Productos de la tecnología del DNA recombinante

TECNOLOGÍA DEL DNA RECOMBINANTEINTRODUCCIÓNPrincipio 1970 DNA molécula más difícil analizarEnormemente largaQuímicamente monótonaActualmente DNA molécula más fácil de estudiarEs posible separar regiones determinadas del DNAObtenerlas en cantidades prácticamente ilimitadasDeterminar su secuencia de nucleótidos a unavelocidad de varios cientos de nucleótidos al día.Un gen puede ser alterado y transferido a célulasen cultivo o a la línea germinal de animales Impacto en la biología celularDeterminar las funciones de muchas proteínasDe sus dominiosDesenmarañar complejos mecanismos de regulacióngénica en eucariotasDisponer de grandes cantidades de proteínasminoritariasA nivel comercial: producción a gran escala de hormonaspeptídicas y vacunas a bajo coste y trabajo

Etapas principales del desarrollo de latecnología del DNA Recombinante186919441953195719611962196619671972-197319751975-19771981- 19821985Miescher aisló por primera vez el DNAAvery demostró que el DNA y no la proteína contiene lainformación genéticaWatson y Crick propusieron el modelo de la doble hélice para laestructura del DNA, basados en los resultados de rayos X deFranklin y Wilkins.Kornberg descubrió la DNA polimerasa I, la enzima que ahora seutiliza para producir sondas de DNA marcadasMarmur y Doty descubrieron la renaturalización del DNA,estableciendo la especificidad y la posibilidad de las reaccionesde hibridación de los ácidos nucleicos.Alber proporcionó la primera evidencia de la existencia de lasnucleasas de restricción del DNA, que condujo a su posteriorpurificación y utilización en la caracterización de la secuencia delDNA por parte de Nathans y H. SmithNirenberg, Ochoa y Khorana dilucidaron el código genéticoGeller descubrió la DNA ligasa, la enzima utilizada para unirfragmentos de DNA.Se desarrollaron las técnicas de clonaje del DNA en loslaboratorios de Boyer, Cohen, Berg y colaboradores, en laUniversidad de Stanford y en la Universidad de California en SanFrancisco.Southern desarrollo la hibridación y transferencia sobre gel,para la detección de secuencias específicas de DNASanger y Barrell y Maxam y Gilbert desarrollaron métodosrápidos de secuenciación del DNAPalmiter y Brinster produjeron un ratón transgénico; Spradlingy Rubin produjeron moscas del vinagre transgénicas.Mullis y colaboradores inventaron la reacción en cadena de lapolimerasa (PCR, de Plomerase Chain Reaction)

Tecnología del DNA RecombinanteTécnicas utilizadasUtilización denucleasas derestricciónRotura específica del DNA, facilita enormemente elaislamiento y la manipulación de los genes individualesSecuenciaciónHibridación de losácidos nucleicosClonación del DNAIngeniería génicaLa secuenciación rápida de todos los nucleótidos deun fragmento purificado de DNA, hace posibledeterminar los límites precisos de un gen y lasecuencia de aminoácidos que codifica.Hace posible localizar secuencias determinadas deDNA o de RNA, con una gran exactitud ysensibilidad, utilizando la capacidad que tienen estasmoléculas de unirse a secuencias complementarias deotros ácidos nucleicos.Se puede conseguir que un fragmento de DNA seintegre en un elemento génico autoreplicante(plásmidos, virus) que habita en una bacteria, de talmanera que de una molécula de DNA puede serreproducida generando muchos miles de millones decopias idénticas.Se pueden alterar secuencias de DNA produciendoversiones modificadas de los genes, los cuales sepueden reinsertar en células u organismos.

Endonucleasas de restricciónLos genes no son entidades independientesRegiones de una molécula de DNA de gran tamañoFragmentación mecánica al azarTrozos pequeñosUn fragmento que contenga un gen aislado seráuno entre cientos de milesSolución: endonucleasas de restricciónW. Arber, H. Smith y D. Nathans finales 60Bisturíes de exquisita presiciónReconocen secuencias específicas en el DNA dedoble héliceCortan ambas hélices en lugares concretosProcedenciaEncontradas en gran variedad de procariotasFunción biológica destruir moléculas de DNA extrañasLos centros reconocibles propios están metiladosReconocen secuencias específicas de 4-8 pares de basesPalíndromoPalabra o frase que se lee igual de izquierda a derecha,que de derecha a izquierda:Radar, anilina, Dábale arroz ala zorra el abad

