el suicidio y la muerte celular - Real Academia de Ciencias Exactas ...

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Mª Antonia Lizarbe Iracheta
Figura 12. Cuerpos apoptóticos y degradación en escalera del
DNA cromosómico. (A) En la micrografía obtenida de células
apoptóticas teñidas con DAPI se pueden apreciar núcleos con
un aspecto normal así como los cuerpos apoptóticos o residuos
de células que han muerto por apoptosis. (B) La degradación
del DNA cromosómico en las células apoptóticas tiene
lugar preferentemente en las regiones internucleosomales, lo
que genera fragmentos de DNA de aproximadamente 200
pares de bases o múltiplos de estos. Por este motivo, el análisis
electroforético del DNA procedente de células apoptóticas
suele presentar un bandeado en escalera característico y que es
muy diferente de la degradación al azar que se observa en
células necróticas.
permiten distinguir in vitro a una célula necrótica (que
será positiva para PI), una en apoptosis temprana
(positiva para NA, negativa para PI) o en apoptosis
tardía (PI positiva pero con el núcleo fragmentado). La
apoptosis tardía se conoce también como necrosis
secundaria, y se detecta en los experimentos in vitro
con células en cultivo ya que no está presente el
sistema de eliminación de cuerpos apoptóticos.
La fragmentación nucleosomal del DNA genómico
[42] se puede determinar por diferentes métodos,
algunos de los cuales se apuntan a continuación. El
análisis electroforético del DNA genómico mediante
Rev.R.Acad.Cienc.Exact.Fís.Nat. (Esp), 2007; 101
electroforesis en geles de agarosa al 2% permite la
obtención de los clásicos perfiles de “escalera de
DNA” (DNA ladder), que corresponden a la fragmentación
internucleosomal producida por endonucleasas
a intervalos de 180-200 pares de bases (Figura
12B). El ensayo de TUNEL (Terminal deoxynucleotidyl
transferase-dUTP Nick End Labeling) es uno
de los tests in situ basado en la unión específica de la
desoxinucleotidil transferasa terminal a los extremos
3´OH de los fragmentos de DNA e incorporación a
dicho extremo de dUTP marcado. También, mediante
citometría de flujo se puede analizar la fragmentación
del DNA utilizando anticuerpos que detectan las rupturas
internucleosomales, o por ELISA (Enzyme-
Linked Immunosorbent assay) valorar las histonas
asociadas a los fragmentos de DNA.
La valoración de la activación de caspasas se puede
llevar a cabo por métodos muy variados [113]. La
aproximación más directa es la realización de ensayos
de actividad con sustratos fluorescentes específicos
para cada tipo de caspasa. De forma complementaria a
estos ensayos, se puede determinar si se ha producido
la activación de caspasas mediante Western blot analizando
si ciertos sustratos específicos se han procesado
proteolíticamente (por ejemplo, PARP-1, topoisomerasa
I, citoqueratina-18 o laminas A y C). También
se puede evaluar si las propias caspasas han sufrido
este proceso de activación proteolítica requerido para
la formación de las subunidades que conforman la
enzima activa. La detección de la activación de
algunas caspasas también se puede realizar mediante
inmunofluorescencia o citometría de flujo empleando
anticuerpos que reconocen exclusivamente la conformación
activa de las mismas. Estos anticuerpos, al ser
sensibles a conformación, no pueden ser empleados en
Western blot. Por último, se pueden utilizar también
marcajes de afinidad específicos para el centro activo
de algunas caspasas. Estos análogos de sustrato contienen
un grupo inhibidor y otro que permite la
detección (por ejemplo, biotina, fluoresceína o 2,4dinitrofenol)
bien en células (inmunofluorescencia o
citometría de flujo) o tras transferencia a membranas.
Existen métodos adicionales para la detección de
apoptosis que permiten la valoración de mediadores
específicos en la membrana plasmática (como los distintos
receptores de muerte o la ceramida), la disfunción
mitocondrial asociada a una disminución en el