamentenegativas (Tabla 1).Los serogrupos encontrados fueron O127, O125,O114, O128, O112, O111, O126, O142, O26, O29, loscuales corresponden a las cepas donde se encontraronel gen eagg de la categoría enteroagregativa(ECEA).DISCUSIÓNEl análisis determinó la presencia de Escherichia colienteroagregativa (ECEA) en un porcentaje relevante(17,16%) en cuadros de diarrea. Se pudo observar también,que el factor bfp (1,28%) presente en las cepasde E. coli enteropatógena (ECEP) fue bajo en compa-Tabla 1. Distribución porcentual de los serogrupos deE. coli encontrados.* Serológicamente negativo a los antisueros probados.† Incluye las dos cepas que tienen ambos genes.ración con estudios realizados en otros países, en loscuales ECEP es uno de los principales y másprevalentes agentes bacterianos implicados en diarreaaguda en población infantil 3 . Es importante mencionarque algunos estudios demuestran además queE. coli enterotoxigénica (ECET) también es una categoríaprevalente en diarreas 7 . Probablemente este datopodría explicar el alto número de aislamientos de E.coli que no fueron ECEA o ECEP, ya que en este estudiono usamos sondas para la detección de los factoresde virulencia asociados a ECET.Un resultado interesante es la relación de losserogrupos y la categoría patogénica encontrada. Laliteratura asocia principalmente a los serogrupos O3,O15, O44, O77, O111, O127 con la categoríaenteroagregativa 3 . En este trabajo se encontró que losserogrupos O127 y O111 coinciden con la categoríaenteroagregativa, mientras que el resto de cepas quese identificaron como enteroagregativas correspondíana serotipos que anteriormente no se les asociabaa esta categoría patogénica. Estos resultados nosplantean la revisión de la serotipificación como herramientaen la identificación de la categoría patogénicaen E. coli. Por lo observado, es de suponer la posibilidadde encontrar nuevos serogrupos que posean elfactor de virulencia característico de ECEA.177
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