Enzimas utilizados en la tecnología del DNA recombinanteEnzima(s)FunciónEndonucleasa de restricción del tipoIIRomper DNA por secuenciasespecíficasDNA ligasaDNA polimerasa I(E. Coli)Transcriptasa inversaPolinucleótido quinasaTransferasa terminalExonucleasa IIIExonucleasa del bacteriófago λFosfatasa alcalinaUnir dos moléculas o fragmentosRellenar los huecos de DNA dúplexmediante adición escalonada denucleótidos en el extremo 3’Hacer una copia de DNA a partir deuna molécula de RNAAñadir un grupo fosfato al grupo OHdel extremo 5’ de un polinucleótidopara marcarlo o para permitirle laligaciónAñadir colas homopoliméricas al grupoOH del extremo 3’ de un dúplex linealEliminar residuos nucleotídicos delextremo 3’ de una hebra de DNAEliminar nucleótidos del extremo 5’ deun dúplex para exponer los extremos3’ monohebraEliminar fosfatos terminales deextremos 5’ o 3’, o de ambos

Endonucleasas de restricción tipo IICortan el DNA ensecuencias de basespalindrómicasSecuencias de reconocimiento para algunas endonucleasas derestricción tipo IIFlechas: enlaces fosfodiéster hidrolizados por cada endonucleasade restricción.Asteriscos:las bases que están metiladas por la correspondientemetilasa (si se conoce).N representa cualquier base.

PoliconectorPoliconector sintéticoVector de clonaciónplasmídico cortado conEcoRIConector Fragmento de DNA sintético que contiene la secuencia dereconocimiento para una endonucleasa de restricción.Policonector Fragmento sintético que contiene secuencias dianaspara varias endonucleasas de restricción.

Separación de DNA de diferentes tamañosElectroforesis en gelPoliacrilamida fragmentos menores de 500 pbDiluciones diluidas agarosaElectroforesis en gel de campo pulsanteVisualizaciónColorante bromuro de etidioMarcaje radiactivo ( 32 P) antes de electroforesisFragmentos deDNA grandesTinción con bromuro de etidioque emite fluorescencia cuandose ilumina con luz ultravioletaFragmentos deDNA pequeños

Secuenciación del DNADeterminación de la secuencia exacta de un ácido nucleicoA. Maxam y W. Gilber Por hidrólisis química específicaHebra de DNA marcada en el extremo 5’ con 32 P5’- 32 P-GCTACGTA-3’Ruptura en A:Ruptura en G:Ruptura en C:Ruptura en T:32P-GCT32P-GCTACGT32P-GCTAC32 P-G32 P-GCTA32 P-GC32 P-GCTACGAutoradiograma muestra un conjunto de bandas sobreel cual se puede lee directamente la secuenciaMétodo del didesoxi de Sanger Por interrupción controlada de lareplicación Se copia una secuencia de DNA de una hebra utilizando laDNA polimerasa ICebador complementarioMedio contieneLos cuatro desoxirribonucleótidos trifosfato(marcados)Los análogos 2’,3’-didesoxi carecen del grupohidroxilo en 3’ no se forma enlace fosfodiésterFragmentos distinta longitud con análogos didesoxiextremo 3’

Secuenciación DNA método SangerHebracebadoraHebramoldeCebadorMoldeAutoradiograma delgel de electroforesisSecuencia de lahebracomplementaria

Técnicas de las huellas de DNA(DNA footprinting)

Hibridación de ácidos nucleicosEspecie 1Especie 2Mezcla yenfriamientoDúplex híbridoDúplex de laEspecie 1Dúplex de laEspecie 2RNA o DNANorthern y SouthernMarcadores detamañoGel deagarosa1. Ácidos nucleicos separados de acuerdocon su tamaño, mediante electroforesisen gel de agarosa2. Ácidos nucleicos transferidos a unpapel de nitrocelulosa por succión deltampón a través del gel y del papel3. Membrana con los ác. Nucleicoshibridados con la sonda marcada4. Revelado mediante métodos dedetección específicos del marcaje

Clonación de DNACromosomaeucarióticoVector declonación(plásmido)Rotura conendonucleasade restricciónRotura con endonucleasade restricción, separaciónde los fragmentosVectorrecombinanteTransformaciónde la célulabacteriana huéspedPropagación celular

