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Rev Peru Med Exp Salud Publica 21(3), 2004Variabilidad genética de Aedes aegypti por SSCPPor tanto, el objetivo del presente estudio fue determinarlas variantes genéticas de Ae. aegypti que estáncirculando en algunas localidades del país a través dela comparación del Segundo Espaciador TranscritoInterno (ITS 2) haciendo uso del SSCP.MATERIALES Y MÉTODOSMATERIAL BIOLÓGICOSe analizaron siete mosquitos Ae. aegypti por cadauna de las zonas donde se realizó la colecta de estevector, dichas zonas fueron: Sullana (Piura), Zarumilla(Tumbes), Iquitos (Loreto), Lambayeque, Jaén(Cajamarca), Tingo María (Huánuco), San Juan deAmancaes del distrito de El Rímac (Lima) y la provinciade Huaquillas (Ecuador). Las muestras se conservaronen alcohol al 70%, luego fueron enviadas desdelos laboratorios referenciales de dichos departamentoshasta los laboratorios centrales de entomología ybiología molecular del Instituto Nacional de Salud. Parala identificación taxonómica de la especie losentomólogos siguieron las claves dicotómicas deSavage y Smith 23 , Forattini 24 y Carpenter y La Casse 25 .SET DE OLIGONUCLEOTIDOSLos oligonucleotidos o primers usados para la amplificacióndel ITS 2 fueron reportados por Wesson etal. 14 y fueron sintetizados, a solicitud nuestra, porIntegrated DNA Technologies, Inc. (USA). La secuenciade estos oligonucleotidos se detalla a continuación:CP – P1A 3’- GTGGATCCTGTGAACTGCAGGACACATCP – P1B 5’- GTGTCGACATGCTTAAATTTAGGGGGTAAISLAMIENTO DE ADN DE MOSQUITOSEl aislamiento del ADN se llevó a cabo usando el KitGenomic Prep TM Cells and Tissue DNA Isolation Kit(Amersham Biosciences) siguiendo las instruccionesdel fabricante. Brevemente, cada mosquito fue trituradoindividualmente en 150 µL de PBS 1X (pH 7) usandoun microhomogeneizador descartable estéril, luegose agregó 200 µL de la solución de lisis helada alcual se le agregó 3 µL de proteinasa K (20 mg/mL) yse dejó incubando a 55 ºC en baño maría durante 12horas. Luego se le agregó 3 µL de la solución deRNasa A (10 mg/mL) y se incubó a 37 ºC durante 30minutos. A la solución se le agregó 200 µL de la soluciónprecipitante de proteínas mezclándose por agitaciónluego los tubos fueron centrifugados a 14000 x gpor 5 minutos. El ADN fue precipitado con 600 µL deisopropanol absoluto y lavado con 600 µL de etanol al70%. Finalmente el ADN precipitado fue resuspendidocon 50 µL de la solución de hidratación y se dejó a 4 ºCdurante 12 h. Finalmente, la muestra se calentó a 65 ºCdurante 1 hora para ayudar a que el ADN se disperse yse conservó a 4 ºC.La concentración del ADN fue cuantificada usando unespectrofotómetro UV/Visible (Spectronic 21D) a 260 y280 nm. Se asumió que para el ADN de doble hebra 1D.O 260es igual a 50 mg/mL de ADN. La pureza del ADNextraído se obtiene de la relación de D.O 260 nm/280nm el cual debe ser mayor de 1,7 26 .AMPLIFICACIÓN DEL ITS2 POR LA REACCIÓN ENCADENA DE LA POLIMERASA (PCR)La optimización de los diversos parámetros necesariospara la estandarización del PCR fueron realizadassegún lo descrito 27 . La concentración final de lareacción de PCR fue de 1X para el buffer, 200 µM parala mezcla de nucleótidos, 0,28 µM para cada uno delos primers, 2,25 mM de MgCl 2, 20 ng de ADN y 1U deTaq Gold® ADN polimerasa (Applied Biosystems) para25 mL de volumen final de reacción. El PCR fue realizadoen un termociclador 2400 (Applied Biosystems)donde los ciclos de amplificación fueron: 1 ciclo dedenaturación inicial a 95 ºC x 10 minutos; 30 ciclos de95 ºC x 30 segundos; 60,8 ºC x 1 minuto y 72 ºC x 30segundos y una extensión final de 72 ºC x 10 minutos.Cinco microlitros de la reacción de PCR fueron colocadosen un gel de agarosa al 1,5% en buffer TAE 1Xjunto con 250 ng de un marcador de peso molecular(100 pb DNA Ladder, Promega). El gel fue sometido aelectroforesis horizontal a 100 V por 40 minutos, posteriormentefue teñido con una solución de 0,5 µg/mLde bromuro de etidio por 10 minutos, los productos deamplificación fueron primero visualizados en untransiluminador de luz UV (UVP) y luego fotografiadosusando una cámara Polaroid® y películas Polapan665 PNIS0 80/20º (Polaroid).PURIFICACIÓN DEL PRODUCTO DE PCR DE ITS 2Los productos de PCR fueron purificados a partir degel de agarosa de bajo punto de fusión (LMP)(Promega), 25 µL del producto de PCR fue corrido endicho gel a 70 V durante 60 minutos. Las bandas deADN correspondientes al ITS 2 se extrajeron usandolaminillas cubreobjetos estériles cortando las porcio-159