Tipos de vectores de clonación utilizados en E.coliTipo devectorMétodo deintroducción enE.coliMétodo depropagaciónTamañodelfragmentode DNAque sepuedeclonarPlásmidos:modificados portécnicas deDNArecombinanteTransformación; lascélulas se vuelvencompetentes paraincorporar el plásmidorecombinante; una veztransformadas, lascélulas se seleccionanmediante un marcadorseleccionableReplicaciónplásmidodelHasta15.000 pbBacteriófago λInfección con fagos;posterioralempaquetamiento invitro del vectorrecombinante enpartículas de fagoReplicación del fagoHasta23.000 pbCósmidos,construidos apartir de losplásmidos y degenes de λCualquiera de losmétodos anteriores,dependiendo deltamaño del fragmentodel DNA insertado; losfragmentos largosnecesitanelempaquetamiento en λin vitroReplicación a modode plásmidoHasta45.000 pb

Plásmidos Moléculas de DNA circular que se replican aparte delcromosoma bacterianoTamaño entre 5.000 y 400.000 pares de baseTransformaciónProceso por el cual se introduce un plásmido en lacélula bacteriana.Incubación células y plásmidos a 0ºC en solución deCl 2Ca.Choque térmico (37-45ºC)Plámido seleccionable Plásmido que contenga un gen que la célulahuésped necesite para crecer bajo ciertas condiciones.El gen es generalmente el de resistencia a un antibiótico Sóloaquellas células que hayan sido transformadas por el plásmido seránresistentes al antibiótico y podrá crecer en presencia del mismo.Características importantes de un vector de clonación plasmídicoNecesita un origen de replicació n propagar el plásmidoy mantenerlo a nivel de 10 a 20 copias por célula.Genes que confiere resistencia a antibióticos permitela selecció nVarias secuencias únicas de reconocimientos paradiferentes endonucleasas de restricció generar sitiospor donde se puede insertar las secuencias foráneas deDNATamaño global pequeño facilita la entrada del plásmidoen la célula

Plásmido pBR322Algunos sitios de restricción importantesGenes de resistencia a antibióticosEl origen de replicación (ori).Resistencia ala ampicilina(amp R )Resistencia ala tetracilina(tet R )Origende replicación(ori)

Clonación de un DNA foráneo en E. coli con pBR322DNA foráneoTransformación decélulas de E. coliTodas las coliniasque con tienenplásmidosSelección de las célulastransfromadasAgar suplementadocon tetraciclinaColinias conplásmidosrecombinantesColinias transferidaspara el ensayoAgar suplementadocon tetraciclinaAgar suplementado contetraciclina y ampicilina

Bacteriófago λ Permite clonar segmentos de DNA más largos Caracteríticas del genoma del fago: Alrededor de un tercio del genoma no esesencial permite reemplazarlo por DNAforáneo. El DNA se empaqueta en partículas de fago sólocuando tenga un tamaño entre 40.000 y 50.000pares de base.Empaquetamiento in vitro Cuando los fragmentos de DNAforáneo de tamaño adecuadose han ligado a los fragmentos delfago DNA recombinante se empaqueta dentro de partícula defago al añadir extrato crudo de células bacterianas( que contienentodas las proteínas necesarias para ensamblar un fago completo)CósmidosPlásmidos recombinantes que combinan característicasútiles de plásmidos y del bacteriófago λ.Permite la clonación de fragmentos más largosMoléculas de DNA pequeñas (5.000 a 7.000 pb)Características:Origen de replicación plasmídicoUno o más marcadores seleccionablesUn número de sitios de restricción únicos donde sepuede insertar el DNA foráneoUn sitio cos Una secuencia de DNA del bacteriófagoλ que se necesita para el empaquetamiento.No contienen ningún gen más del bacteriófagoSe propaga en E. coli como un plásmido

Vectores de clonación del bacteriófago λDNA de relleno (no necesarioen el empaquetamiento)Fragmento deDNA foráneoHan perdido DNA esencialy/o son demasiado cortos yno se empaquetanEmpaquetamientoin vitroBacteriófago λ quecontiene DNA foráneo

Clonación con cósmidosGran fragmentode DNA foráneocon extremoscohesivosCósmidorecombinanteAgar conteniendo cloranfenicoly substrato para β-galactosidasaSelección de las célulasresistentes a cloranfenicolColonias con cósmidosrecombinantes (blancas)

Librería de DNA Una colección de los fragmentos derivados delgenoma de un organismo determinado insertado, uno por uno, en unvector de clonación.Rotura del DNA purificado del vector con una enzima derestricción.DNA genómico a clonar se reduce a fragmentos de tamañoapropiado por una enzima de restricción (la misma que elvector).Separación de fragmentos (centrifugación isopícnica)Mezcla de fragmentos con el vector linearizado y ligación.Transformación de células bacterianas o empaquetamientoen partículas de fago.Resultado gran población de bacteria o fagos, siendo cadauno de ellos portador de una molécula de DNA diferente.Librería genómica Prácticamente todo el DNA genómicoestará representado en la librería.Librería de cDNA Librería de DNA más especializada, sóloincluye aquellos genes que están siendo expresados en un organismodeterminado e incluso ciertos tejidos o células.Se extrae mRNA total del organismoSe produce DNA complementario (cDNA) mediante latranscriptasa inversa.Los fragmentos de doble hebra se insertan en un vectoradecuado y se clonan.

Librería de cDNAEl mRNA molde se hibrida a uncebador (oligo dT) sintéticoLa transcriptasa inversa y los dNTPproducen la cadena complementariaSe degrada el mRNAcon álcaliDNA polimerasa I y dNTPdan DNA de doble cadena

Identificación de un clon con el fragmento de DNA deseadoPlaca de agar con colonias debacterias transformadasSe presiona con un papelde nitrocelulosa sobre laplaca de agarPapel de nitrocelulosaEl tratamiento con álcali rompe lascélulas y expone el DNAdesnaturalizadoca de agarDNA unido al papelSonda de DNA marcada radiactivamenteIncubación del papel con la sondaradiactiva y posterior lavadoSonda hibridada con lascolonias de interésExposicióndel papel ala películade rayos X

Amplificación de una secuencia de DNA específicaReacción en cadena de la polimerasa (PCR)Cebadores: Síntesis de dos oligonucleótidoscomplementarios a una una secuencia corta de una cadenadel segmento de DNA deseado.Desnaturalización del segmento deseado separaciónde las dos cadenas por calentamiento (95ºC)Enfriar, añadir los cebadores hibridanAñadir DNA polimerasa resistente al calor TaqIAñadir los cuatro desoxinucleótidos trifosfatosreplicación selectiva del segmento de DNA cebado.Repetición del proceso 25 o 30 ciclos amplificacióndel segmento.Suficientemente sensible para detectar incluso una única moléculade DNA de casi cualquier muestra.Clonar fragmentos de DNA de momiasRestos de animales extinguidos como el mamut lanudoHerramienta en la medicina forenseDetección de infecciones víricas antes de que causensíntomasDiagnóstico prenatal de enfermedades genética

Amplificación de un fragmento de DNA mediante PCRRegión de DNA aamplificarCalentar para separar las cadenasEnfriar, añadir los cebadoresoligonucleótidos sintéticosAñadir la DNA polimerasatermoestable para catalizar lasíntesis de DNA en dirección 5’3’Repetir los pasos y La síntesis de DNA (paso ) estácatalizasa por la polimerasatermoestable (todavía presente)Repetir desde lospasos a Después de 25 ciclos la secuencia dianase ha amplificado una 10 6 veces

Nueva arma para la medicina forenseTradicionalmente toma de huellas dactilaresAhora Huella dactilar del DNA o registro o perfil del DNAPolimorfismo de secuencias pequeñas diferencias secuencialesque se da entre individuos una vez cada pocos cientos de pares debases de promedio.Polimorfismo en el tamaño de los fragmentos de restricción oRFLPAlgunos cambios de secuencias afectan a dianas derestricció n originan diferencias en los tamaños de ciertosfragmentos de DNA digeridos con un enzima de restricción, enindividuos distintos.Detección de RFLP por Southern blottingLas secuencias de DNA genómico usadas en este test sonregiones que contienen DNA repetitivo, comunes en los genomasde eucariotas.El número de unidades de repetición varía de un individuo a otro(excepto en gemelos idénticos)Usando una sonda apropiada bandas distintas para cadaindividuo ensayado. Usando varias sondas test selectivo,pudiendo indentificar un individuo entre toda una población.Necesita muestra fresca de DNA y mayor cantidad de DNA delque hay en la escena del crimen.Aumentar la sensibilidad acoplado a la PCR.Huellas dactilares de DNA de:Un peloPequeña muestra de semenMuestras de un mes e incluso añosUtilidad en construir pruebas decisivas en tribunales de todo elmundo

Método dde transferencia Southern aplicado a ladeterminación de la huella dactilar de DNADNA cromosómico(p.ej. sospechoso 1)Rotura con endonucleasasde restricciónFragmentos de DNASeparación de los fragmentos porelectroforesis en gel de agarosa(sin marcar)Sonda marcadaradiactivamenteDesnaturalizar elDNA y transferira papel denitrocelulosaIncubar con lasonda y posteriorlavadoExponer el papela una película derayos X

Productos de la tecnología del DNA recombinanteExpresión de los genes clonadosAlteración de los genes clonados Mutagénesis dirigidaClonación en plantas mediadas por parásito bacterianoClonación en células animales Terapia génicaImplicaciones de esta tecnologíaExpresión de los genes clonados:Fin de clonar un gen es obtener su producto.Proteínas de gran interés para propósitos comerciales,terapéuticos e investigación.Vectores de expresión Vectores de clonación que contienenlas señales de transcripción y transducción necesarias pararegular la expresión de un gen clonado.Mutagénesis dirigida:Alterando la secuencia de DNA de un gen clonado codificantepara una proteína se puede cambiar la estructura de la misma.Utilizado para investigación de estructura (plegamiento) yfunción de proteínas.Uso comercial fabricar proteínas con actividad incrementadao con funcionalidad en ambientes extremos de alta temperatura,disolventes orgánico o pH extremos.Clonación en plantas mediada por parásitos bacterianos:Enorme potencial en agricultura cosechas más productivas yabundantes, resistentes a plagas de insectos, enfermedades, fríoy sequía.Las plantas fértiles de algunas especies se generan a partir deuna única célula transformada el gen introducido se transfierea generaciones sucesivasDificultad No se ha encontrado un plásmido natural enplantasAgrobacterium tumefaciens bacteria que invade a la plantapor las heridas

Productos de la tecnología del DNA recombinanteClonación en células animales Terapia génicaTransformación de células animales importancia para elavance del conocimiento estructura y función genoma animales,generación de animales con caracteres nuevos.Necesita una fuente de células individuales cultivo celular.Métodos para introducir DNA en una célula animal:Asimilación espontáneaPrecipitación del DNA concloruro de calcio o electroporación (convertir las célulastransitoriamente permeable al DNA por exposición abreves pulsos de voltaje.MicroinyecciónInyección directa del DNA en el núcleode la célula con ayuda de una aguja muy fina.Vectores víricos Virus eucarióticos modificadosintegran a veces su DNA en el cromosoma de la célulahuésped.Problemática:Inserción del DNA foráneo en el cromosoma en localizacionesal azar.Integración perjudiciales debido a que se producen en genesesenciales, rompiendo su mensaje.La expresión de un gen integrado depende de la posición deintegración La transcripción no es igual de efectiva encualquier lugar del genoma.El tipo de célula a transformar:Líneas germinales La alteración se propaga sucesivasgeneracionesCélulas somáticas La alteración afectará únicamente alanimal tratado.Animales transgénicos Cuando una transformación eficiente, conintegración cromosómica, mediante microinyección de DNA se realizaen el núcleo de huevos de ratón fertilizados.

Clonación en células de mamífero con vectores retrovíricosGenoma retroviral (RNA monohebra)La transcriptasa inversa convierteel genoma de RNA en DNA de doblecadenaLos genes víricos se reemplazan porun gen foráneoEl DNA recombinante se introduceen cultivos celularesLas copias de RNA de virusrecombinantes se producen enlas células que contienen unvirus coadyudante y seempaquetan en partículasvíricasEl genoma retrovírico con elgen foráneo se integra en elcromosoma de la célula dianaLas partículas víricasrecombinantes infectan unacélula diana

Productos de la tecnología del DNA recombinantePlanta de tabaco que expresa elgen de la luciferasa de luciérnagaPlantas de tomate manipuladasgenéticamente para serresistentes a algunas larvas deinsectosClonación en ratones. Ratón que sele ha introducido el gen de lahormona de crecimiento humana

Productos de la tecnología del DNA recombinanteImplicaciones de esta tecnología